专利名称：一种免疫唤醒微系统及其制备方法和应用的制作方法
一种免疫唤醒微系统及其制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种包括细胞和免疫微粒体的免疫唤醒
微系统及其制备方法和应用。背景技术：
骨髓移植(BMT)可以产生强大的移植物抗癌反应(GVT)，是目前唯一能治愈血液 癌症和其他实体瘤的方法。BMT的应用巳有三十多年历史，但是抗癌机理长期以来并不清 楚。BMT治疗癌症的方法，首先是用高剂量的放射线和化学药物破坏病人的骨髓免疫系统， 然后通过骨髓配型，移植供体的骨髓。目前已知，这种BMT "重建免疫系统"的方法，实质上 是一种极为有效的抗癌免疫反应，GVT能持续地清除癌细胞，直至最后一个癌细胞消失。
但是，BMT也存在着严重的副作用，称为移植物抗宿主反应(GVH)。供体移植物(骨 髓)的T细胞会攻击宿主正常细胞上的抗原，造成病人多发性靶器官的损害，这种损害常常 是致死性的。近年来，BMT抗癌机理的研究有了突破，发现GVT是一种免疫反应，由供体骨 髓诱生的异体免疫反应。而且，这种反应是供体T细胞介导的，如果排空T细胞，就同时丧 失GVH和GVT。近年来更进一步发现GVH和GVT二种反应是同一个机理、捆绑在一起的异体 免疫反应。在临床和动物实验中还发现，成功的BMT治疗能够重建嵌合型免疫系统，会产生 宿主排斥移植物的反应(HVG)。虽然HVG使移植物被排斥，却同时产生了宿主排斥癌细胞的 反应(HVT)，与GVT —样产生I型抗癌免疫反应，持续性清除癌细胞的。实质上，GVH/GVT和 HVG/HVT是二对相同的异体排斥反应，但是，HVG只针对移植物的异体细胞，使其受到排斥， 并不攻击宿主自身组织而造成伤害。 近年来更进一步发现异体免疫反应不是唯一的，BMT使免疫杀伤细胞CTL得到起 动和加强。BMT之所以有强大的抗癌效应是由于异体免疫反应诱生了 I型抗癌免疫反应，I 型免疫反应的形成又有赖于GVH。因为在产生GVH的条件下，GVH诱发了大量的I型淋巴因 子的分泌，包括IFN-y、 GM-CSF、 TNF-a等，抑制了癌症病人II型免疫环境。原因是病人 的癌细胞会不断自发产生II型细胞因子和癌细胞抑制性因子(例如IL-10，TGFP I)，尤其 是在高水平癌抗原存在的条件下，在正常抗癌反应中起主要作用的Thl细胞处于选择性耐 受状态，使TH1/TH2免疫内环境失去平衡，TH2免疫环境占优势，造成免疫杀伤性细胞的"休 眠"。这是癌细胞逃避免疫系统攻击的主要机制，称"免疫逃逸"，这也是很多过去临床上使 用过继免疫疗效不佳的主要原因。实际上，癌症病人的免疫功能并非完全低下，免疫杀伤性 细胞并未丧失功能，而是处于"休眠"、"无能"状态，这种状态是可以逆转的。BMT的异体免 疫反应最终使免疫系统I型抗癌反应得到恢复，使免疫杀伤性细胞CTL，自然杀伤性细胞NK 得到复苏。 目前，骨髓移植在临床上，通常使用异体BMT，由HLA相近匹配的供者提供骨髓。 由于匹配的骨髓来源有限，治疗设施要求高，治疗费用昂贵，限制了 BMT在临床上的广泛使 用。
发明内容
本发明的目的是，提供一种免疫唤醒微系统。 本发明的再一的目的是，提供一种免疫唤醒微系统的制备方法。 本发明的再一的目的是，提供一种免疫唤醒微系统的应用。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种免疫唤醒微系统，包括细胞和免疫微粒体，细胞和免疫微粒体通过抗体_抗原交联成免疫唤醒微系统整体结构，所述的细胞是具有CD40L表达的CD4+T细胞，免疫微粒体是可生物降解材料包载重组rIL_2的微粒体。 所述的免疫微粒体是表面吸附了抗Fc单克隆抗体的微粒体。所述的免疫唤醒微系统是HLA错配的异体CD4+T细胞吸附了 mAb-CD3/mAb-CD28
与表面吸附了抗Fc单克隆抗体的微粒体交联而成。 所述的可生物降解材料选自乳酸聚乙二醇(PLG)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯
(PCL)、聚乳酸二乙醇酸共聚物(PLGA)中的一种。 所述的细胞数和免疫微粒体数的比例为1 : 10。 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种免疫唤醒微系统的制备方法，包括以下步骤 A、免疫微粒体的制备将可生物降解材料的悬浮溶液中加入含抗Fc单克隆抗体缓冲溶液中，将含rlL-2微球加入到上述溶液中； B、CD4+细胞体外活化纯化的CD4+细胞溶液中加入mAb_CD3和mAb_CD28单克隆抗体在无血清培养基中培养； C、免疫微粒体与CD4+细胞交联将步骤A制备得到的免疫微粒体与步骤B体外活化的CD4+细胞混合； D、将步骤C制得的混合液培养、扩增、液氮保存。 所述步骤C中免疫微粒体与CD4+细胞交联数的比例为1 : 10。 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是 —种免疫唤醒微系统在制备治疗实体瘤和血液癌症药物中的应用，所述的免疫唤醒微系统包括细胞和免疫微粒体，细胞和免疫微粒体通过抗体_抗原交联成免疫唤醒微系统整体结构，所述的细胞是具有CD40L表达的CD4+T细胞，免疫微粒体是可生物降解材料包载重组rlL-2的微粒体。 所述的免疫微粒体是表面吸附了抗Fc单克隆抗体的微粒体，所述的细胞是HLA错配的异体休止期CD4+T细胞。所述的免疫唤醒微系统是HLA错配的异体CD4+T细胞吸附了 mAb-CD3/mAb_CD28与表面吸附了抗Fc单克隆抗体的微粒体交联而成。
本发明优点在于 1、本发明首次模拟BMT产生GVT的机理，构建以异体免疫活性T细胞为基础的"免疫唤醒"微系统("ImmunoWakeUp"Micro System, MS)，产生与BMT相同的异体免疫反应和I型抗癌效应，以"免疫唤醒"(ImmunoWakeUp)新机制，唤醒处于"休眠状态"的免疫杀伤性细胞。本发明不需要骨髓，不需要HLA配型，避开了骨髓移植带来的GVH的风险和严重的副作用，使之能广泛用于白血病和许多其他癌症的病人。
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2、本发明以"免疫唤醒"(ImmunoWakeUp)命名的模拟BMT的技术方案具有以下两 个主要的作用第一，用人工方法构建的免疫微系统能起动异体免疫反应HVG/HVT，能诱生 大量的I型细胞因子，逆转体内Thl/Th2不正常的免疫状态，克服免疫耐受；第二，用人工方 法构建的免疫微系统能激活体内自身的免疫系统，建立I型抗癌免疫反应，加强抗原递呈 和识别的功能，唤醒处于休眠的免疫杀伤性细胞，提高免疫杀伤功能。
图1 :IMS显微镜下实例^04+-
图2 :CD45RA+细胞活化后CD40L表达动态图CD4+细胞用CD45RA-mAb_FITC和生 物素-CD40L-mAb标记和PE染色，用FACScalibur细胞流式仪(Becton Dickinson)作0-24 小时动态分析，结果以平均萤光密度(MFI)阳性染色细胞百分数表示。图中显示CD40L表 达自1. 0h开始，8-12h到达顶峰，延续24h以上。 图3 :休止期CD4+T细胞活化后，1_6天培养基上清液中游离的IFN-y生成量 用ELISA方法测定，单位pg/ml。图例中Cell Only为未活化细胞对照；mAbCD3/mAbCD28 是CD4+T细胞与CD3/CD28单克隆抗体交联后1-6天培养基上清中IFN- y生成量；MS是 CD4+T细胞与免疫微粒体交联的整体微系统在培养基中1-6天IFN-y生成量。
图4 :C57BL/6小鼠实体瘤0VA模型接受二次Balb/c小鼠脾淋巴细胞制备的MS注 射，在MS第二次注射三天后用标准6小时Cr51释放方法测定淋巴细胞毒效应。图中E/T Ratio效耙比例分别为200 : 1、100 : 1、50 : 1。图例中Control为正常小鼠；Cell Only 为单独用CD4+-CD40L细胞治疗；IMS为IMS治疗组。 图5 :Balb/c小鼠B细胞白血病模型接受二次C57BL/6小鼠脾淋巴细胞制备的IMS 注射，在MS第二次注射三天后用标准6小时Cr51释放方法测定淋巴细胞毒效应。图中 E/T Ratio效耙比例分别为200 : 1、100 : 1、50 : 1。图例中Control为正常小鼠；Cell Only为单独用CD4+-CD40L细胞治疗；IMS为IMS治疗组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的一种免疫唤醒微系统及其制备方法和应用的具体
实施方式做详细说明。
实施例1 —种免疫唤醒微系统的制备方法
—、免疫微粒体的制备
1、包载微粒体的制备 乳酸聚乙 二 醇(PLG poly (D， L-lactide-co-glycolide)) ， RG503 Boehringerlngelheim Mr2400050 : 50 (w/w) ， 6% w/v，加入牛血清白蛋白(RIA级Sigma) 含1 % ，和预溶于缓冲液的rIL-2 (Roche)加入二氯甲烷，中速搅拌成乳状液(w/o)，迅速加 入乳化剂聚乙烯醇10% PVAw/v，冰浴中高速搅拌30分钟成乳状液(w/o/w)，室温下低速 搅拌过夜，将有机溶剂蒸发。微球固化后离心收集，双蒸水洗涤三次，真空干燥，收率大于70%。微球经超声波分散于蒸馏水中，取一滴置于载玻片上，用粒径分布仪测定其粒径。
2、微粒体表面蛋白吸附 含10mg PLG包载微粒体的悬浮溶液中加入含0. lmg抗Fc单克隆抗体1ml缓冲溶 液，在4t:低速振摇过夜。混悬液中加入稳定剂(甘露醇和蔗糖)后冻干备用。
3、rlL-2试管内释放 取50ul(约含106rIL-2包载微粒体)加入到渗透膜套管中，套管两端封闭后浸 没于5ml双蒸水中于37t:恒温振荡器中振荡释放。每天收集双蒸水样品5ml，用淋巴因子 Elisa检测药盒(R&D System)，测定其中rlL-2含量，并加入5ml新鲜双蒸水，为下一天 的样品。 二、细胞的制备在GMP无菌密闭条件下制备 1、浓縮白细胞(PBMC血液灰白色分层)由中心血站提供，不需要HLA配型。用无 Ca++Mg++Hack' s溶液离心清洗二次，收率大于80% 。 2、白细胞应用Dynal beads磁珠正性选择白细胞首先使用抗_CD4-Biotin单克 隆抗体包被，包被的细胞为Biotin包被的磁珠结合，然后应用磁性滤器吸附磁珠，CD4+细 胞得到分离。保持整个过程在密闭无菌环境中进行。该过程中，大约6X1(T白细胞可分离 5X109的CD4+细胞。 3、细胞标记分析CD4+细胞主要是(> 70% )休止期细胞(表面标志CD4+， CD45RA+， CD62LH1)和小部分记忆细胞(< 30% )(表面标志CD4+， CD45R0+， CD62L10)。
4、 CD4+细胞体外活化过程纯化的CD4+细胞通过mAb-CD3/mAb-CD28交联活化。 该过程用107ml细胞10ml，加入mAb-CD3和mAb-CD28单克隆抗体各10ug/ml，在无血清培 养基中，4t:摇动30分钟，然后清洗细胞除去残余的抗体，重新调正细胞至107在无血清培 养基中培养。 三、制备得到免疫唤醒微系统 1、交联过程使用预先用抗Fc单克隆抗体包被的微粒体，与mAb-CD3/mAb-CD28结 合的细胞混合，1个细胞1-2个微粒的比例，4t:培养30分钟。 2、细胞培养细胞浓度重新调正为107ml细胞100ml，在C02培养箱中，37t:静止 培养二天，不摇动。 3、第三天再次加入mAb-CD3和mAb-CD28单克隆抗体各10ug/ml，和微粒体，1个细 胞l-2个微粒的比例，37t:静止培养过夜，不摇动。 4、细胞能从起始107100ml扩增到109，以108分装，以冻存培养基保持细胞存活并 具活性，液氮保存。细胞在使用前24小时解冻复苏。 5、活化的CD4+细胞通过单克隆抗体和交联的免疫微粒体的IMS形式进行静脉输 注，或皮内注射。输注溶液可以是生理盐水或5%葡聚糖，加入1_2%人血清白蛋白。细胞 输注的最终浓度为107-108/ml。输注速度可选择50-100ml/小时。 6、输注的细胞应表达IFN Y ， CD40L， IL_2， IL-15, FasL， TNF-a ， TNF-P 。输注的 细胞不应表达CTLA-4， IL4， ILIO， TGF-P 。淋巴因子用表达标记标准药盒测定。
实施例2 用MS治疗实体瘤和白血病动物模型试验 —、在小鼠OVA肿瘤实验中，6-10周龄小鼠C57BL/6用作宿主受体，Balb/c用作供体CD4+细胞制备IMS。 OVA表达的EG-7细胞106分别皮内注入C57BL/6小鼠，五天后瘤体 达5-7mm开始治疗。在B细胞白血病实验中，6_10周龄小鼠Balb/c用作宿主受体，C57BL/6 用作供体CD4+细胞制备IMS。 BCL2细胞10E6注入Balb/c小鼠体内， 一周后脾脏扩大至原 来二倍，并见有外周血淋巴细胞破坏与溶介开始治疗。供体CD4+细胞由脾细胞分离、活化 和交联免疫微粒体，按实施例1步骤制备IMS。 二、存活率一周后静脉内注入10E5的IMS，二周后再次皮内注入10E5的IMS，生 理盐水作对照组。90天后检查存活率。 三、杀伤性细胞功能在第二次MS注射后第5天，效应细胞由DLN淋巴结采集，靶 细胞为相应小鼠瘤模型细胞株，Cr51标记，测定CTL杀伤性细胞功能。方法按标准6小时 Cr51释放测定，按标准公式计算。 四、免疫斑点试验测定IFNy表达细胞在第二次MS注射后第5天，治疗后瘤模 型小鼠脾细胞和治疗前瘤模型小鼠脾细胞105细胞测定IFN-y表达细胞按ELISPOT药盒 (R&D System)方法测定，特异性斑点形成细胞(SFC)计数。
五、原理和结果
1、IMS的细胞 在先前对异体休止期CD4+T细胞受体结构、生命周期和激活过程的研究工作基础 上，本发明頂3含有的细胞使用了在体外短期活化的异体004+-
另一方面，由于CD40L和IFN- y是形成宿主DC成熟的二个信号，CD4+-CD40L细 胞剌激了宿主DC的成熟。成熟的DC(DC1)可以产生大量的IL-12，二者进一步起动宿主自 身的I型抗肿瘤HVT反应。现在知道，IL-12在激活I型抗癌免疫反应中起了关键的作用。 IL-12不仅能促进休止期CD4+T细胞分化成IFN- y分泌的Thl细胞，同样也能增强CD8+CTL 介导的溶细胞作用和自然杀伤性细胞的活性，同时也抑制CD4+CD25+调节T细胞(Treg)的 作用(32)。临床研究发现DC1和IL-12水平的增强直接关联到癌症无复发的生存状态。
上述由CD40L表达的CD4+T细胞起动的异体免疫反应和I型抗癌反应的建立与异 体BMT的HVG/HVT机理是一致的。
2、 MS的免疫微粒体 现有的一些免疫疗法和细胞治疗常常在细胞进入体内后，由于体液改变了过继细 胞在体内生长的环境，造成细胞功能的改变，失去了预期的效果。因此，本发明除了应用 异体免疫细胞起动异体免疫反应和I型抗癌连锁反应外，模拟BMT的策略还必须在异体 CD4+-CD40L表达细胞进入体内后，能保持细胞的功能状态，而且在细胞被HVG排斥后仍能 进一步维持活化状态和增强I型抗癌免疫反应。本发明制备了一种含有重组IL-2(rlL-2) 免疫微粒体用于交联活化的004+-00401^表达细胞。免疫微粒体使用可生物降解的乳酸聚 乙二醇(poly-DL-lactide-co-glycolide，PLG)多聚体材料包载了 rIL_2核心材料，具有缓 慢释放核心材料到细胞微环境的功能。而且在微粒体表面吸附了抗Fc单克隆抗体用于交 联细胞。可降价PLG多聚体材料有很好的生物相容性，可以生物降价成单体，可降价材料在 10-15天内完全降价，安全稳定，已由FDA批准用于人体。 免疫微粒体包载了 rIL-2，形成5_15微米的微粒体，这种微粒体可以缓慢释放 rlL-2，根据不同实验条件可以持续释放5-10天，保留75%以上的IL_2活性。免疫微粒体 表面吸附了抗Fc单克隆抗体。因此，这种微粒体在体内能保持核心材料的持续释放，并保 持表面吸附抗Fc单克隆抗体的交联活性。当抗Fc与CD4+T细胞结合的mAbCD3/mAbCD28交 联后，48h后形成具有CD40L和IFN-y表达的细胞，形成MS整体结构(图1)。由活化的 CD40L表达的CD4+细胞与包载了 rIL-2免疫微粒体构建而成的IMS，在进入体内后，rIL_2 能在细胞的近距离释放。这种情况与细胞悬浮在含有rlL-2培养液中的情况完全不同，细 胞能在体内高度扩增，并达到高度的活化状态和功能状态。由于CD40L早期的表达需要 CD28信号，而后期CD40L的表达需要IL_2的环境，所以rIL_2使活化的CD4+T细胞有持续 的CD40L表达，并且提高INF- y的分泌。这种MS的组分和构建方法对模拟BMT起动HVG/ HVT非常重要。 TCR信号(抗CD3)单独并不足以诱导休止CD4+T细胞增殖和IL_2的分泌，同时加 入来自APC的协助剌激因子或抗CD28可导致有效的活化，而且固定在固相上的mAb-CD3/ mAb-CD28单克隆抗体能更有效地传递活化信号进入细胞(36)。因此，本发明首先用 mAb-CD3/mAb-CD28单克隆抗体在培养基中共激活CD4+T细胞，然后与包载了 rIL_2的可降 价多聚体微粒通过表面吸附的抗Fc单克隆抗体交联。IMS的这种构建，提供了 CD4+T细胞 固相激活的条件，加强了细胞增殖和活化，加快淋巴因子的表达和持续分泌。IMS形成后， CD40L在2小时表达开始，6小时达到高峰(图2) 。 IFN y在4小时后开始产生表达，体外 3天生成量直线上升(图3)。因此，根据MS构建和特性，本发明在MS的制备上采用了 CD4+T细胞短期体外活化，体内扩增的方案。 3、 MS模拟BMT，起动了与BMT相同的HVG和HVT，其结果是癌细胞和异体免疫细 胞同时被排斥，防止了异体细胞攻击宿主的反应。 HVG反应大大有利于MS中异体免疫细胞在完成"炎性起动过程"后的迅速撤离， 从而完全避免了 GVHD的发生。IMS的异体免疫活性细胞最终导致了大量I型细胞因子的释 放，逆转了免疫抑制环境，建立了 I型抗癌免疫反应，活化了宿主的CTL前体细胞和NK等细 胞免疫，达到"免疫唤醒"清除癌细胞的作用。 本发明独特使用由可降价多聚体包载的rIL-2的微粒体与细胞交联构建IMS。这 种构建方法不仅保持活化的细胞分化成Thl亚型产生足量的IFN- y ，而且由于rIL-2从微粒体不断向细胞近距离释放，rIL-2形成的微环境使Thl细胞有后期的CD40L的表达。这 种构建使之有可能采用细胞在体外进行3天短期的活化的培养方法，与体外12-14天长期 培养不同，避免了因在体外活化和扩增长期培养带来污染的可能性和节省了人力和财力。 本发明在异体CD4+T细胞获得CD40L表达后就能以IMS的形式第一次输入体内。注入的 CD4+-CD40L表达细胞主要分布在引流淋巴结，并且扩增，活化DC，起动异体免疫反应，建立 对异体细胞的I型记忆反应。当IMS再次输入体内时，则引起回忆免疫反应和迟发性高敏 反应(DTH)，促进I型抗癌免疫反应的发展，克复"免疫耐受"使"唤醒"的免疫细胞重新识 别癌抗原。整个免疫进程较快，笫二次頂S输入后五天用免疫斑点试验(EliSpot)就能检 测到体内淋巴细胞IFN-y表达细胞数量上升(表1)，说明I型回忆反应产生的主要效应， 並导致I型抗癌免疫反应的发展，使免疫细胞的杀伤效应大大加强(图4，5)。最终使荷瘤 动物生存率提高(表2)。 表1.小鼠OVA和小鼠B细胞白血病模型在MS第二次注射5天后，用免疫斑点试
验测定IFNy表达细胞，每组5只小鼠，结果为特异性斑点形成细胞(SFC)计数。
IFN y spot—forming cellsOVABCL2
BeforeTreatment13±514±6
AfterTreatment86 ±2867±14 表2.小鼠OVA和小鼠B细胞白血病模型接受二次MS注射，用MS治疗后90天，
每组10只小鼠的存活数。
I. V. Infusion+L D.OVABCL2
NormalSaline00
Cellonly21
IMS84 近年对GVT研究结果表明，癌细胞的免疫原性同样也决定了 GVT的效率。IMS使具 有CD40L表达的细胞与宿主DC表达的CD40交联，上调"协助细胞因子"(MHCclassII， CD58， CD80/CD86)，提高了癌协助抗原的表达，促进效应细胞的杀伤癌细胞的作用。同时IMS活 化自然免疫细胞，如NK细胞和单核巨噬细胞的杀伤效应，也活化T细胞表面分子，如FasL、 TRAIL、 TWEAK和TNFR，作用于癌细胞造成细胞凋亡。活化的CD4+-CD40L细胞最终分化成 Thl细胞，产生的GM-CSF和IFN- y能上调癌细胞的腿C分子表达，促进异体免疫反应CTL 免疫细胞对癌细胞的识别。这些上调的效应分子、"协助细胞因子"和免疫细胞的杀伤效应 的变化，在本发明中视为MS在体内模拟BMT的证据，是MS细胞CD40L和宿主细胞CD40 相互作用的结果。
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本发明MS模拟BMT，以"免疫唤醒"机制产生HVT，与此同时，也具有BMT另一个重要机理，能提高癌协助抗原和MHC的表达，加强了癌细胞的免疫原性，更有利于免疫识别，加强癌细胞的清除，对防止癌症复发和提高存活率起了极为重要的作用。
4、本发明IMS独特的构建和短期体外细胞活化、体内扩增的方法，使IMS能在体内迅速起动HVG/HVT，逆转免疫微环境向Thl倾斜，唤醒免疫杀伤性细胞加强了免疫细胞的杀伤效应，使治疗后存活率提高。值得注意，这些结果同样地表现在实体瘤和血液癌症的动物模型上。因此，本发明的临床适用范围不仅能替代BMT目前在白血病等血液癌症上的应用，还可能扩大到许多实体瘤。显然，MS的应用避开了异体BMT诱发到GVHD，也避开了 BMT继发性病毒感染。同时，可以预期如果联合其他癌症治疗方法，可以提高疗效荷瘤生存和达到无复发痊愈状态。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
一种免疫唤醒微系统在制备治疗实体瘤和血液癌症药物中的应用，所述的免疫唤醒微系统包括细胞和免疫微粒体，细胞和免疫微粒体通过抗体-抗原交联成免疫唤醒微系统整体结构，所述的细胞是具有CD40L表达的CD4+T细胞，免疫微粒体是可生物降解材料包载重组rIL-2的微粒体。
2. 根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述的免疫微粒体是表面吸附了抗Fc单 克隆抗体的微粒体，所述的细胞是HLA错配的异体休止期CD4+T细胞。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的免疫唤醒微系统是HLA错配的异 体CD4+T细胞吸附了 mAb-CD3/mAb-CD28与表面吸附了抗Fc单克隆抗体的微粒体交联而 成。
4. 一种免疫唤醒微系统，包括细胞和免疫微粒体，细胞和免疫微粒体通过抗体_抗原 交联成免疫唤醒微系统整体结构，其特征在于所述的细胞是具有CD40L表达的CD4+T细 胞，免疫微粒体是可生物降解材料包载重组rlL-2的微粒体。
5. 根据权利要求4所述的免疫唤醒微系统，其特征在于所述的免疫微粒体是表面吸 附了抗Fc单克隆抗体的微粒体。
6. 根据权利要求5所述的免疫唤醒微系统，其特征在于所述的免疫唤醒微系统是HLA 错配的异体CD4+T细胞吸附了 mAb-CD3/mAb-CD28与表面吸附了抗Fc单克隆抗体的微粒体 交联而成。
7. 根据权利要求6所述的免疫唤醒微系统，其特征在于所述的可生物降解材料选自 乳酸聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸二乙醇酸共聚物中的一种。
8. 根据权利要求7所述的免疫唤醒微系统，其特征在于细胞数和免疫微粒体数的比例为i : io。
9. 一种如权利要求4所述的免疫唤醒微系统的制备方法，包括以下步骤A、 免疫微粒体的制备将可生物降解材料的悬浮溶液中加入含抗Fc单克隆抗体缓冲 溶液中，将含rlL-2微球加入到上述溶液中；B、 CD4+细胞体外活化纯化的CD4+细胞溶液中加入mAb-CD3和mAb-CD28单克隆抗体 在无血清培养基中培养；C、 免疫微粒体与CD4+细胞交联将步骤A制备得到的免疫微粒体与步骤B体外活化的 CD4+细胞混合；D、 将步骤C制得的混合液培养、扩增、液氮保存。
10. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述步骤C中免疫微粒体与CD4+细 胞交联数的比例为1 : 10。
全文摘要
本发明涉及一种免疫唤醒微系统及其制备方法和应用，该免疫唤醒微系统包括细胞和免疫微粒体，细胞和免疫微粒体通过抗体-抗原交联成免疫唤醒微系统整体结构，所述的细胞是具有CD40L表达的CD4+T细胞，免疫微粒体是可生物降解材料包载重组rIL-2的微粒体。本发明优点在于首次模拟骨髓移植(BMT)产生移植物抗癌反应(GVT)的机理，构建以异体免疫活性T细胞为基础的“免疫唤醒”微系统，产生与BMT相同的异体免疫反应和I型抗癌效应；没有骨髓配型的要求，没有移植物抗宿主的严重副作用。
文档编号A61K35/14GK101721684SQ20081020175
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者唐申北 申请人:上海威科生物技术有限公司