面向荧光pcr微系统的往复式循环单微通道装置制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种面向荧光PCR微系统的往复式循环单微通道装置，属于生物学、分析化学及医学检测领域。其特征在于：使用热性好的金属管组成PCR扩增中的三个温区；使用紫外激光固化光学胶体连接三个金属管温区；不仅有隔热作用、密封作用、支撑作用，同时还有透光特性，又可以布置微型荧光检测系统，使其成为荧光实时PCR微流控系统。本发明实质是，使用压缩空气或硅油在单微通道里往复移动，用一小段PCR试剂在三个温区里完成四十个温度循环的PCR扩增。因此简化体积和重量，节约试剂，适合在空间在轨失重环境里进行自动工作。
【专利说明】面向荧光PCR微系统的往复式循环单微通道装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种面向荧光PCR微系统的往复式循环单微通道装置，主要用于PCR微结构反应和在空间范围内应用的PCR反应实时荧光检测装置的后续搭建，属于生物学、分析化学及医学检测领域。
【背景技术】
[0002]空间飞行器内有危害微生物威胁航天员健康并腐蚀材料，急需空间在轨生物危害实时自动报警系统，其核心是微生物核酸荧光检测微系统。由于空间在轨要求设备具有全自动和微体积、小重量的技术特点。因此简化微流控荧光PCR工作系统是实现空间在轨生物危害实时自动报警系统要求的关键。
[0003]聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，由高温热变性(94°C左右)、低温退火复性(50~60°C )和适温延伸(72°C )组成一个周期，一个循环可以使DNA的基因片段总量(按2的N次方)增加，可以把至少一个特异基因片段迅速扩增，这样一来可以使用基于FRET (荧光共振能量传递技术)进行荧光实时检测，根据荧光强度以及强度相对变化的信息，可对PCR产物进行定性定量分析。PCR技术的实用性，使得其应用广泛，多用于医学应用来检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学。
[0004]目前应用PCR技术的仪器有很多，对于常见的传统微流控PCR扩增方法，其使反应中高温热变性、低温退火和室温延伸三个温区温度不变，而微通道中的PCR试剂在三个温区内不断移动，实现PCR扩增。当前市场上的微流控PCR扩增方法都是用40个微通道来实现40个PCR温度的循环。可见这样的结果与方法在扩增反应中所用的PCR扩增时间和PCR试剂用量上，都被40个微通道限制和浪费；此外由于40个微通道的温度循环结构很难构建相应一个微型加热和制冷的系统，相互循环中的不同温区相互制约甚至影响扩增反应结果；由于40个微通道结构的制约，至少是是单微通道结构的体积、重量的40倍，严重影响了微型生物芯片的集成自动化控制与微型便携化，严重限制了仪器的发展空间。
[0005]另外对于非传统的微流控PCR扩增方法，其使微通道中的PCR试剂不动，而通过高温热变性、低温退火和室温延伸三个温区温度不断改变，实现PCR扩增。由于受到当前加热和制冷技术的制约，微型加热和制冷装置有降温和升温的速度极限，这样制约了 PCR扩增的时间；此外在控制温度精度上也同样存在难度，不能保证试剂完全反应或者在温度变化中产生其他反应，造成误差。
【发明内容】
[0006]本发明涉及一种面向荧光PCR微系统的往复式循环单微通道装置，主要用于PCR微结构反应和在空间范围内应用的PCR反应实时荧光检测装置的后续搭建，目的由单微通道循环PCR反应模块、光固化胶构建微通道模组成，适合在空间在轨失重环境里进行自动工作，达到功能集成、结构缩微、 重量轻体积小全自动检测的目标。[0007]为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案:
[0008]面向荧光PCR微系统的往复式循环单微通道装置，其特征在于:
[0009]金属管的三个温区:退火低温区、延伸适温区、热变高温区通过用UV胶隔离层连接构成了整个载体的单微通道，并且金属管的退火低温区和热变高温区分别通过用UV胶隔离层连接两个微型活塞气压泵。金属管内壁通过仪器将UV胶灌入到金属管微通道当中，待UV胶填补金属管内壁细微粗糙凹槽之后，用器械将UV胶喷出，之后对于金属管微通道内壁中的残留UV胶进行紫外激光照射固化，从而形成更加光滑的内壁结构并且密封；两个金属管微通道直接的连接处的外部用UV胶密封，使得整个微通道空间内处于一个密封的环境；动力装置使用单片机来控制步进电机，并通过步进电机的转速和转角来控制微型活塞气压泵内的气压活塞的压缩与拉伸，去移动PCR试剂进行往复式循环来完成PCR扩增反应。
[0010]作为生物芯片载体的单微通道，金属管的三个温区:退火低温区3、延伸适温区4、热变高温区5通过用光固化胶隔离层2连接构成了整个载体的单微通道。其中光固化胶隔离层2通过紫外激光固化具有良好的抗药性，其主要成分的环氧树脂常被制作成医疗器件和工具，使用光固化胶制作钢管的连接结构，其透光性、可见光性，可以用于未来搭建荧光检测系统的结构布置，实现实时荧光检测系统；微金属管内壁进行紫外激光固化光固化胶处理，通过仪器将光固化胶灌入到金属管微通道当中，待光固化胶填补金属管内壁细微粗糙凹槽之后，用器械将光固化胶喷出，之后对于金属管微通道内壁表面光固化胶进行激光照射固化，使得微通道内壁全部被光固化胶包裹，从而形成更加光滑的内壁结构并且密封；两个金属管微通道直接的连接处同样用光固化胶密封，使得整个微通道空间内处于一个密封的环境，并且在连接处内部光固化胶带微通道包裹薄膜层保护，因此PCR试剂可以完整的通过隔热层并防止腐蚀材料，综上所述，在PCR试剂移动的所有范围内的微通道内壁都由光固化胶覆盖。由于光固化胶的透光性质可在未来实现突光实时PCR系统的布置；动力装置使用单片机7来控制步进电机6，并通过其的转速和转角来控制微型活塞气压泵I内的气压活塞10的压缩与拉伸，去移动PCR试剂11进行往复式循环来完成40次PCR扩增反应获得相应的生物曲线。
[0011]经过实验得出，这种面向荧光PCR微系统的往复式循环单微通道装置，其实验装置的搭建满足“功能集成结构微缩”易于便携的技术特点，并使用光固化胶固化技术改善微通道内壁的表面粗糙度，减少或避免在PCR扩增中大生物分子挂壁现象。同时提高PCR试剂再单微通道里的往复移动效率，利用步进电机控制微型气压活塞动力装置的单片机算法，使得PCR试剂可以在金属管微通道中准确移动。
[0012]装置具有“功能集成 结构微缩”的关键理念，属于现代化微流控生物芯片；体积小，便于携带，性能稳定，资源节约；具有全自动化操作特点，与单片机结合应用，适用范围广泛。此外采用量值传递的方法进行定标的方法，方便、准确，并可根据自己需求定标相应的温度点，具有自主性，准确性符合计量学标准。未来对光激发和荧光检测装置的设置不受重力要求，使得检测结果稳定，不受干扰，更适应空间工作要求。单循环微通道设计大大减少体积与资料，在给定的单位样本中可以准确的检测出相应的实验数据与生物曲线。整个系统具有较强的抗干扰能力，结构简单，稳定性强，易于移植和集成。
[0013]经过实验得出装置在运行的过程中提高了反应效率。在传统PCR反应装置中很大一部分时间里一部分PCR试剂在反应而另一部分PCR试剂却在移动下一个温区的过程中等待，降低了整体的PCR试剂的反应效率。这个时间内，试剂完全没有反应单纯的等待其他部分的试剂反应，导致反应需要几个小时。而此装置可以通过单片机对微型活塞的控制可以使PCR试剂在完成一个温区的之后马上进入下一个温区，使得PCR试剂最快速的完成整个循环，避免了在从温区到另一温区移动时所损耗的时间，提高了反应速度。
[0014]此外单微通道实现40微通道来完成40个温度循环PCR扩增，使系统体积减小、重量减轻、效率提高，满足空间在轨失重环境的技术要求，并且未见同类国内外研究报道。使用光固化胶连接三个金属管组成的PCR三个温区，其中光固化胶固化结构不仅有隔热作用、密封作用、支撑作用，同时还有透光特性，又可以布置微型荧光检测系统，使其成为荧光实时PCR微流控系统。微通道金属管的内壁进行光固化胶处理，降低单微通道内壁表面粗糙度，减少或避免在PCR扩增中PCR试剂分子悬挂在微通道金属内壁的现象，从而提高PCR反应效率，更加准确的表现生物特征。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为微流控往复式循环单微通道PCR扩增装置总结构图
[0016]图2为微流控往复式循环单微通道PCR扩增装置工作示意图
[0017]图中:1微型活塞气压泵；2光固化胶隔离层；3退火低温区；4延伸适温区；5热变高温区；6步进电机；7单片机；10气压活塞；11 PCR试剂。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图1~2详细说明本实施例:
[0019]本发明的装置总结构图如图1所示并且装置的工作示意图如图2所示，其中主要利用PCR试剂在空气或硅油中不相溶的原理，设计一个单循环结构模块来实现试剂的多温区循环连续反应。利用一个金属管微通道为装置的主体，将金属管微通道内注满了硅油，之后把PCR试剂11加入当中；由于试剂不与硅油相溶，在环形微通道当中会出现一个PCR试剂段，并把金属管微通道分成三个不同温区:退火低温区3、延伸适温区4、热变高温区5，通过动力装置来完成PCR试剂段在微通道中三个温区的40次循环工作任务。
[0020]其中动力装置是由两个微型气压活塞泵I构成的。通过单片机7控制步进电机6来控制活塞对微通道压缩硅油或者抽出硅油。两个微型活塞工作原理如图2是:两个活塞分别左右放置，一个压缩微通道内硅油时另一个抽出微通道硅油，来实现PCR试剂在整个微通道中移动的目的。
[0021]微金属管内壁进行紫外激光固化光固化胶处理。通过仪器将光固化胶灌入到金属管微通道当中，待光固化胶填补金属管内壁细微粗糙凹槽之后，用器械将光固化胶喷出，之后对于金属管微通道内壁中的残留光固化胶进行紫外激光照射固化，从而形成更加光滑的内壁结构并且密封。并且在两个微通道直接的连接处，同样用光固化胶密封，使得整个微通道空间内处于一个密封的环境，并且在连接处内部光固化胶带微通道包裹薄膜层保护。因此PCR试剂可以完整的通过隔热层并防止腐蚀材料。
【权利要求】
1.面向荧光PCR微系统的往复式循环单微通道装置，其特征在于:
金属管的三个温区:退火低温区、延伸适温区、热变高温区通过用UV胶隔离层连接构成了整个载体的单微通道，并且金属管的退火低温区和热变高温区分别通过用UV胶隔离层连接两个微型活塞气压泵。金属管内壁通过仪器将UV胶灌入到金属管微通道当中，待UV胶填补金属管内壁细微粗糙凹槽之后，用器械将UV胶喷出，之后对于金属管微通道内壁中的残留UV胶进行紫外激光照射固化，从而形成更加光滑的内壁结构并且密封；两个金属管微通道直接的连接处的外部用UV胶密封，使得整个微通道空间内处于一个密封的环境；动力装置使用单片机来控制步进电机，并通过步进电机的转速和转角来控制微型活塞气压泵内的气压活塞的压缩与拉伸，去移动PCR试剂进行往复式循环来完成PCR扩增反应。
【文档编号】C12M1/34GK103614290SQ201310557872
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】吴坚, 于伦, 王富吉, 陈涛, 郑杨 申请人:北京工业大学