通过抑制Gpr12治疗认知障碍的方法

专利名称：：通过抑制Gpr12治疗认知障碍的方法
技术领域：
：本发明涉及通过抑制Gprl2基因或者基因产物治疗认知障碍的方法。
背景技术：
：许多生物体包括人具有对过去事件记忆的属性。对这个属性已经进行几十年的研究，目前可以利用更多的信息解释其许多其支派。例如，已经鉴别了两种基本类型的记忆转录非依赖性记忆，其包括短期记忆；以及转录依赖性记忆，其包括长期记忆。Gpr12是一种孤儿(orphan)GPCR。通过原位杂交分析Gprl2表达表明Gprl2在小鼠CNS中广泛表达，在海马和丘脑中具有最高水平的表达(Ignatovetal.2003,J.Neurosci.23=907-914)。Gprl2的内源配体还未知。Gprl2的种系发生分析表明孤儿受体Gpr3和Gpr6与Gprl2同源性最近。包含三个孤儿GPCR的亚组与GPCR的Mcr(黑皮质素样肽)和Edg(内皮分化)家族最密切相关。这表明脂质或肽可能是Gprl2的配体。鞘氨醇基磷酸胆碱(SPC)在异源表达系统中激活Gprl2。SPC促进培养的胚胎皮质神经元分化和成熟(出处同上)。然而，Gpr12的内源配体及其在成人CNS的体内功能还未知。先前结果示出Gprl2通过Gai依赖性机制发出信号(出处同上)。在哺乳动物脑中cAMP/PKA途径调节CREB活性和长期记忆(Abeletal.，1997，Cell88:615_626)、(Bourtchouladzeetal,1998.LearnMem.5365-374)>(Baradetal.,1998.Proc.Natl.Acad.SciUSA9515020-15025)、(Bourtchouladzeetat.,2003,Proc.NatlAcad.SdUSA10010518-10522)。发明概述已经揭示g_偶联蛋白受体Gprl2在介导哺乳动物记忆形成的细胞事件中起重要作用。如本文所述，海马内Gprl2介导的mRNA运输在哺乳动物情景长期记忆形成中是重要的。已经揭示海马Gprl2功能的破坏或抑制增强哺乳动物转录依赖性记忆形成(如长期记忆形成)。本申请涉及例如通过抑制Gprl2基因或基因产物治疗长期记忆缺陷或者认知障碍的方法。本发明提供了调节哺乳动物认知功能的方法。本发明的一个实施方案涉及一种方法，该方法包括给予哺乳动物施用有效量的调节哺乳动物中Gprl2活性的药剂。在另一实施方案中，所述哺乳动物是成年哺乳动物。在另一实施方案中所述哺乳动物是人。在另一实施方案中，所述施用导致长期记忆形成调节。在另一实施方案中长期记忆形成被增强。在另一实施方案中，所述方法进一步包括检测长期记忆形成中的调节作用。在另一实施方案中，所述调节作用的检测是检测对海马依赖性认知任务的调节作用。在另一实施方案中，所述调节作用的检测是检测对杏仁核依赖性认知任务的调节作用。在另一实施方案中，所述调节作用的检测是检测对海马依赖性认知任务和杏仁核依赖性认知任务的调节作用。在特定实施方案中，对Gprl2活性的调节包括调节哺乳动物中Gprl2蛋白表达。在另外的实施方案中，所述施用导致认知功能增强。在另一实施方案中，所述方法进一步包括在足以导致执行特定认知任务的能力改善的条件下训练所述哺乳动物。在另一实施方案中，相对于在不施用条件下单独训练达到的执行认知任务的能力得到了能力改善。在另一实施方案中，所述训练包含多个训练期。在另一实施方案中，所述训练包含有间隔的训练期。在另一实施方案中，所述药剂在每个训练期之前和/或期间施用。在另一实施方案中，所述药剂包含一或多种有效量的Gprl2siRNA分子、有效量的生物学活性Gprl2反义片段和/或有效量的特异于Gprl2蛋白的抗体。本发明的另一方法包括如下步骤(a)将感兴趣的药剂导入表达Gprl2蛋白的宿主细胞中；和(b)确定Gprl2功能，其中在(b)中确定的Gprl2功能与未施用所述药剂的(a)宿主细胞中Gprl2功能相比的差异确定所述药剂能调节Gprl2功能。本发明的另一方法包括如下步骤(a)给哺乳动物施用调节Gprl2功能的药剂；(b)在足以在哺乳动物中产生长期记忆形成的条件下训练步骤(a)的哺乳动物和相同物种的未施用所述药剂的对照哺乳动物；(c)评估在步骤(b)中训练的哺乳动物中的长期记忆形成情况；和(d)对比在步骤(c)中评估的哺乳动物中长期记忆形成情况，其中在施用所述药剂的哺乳动物中评估的长期记忆形成相对于在对照哺乳动物中评估的长期记忆形成的差异确定所述药剂能调节长期记忆形成。在一特定实施方案中，所述哺乳动物是成年哺乳动物。在另一特定实施方案中，所述哺乳动物是人。在另一实施方案中，所述长期记忆形成是海马依赖性长期记忆形成。在另一实施方案中，所述长期记忆形成是杏仁核依赖性长期记忆形成。在另一实施方案中，所述长期记忆形成是海马依赖性和杏仁核依赖性记忆形成。在另一实施方案中，对Gpr12活性的调节包括调节哺乳动物中Gprl2蛋白表达。在另一实施方案中，所述训练包含多个训练期。在另一实施方案中，所述训练包含有间隔的训练期。在又一实施方案中，所述药剂在每个训练期之前和/或期间施用。在另一实施方案中，所述药剂包含一或多种有效量的Gpr12siRNA分子、有效量的生物学活性Gprl2反义片段和/或有效量的特异于Gprl2蛋白的抗体。参考下文详细描述和附图可以更加明了本发明的这些及其它方面。应理解在不偏离本发明基本精神和范围的前提下可以对本文揭示的特定实施方案进行各种改变、更改和替代。此外，应进一步理解附图只是举例及以图示表述本发明举例的实施方案，其它未举例的实施方案也包含在本发明范围内。附图简述图Ia是示出实验数目对情景记忆形成的作用的柱状图。用增多数目的成对CS-US训练小鼠，4天后评估情景记忆。图Ib是示出痕迹间隔对于时间记忆形成的作用的柱状图。使用与延迟条件反射(delayconditioning)相比逐渐增加的长痕迹间隔和音调(tone)记忆在痕迹恐惧条件反射中训练小鼠。图2a是通过实时PCR测量的小鼠CNS中Gprl2mRNA表达水平表。图2b是通过实时PCR测量的小鼠CNS中Gprl2mRNA表达水平表。图3是Neuro2A细胞中在siRNA处理后24小时的Gprl2mRNA水平的柱状图。图4a是小鼠海马中Gprl2siRNA对情景记忆的作用的柱状图。图4b是小鼠杏仁核中Gprl2siRNA对情景记忆的作用的柱状图。图5是小鼠海马中Gprl2siRNA对痕迹恐惧记忆的作用的柱状图。图6是被灌注海马中非靶向SiRNA(A)与Gprl2siRNA(B)的Nissl染色图。图中示出插管插入部位背侧和腹侧的海马切片。图7是在Gprl2siRNA处理后2天和3天的海马Gprl2mRNA水平的柱状图。图8a示出Gprl2-/-、Gpr12+/"小鼠和WT对照同窝出生小鼠中Gprl2、Crebl和GrinlmRNA水平的qPCR分析。在Gprl2+/_小鼠中Gprl2mRNA降低至对照的51%，在纯合KO小鼠中不可检测到。相反，Crebl和GrinlmRNA不受影响。图8b示出对Gprl2+/_和WT海马形态学(Cresylviolet染色)的大体分析。在Gpr+小鼠中观测到无显著异常。图9a示出Gpr12+/-小鼠(η=9)和WT对照(η=8)在开放场所的一般运动和试探性活动以及特定水平活动(走动)。图9b示出Gpr12+/-小鼠(η=9)和WT对照(η=8)在开放场所的一般运动和试探性活动以及特定垂直活动(用后腿站起)。图10示出WT小鼠(η=19)中作为目标识别记忆的长期保持的NOR记忆依赖于训练时间。图Ila示出在Gpr12+/"小鼠(η=15)和WT对照(η=165)中NOR记忆的24小时保持。图lib示出在Gprl2+/_小鼠和WT对照中检测期间的检测时间。图12a示出在Gpr12+/-小鼠(η=6)和WT对照(η=8)中NOR记忆的3小时保持。图12b示出在检测期间的检测时间。发明详述本发明涉及这样的发现，即抑制Gprl2可促进长期记忆形成。转录非依赖性记忆包括各种“记忆阶段(memoryphase)”，如短期记忆、中期记忆和(在飞蝇中)抗麻醉记忆(anesthesia-resistantmemory)。这些形式的共同之处是RNA转录的药理学抑制剂不破坏这些记忆。转录依赖性记忆通常称作长期记忆且RNA合成的抑制剂阻断其显现。这种特定的实验性经历的记忆形成可以两种一般形式存在转录非依赖性形式和转录依赖性形式。前者包括各种“记忆阶段”，如短期记忆和中期记忆。这些形式的共同之处是RNA转录的药理学抑制剂不破坏这些记忆。后一形式通常被称作长期记忆且RNA合成的抑制剂阻断其显现。本领域已经发现g-偶联蛋白受体Gprl2在介导哺乳动物记忆形成的分子事件中起重要作用。如本文所述，已经发现海马内Gprl2-介导的mRNA运输在哺乳动物情景长期记忆形成中是重要的。本领域已经发现海马Gprl2功能的破坏或抑制增强哺乳动物转录依赖性记忆形成(如长期记忆形成)。本发明涉及通过抑制Gprl2基因或基因产物治疗长期记忆缺陷或者认知障碍的方法。除非另外定义，本文所用技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。本领域技术人员意识到有许多方法和材料与本文所述那些方法和材料相似及相当，其可用于实践本发明。事实上，本发明非限于本文所述方法和材料。针对本发明，定义了如下术语。定义如本文所用，术语“动物”包括哺乳动物以及其它动物，脊椎动物和无脊椎动物(例如鸟类、鱼类、爬行类、昆虫(例如果蝇)、海螺)。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何脊椎动物，包括单孔类、有袋动物和有胎盘动物，其为其幼仔哺乳以及分娩出活的幼仔(真哺乳亚纲(eutharian)或者有胎盘哺乳动物)或者是卵生动物(后兽亚纲(metatharian)或者非胎盘哺乳动物)。哺乳动物的例子包括人和其它灵长类动物(例如猴子、黑猩猩)、啮齿类动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)和反刍动物(例如牛、猪、马)。优选所述哺乳动物是人。如本文所用，“对照动物”或者“正常动物”是与在一定条件下训练的动物相同物种及其它方面相当(例如相似年龄、性别)的动物，所述条件是足以在所述动物中诱导转录依赖性记忆形成的条件。"Gprl2功能”是指Gprl2的生物学活性。生物学活性是指生物学功能或作用。术语“Gprl2抑制剂或者GRP12抑制剂化合物或制剂”是指这样的化合物，其能作为Gprl2多肽的拮抗剂且能直接或间接抑制Gprl2多肽的功能。这种化合物包括特异于Gpr12基因的干扰RNA(siRNA)、特异于Gpr12基因的反义核苷酸、特异于Gpr12蛋白的抗体以及小分子，包括肽。小鼠和人的Gprl2基因和蛋白质序列在表1中示出。表1“GRP12基因和蛋白质<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在各个物种中，长期记忆(LTM)由两个主要生物学性质定义。首先，长期记忆的形成需要新蛋白质合成。其次，其包含CAMP一应答性转录且由CAMP一应答元件结合蛋白(CREB)家族转录因子介导。“认知障碍、缺陷或病症”包括年龄相关记忆缺陷，神经变性疾病(例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿病(舞蹈病)、其它老年性痴呆)，精神疾病(例如抑郁症、精神分裂症、孤独症、注意力不足症)，创伤依赖性功能丧失(例如脑血管疾病(例如卒中、缺血)、脑肿瘤、头或脑损伤)，遗传缺陷(例如鲁宾斯坦-泰比综合征、唐氏综合征、Angelimn综合征、神经纤维瘤、Coffin-Lowry综合征、Rett综合征、强直性肌营养不良、脆性X染色体综合症(例如脆性X-I染色体综合症、脆性X-2染色体综合症)、William's综合征)以及学习障碍。本领域已知且可易于获得正规的认知训练方案。见例如Kami，A.mdSagi，D.，“Wherepracticemakesperfectintextdiscrimination:evidenceforprimaryvisualcortexplasticity“,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,884966-4970(1991)；Kami,A.andSagi,D.，“Thetimecourseoflearningavisualskill"，Nature,365250-252(1993)；Kramer，A.F.etat，“Taskcoordinationandaging-explorationsofexecutivecontrolprocessesinthetaskswitchingparadigm“，ActaPsychol.(Amsf)，101:339_378(1999)；Kramer，A.F.etal.，“TrainingforexecutivecontrolTaskcoordinationstrategiesandaging“，InAgingandSkilledPerformanceAdvancesInTheoryandApplications，W.Rogersetal，eds.(Hillsdale，NJ.Erlbaum)(1999)；Rider，R.A.andAbdulahad，D.T.，“Effectsofmassedversusdistributedpracticeongrossandfinemotorproficiencyofeducablementallyhandicappedadolescents“,Percept.Mot.Skills,73219-224(1991)；Willis,S.L.andSchaie,K.W.,“Trainingtheelderlyontheabilityfactorsofspatialorientationandinductivereasoning"，Psychol·Aging，1:239_247(1986)；Willis,S.L.andNesselroade,C.S.，“Long-termeffectsoffluidabilitytraininginold-oldage“,Develop.Psychol,26905-910(1990)；Wek,S.R.andHusak,W.S..“Distributedandmassedpracticeeffectsonmotorperformanceandlearningofautisticchildren”，Percept.Mot.Skills,68107-113(1989)Verhaehen，P.etal.，“Improvingmemoryperformanceintheagedthroughmnemonictraining:ameta-analyticstudy“，Psychol.Aging,7242~251(1992)；Verhaeghen，P.andSalthouse.Τ.A.,“Meta-analysesofage-cognitionreIationsinadulthood-estimatesoflinearandnonlinearageeffectsandstructuralmodels“.PsycholBull，122:231_249(1997);Dean，C.M.etai，“Task-relatedcircuittrainingimprovesperformanceoflocomotortasksinchronicstroke:arandomized,controlledpilottrial"，Arch.Phys.Med,Rehabi1.,81409-417(2000)；Greener,J.etai,“Speechandlanguagetherapyforaphasiafollowingstroke“，CochraneDatabaseSyst.Rev.，CD000425(2000)；Hummelsheim，H.andEickhof，C，“Repetitivesensorimotortrainingforarmandhandinapatientwithlocked-insyndrome“，Scand.J.Rehabil.Med.,31250~256(1999)；Johansson,B.B.，〃Brainplasticityandstrokerehabilitation.TheWillislecture〃，Stroke,31223-230(2000)；KoKo,C,“Effectivenessofrehabilitationformultiplesclerosis”,Clin.Rehabi1.,13(Suppl.1):33_41(1999)；Lange.G.etai，“Organizationalstrategyinfluenceonvisualmemoryperformanceafterstroke:cortical/subcorticalandleft/righthemispherecontrasts“,Arch.Phys.Med.Rehabi1.，8189~94(2000)；Liepert，J.etal，“Treatment-inducedcorticalreorganizationafterstrokeinhumans〃，Stroke,31:1210-1216(2000)；Lotery,A.J.etai,“Correctablevisualimpairmentinstrokerehabilitationpatiems“，AgeAgeing,29221-222(2000)；Majid,Μ.J.etal,“Cognitiverehabilitationformemorydeficitsfollowingstroke“(Cochranereview),CochraneDatabaseSyst.Rev.,CD002293(2000)；Merzenich,M.etal,“Corticalplasticityunderlyingperceptual，motor，andcognitiveskilldevelopment!implicationsforneurorehabilitation”，ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol,611-8(1996)；Merzenich,M.M.etal,“Temporalprocessingdeficitsoflanguage-learningimpairedchildrenamelioratedbytraining"，Science，271:77_81(1996)；Murphy,Ε.,“Strokerehabilitation“，J.R.Coll.PhysiciansLond·，33:466_468(1999)；Nagarajan，S.S.etal，“Speechmodificationsalgorithmsusedfortraininglanguagelearning-impairedchildren"，IEEETrans.Rehabil.Eng.,6:257-268.(1998)；Oddone,Ε.etai,“QualityEnhancementResearchInitiativeinstroke-prevention，treatment,andrehabi1itation“，Med.Care38192-1104(2000)；Rice-Oxley,M.andTurner-Stokes,L.,〃Effectivenessofbraininjuryrehabilitation〃，Clin.Rehabil.,13(Suppl1):7_24(1999)；Tallal，P.etal,〃Languagelearningimpairments!integratingbasicscience，technology,andremediation"，Exp.BrainRes·，123:210_219(1998)；Tallal,P.etai,〃Languagecomprehensioninlanguage-learningimpairedchildrenimprovedwithacousticallymodifiedspeech"，Science，271:81-84(1996):Wingfield.A.etai,“Regaininglosttime:adultagingandtheeffectoftimerestorationonrecalloftime-compressedspeech".Psychol.Aging,14:380-389(1999)，所述文献以其全部内容并入本文作参考。训练可以包含一或多个训练期，且是适于使得执行感兴趣的认知任务的能力改善的训练。例如，如果希望语言习得改善，则训练针对语言习得进行。如果希望学习乐器的能力改善，则针对学习乐器的能力进行训练。如果希望特定运动技能改善，则针对该特定运动技能习得进行训练。感兴趣的特定认知任务与适当训练相匹配。“多个训练期”是指两或更多个训练期。Gprl2抑制剂可以在一或多个训练期之前、期间或之后施用。在特定的实施方案中，Gprl2抑制剂在每个训练期之前和期间施用。“训练”是指认知训练。“调节”是指基因的表达、或者编码一或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平或者一或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性被上调或下调，由此所述表达、水平或活性高于或低于在无所述调节剂的条件下的观测结果。例如，术语“调节”可以是指“抑制”，但是术语“调节”的用法非限于该定义。“抑制”、“下调”或者“降低”是指基因的表达、或者编码一或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平或者一或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性被降低至低于在无本发明核酸分子(例如siNA)的条件下的观测结果。在一个实施方案中，SiNA分子的抑制、下调或者降低低于在存在无活性或弱化siRNA分子条件下的观测水平。在另一实施方案中，siNA分子的抑制、下调或者降低低于在存在例如具有混杂的序列或者具有错配的siNA分子条件下的观测水平。在另一实施方案中，siRNA分子的抑制、下调或者降低是指靶RNA分子或者等价RNA分子的表达水平与无所述siRNA分子的条件下的水平相比降低至少20%、30%、40%、50%、60%或者70%。“增强”是指相对于正常的生物化学或者生理学作用或效果加强、增加、改善或者更大或更好的能力。例如，增强长期记忆形成是指相对于动物的正常长期记忆形成加强或增加动物的长期记忆形成的能力。结果，长期记忆习得更快速或更好地保留。增强执行认知任务能力是指相对于动物正常的认知任务执行能力(performance)加强或改善动物的特定认知任务执行能力的能力。术语“海马依赖性认知任务”是指与脑的海马区相关的认知任务。术语“杏仁核依赖性认知任务”是指与脑的杏仁核区相关的认知任务。术语“靶基因”或者“基因”是指编码RNA的核酸，例如包括但不限于编码多肽的结构基因的核酸序列。靶基因可以是衍生自细胞的基因或内源基因。“靶核酸”是指其表达或活性被调节的任何核酸序列。所述靶核酸可以是DNA或RNA。“同源序列”是指由一或多个多核苷酸序列如基因、基因转录物和/或非编码多核苷酸共有的核苷酸序列。例如，同源序列可以是由编码相关但不同的蛋白质的两或多个基因共有的核苷酸序列，例如基因家族不同成员、不同蛋白质表位、不同蛋白质同种型或者完全趋异(divergent)的基因，如细胞因子及其相应受体。同源序列可以是由两或多个非编码多核苷酸共有的核苷酸序列，如非编码DNA或RNA、调节序列、内含子以及转录控制或调节位点。同源序列也可包含由一个以上多核苷酸序列共有的保守序列区域。同源非必须是完全同源(例如100%)，本发明也包含部分同源序列(例如99%、98%、97%、96%、95%、94%,93%,92%,91%,90%,89%,88%,87%,86%,85%,84%,83%,82%,81%,80%寸乂O“保守序列区域”是指多核苷酸中一或多个区域的核苷酸序列在世代之间或者从一个生物学系统、对象或生物体至另一个生物学系统、对象或生物体无明显变化。所述多核苷酸可包含编码和非编码DNA和RNA二者。“有义区”是指与siNA分子的反义区具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此夕卜，siNA分子的有义区可包含与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。“反义区”是指与靶核酸序列具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区可任选包含与siNA分子的有义区具有互补性的核酸序列。“互补性”是指核酸可与另一核酸序列通过传统的Watson-Crick或者其它非传统类型形成氢键。关于本发明的核酸分子，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以使得所述核酸的相关功能例如RNAi活性进行下去。核酸分子的结合自由能的确定为本领域熟知(见例如Turneretal.，1987，CSHSymp.Quant.Biol.LIIpp.123-133；Frieretal.,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA839373-9377；Turneretal.,1987,J.Am.Chem.Soc.109=3783-3785)0互补性百分比表示核酸分子中可以与另一核酸序列形成氢键(例如Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比(例如第一个寡核苷酸中共10个核苷酸中的5、6、7、8、9或10个核苷酸与具有10个核苷酸的第二个核酸序列碱基配对分别代表50%、60%、70%、80%、90%、和100%互补性)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基与另一个核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。“RNA”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2'位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一或多个核苷酸而与天然发生的RNA不同的改变的RNA。这种改变可包括如在siNA末端或者例如在RNA的一或多个核苷酸内部添加非核苷酸材料。本发明的RNA分子中的核苷酸也可以包含非标准核苷酸，如非天然发生的核苷酸或者化学合成的核苷酸或者脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作类似物或天然发生的RNA的类似物。如本文所用，术语“硫代磷酸酯”是指RNA分子中的核苷酸间的键，其中两个核苷酸之间的至少一个键包含硫原子。因此，术语硫代磷酸酯是指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键二者。如本文所用，术语“膦酰乙酸键”是指RNA分子中核苷酸间键，其中两个核苷酸之间至少一个键包含乙酰基或者保护的乙酰基。见例如Sheehanetal.,2003NucleicAcidsResearch31，4109-4118或者美国专利出版物No.2006/0247194所述。如本文所用，术语“硫代膦酰乙酸键”是指包含至少一个核苷酸间键的RNA分子，所述键包含乙酰基或者保护的乙酰基和硫原子。见例如Sheehanetal.,2003NucleicAcidsResearch31，4109-4118或者美国专利出版物No.2006/0247194所述。如本文所用，“治疗”是指改善不良长期记忆形成的临床症状。改善临床症状包括例如与预处理水平或者无长期记忆形成缺陷的个体相比增加或改善长期记忆，增加的执行认知任务的能力。如本文所用，术语“预防”是指阻止不良长期记忆形成的临床症状出现。如本文所用，术语“治疗效力”是指药物或候选药物在治疗长期记忆形成缺陷、改善长期记忆形成、改善执行认知任务能力中的治疗作用。所述治疗效力可以通过监测患者执行认知任务的能力而测量。RNA分子合适的SiRNA可以通过例如合成或者通过在细胞中表达而产生。在一个实施方案中，编码siRNA分子的反义链的DNA序列可以通过PCR产生。在另一实施方案中，将siRNA编码DNA克隆进载体如质粒或病毒载体中以便于转移进哺乳动物中。在另一实施方案中，可以使用化学或者酶学手段合成siRNA分子。在本发明的一个实施方案中，本发明SiNA分子的每个序列的长度单独地为大约18到大约30个核苷酸，在特定的实施方案中其长度是大约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30个核苷酸。在一个实施方案中，所述siRNA分子含有大约19-23个碱基对，优选大约21个碱基对。在另一实施方案中，所述siRNA分子含有大约24-28个碱基对，优选大约26个碱基对。各个siRNA分子可以是单链形式以及成对的双链形式(“有义”和“反义”)且可以包含二级结构如发夹环。各个siRNA分子也可以作为前体分子输送，其随后被改变产生活性分子。举例的单链形式的siRNA分子包括抗DNA序列非转录区(例如启动子区)的单链反义siRNA。在再一个实施方案中，包含发夹或者环形结构的本发明的siNA分子的长度为大约35到大约55(例如大约35、40、45、50或55)个核苷酸，或者长度为大约38到大约44(例如大约38、39、40、41、42、43或44)个核苷酸，且包含大约16到大约22(例如大约16、17、18、19、20、21或22)个碱基对。所述SiRNA分子可包含这样的核苷酸片段，其是编码天然小鼠或人Gprl2蛋白质序列的DNA序列的有义链或反义链。优选所述小鼠或人Gprl2蛋白质序列包含表1所示那些序列，选自SEQIDNO=USEQIDNO:4或SEQIDNO:6。本发明的siRNA分子可以是如表1所示选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO5的天然小鼠或人Gprl2mRNAWmRNA序列的有义链的核苷酸片段。本发明的siRNA分子可以是与如表1所示选自SEQIDNO2、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5的天然小鼠或人Gprl2mRNA的mRNA序列反义的序列。下文讨论了目前已知由短干扰RNA介导的RNA干扰的机制，其不意味着是限制性的及承认是现有技术。化学修饰的短干扰核酸具有与siRNA分子相似或改善的介导RNAi的能力且预期具有改善的体内稳定性和活性。因此。这个讨论非仅限于siRNA，也可以用于siNA。“改善的介导RNAi的能力”或者“改善的RNAi活性”是指包括在体外和/或在体内测量的RNAi活性，其中RNAi活性是siNA介导RNAi的能力以及本发明siNA的稳定性二者的反映。RNA干扰是指由短干扰RNA(SiRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默过程(Fireetal.，1998，Nature，391，806)。植物中的相应过程通常被称作转录后基因沉默或者RNA沉默，且在真菌中也被称作压抑(quelling)。转录后基因沉默过程被认为是进化保守的细胞防御机制，用于阻止由不同区系(flora)和门(phyla)共有的外源基因表达(Fireetal.，1999，TrendsGenet.,15,358)这种阻止外源基因表达的保护机制也许已经进化应答衍生自病毒感染的双链RNA(dsRNA)的产生或者转座子元件通过特异性破坏同源单链RNA或者病毒基因组RNA的细胞应答向宿主基因组的随机整合。细胞中dsRNA的存在通过目前未完全鉴定的机制触发RNAi应答。这个机制看起来与干扰素应答不同，所述干扰素应答得自蛋白激酶PKR和2’，5’-寡腺苷酸合成酶的dsRNA-介导的活化，导致核糖核酸酶L对mRNA的非特异性裂解。细胞中长dsRNA的存在刺激称作Dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer参与dsRNA加工为dsRNA短片段，称作短干扰RNA(siRNA)(Bersteinetal.，2001，Nature，409，363)。衍生自Dicer活性的短干扰RNA的长度典型为大约21至大约23个核苷酸，且包含大约19个碱基对双链体。Dicer也参与21-和22-个核苷酸的小时间RNA(stRNA)从参与翻译控制的保守结构的前体RNA中切除(Hutvagneretal.，2001，Science，293，834)。RNAi应答的特征还在于通常称作RNA诱导性沉默复合物(RISC)的含有siRNA的核酸内切酶复合物，其介导具有与所述siRNA同源的序列的单链RNA裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的引导序列互补的区域的中间发生(Elbashiretal.,2001,GenesDev.，15，188)。此夕卜，RNA干扰也可包含小RNA(例如微小RNA或mRNA)介导的基因沉默，可能是通过调节染色质结构的细胞机制且从而阻止靶基因序列转录而介导(见例如Allshire，2002，Science,297,1818-1819；Volpeetal.,2002,Science,297,1833-1837；Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218；Halletal.，2002，Science,297，2232-2237)。已经在许多系统中研究了RNAi。Fireetal.，1998，Nature，391，806首先在线虫(C.elegans)中观测RNAi。WiannyandGoetz,1999,NatureCellBiol.，2，70描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammondetal.，2000，Nature，404，293描述了在用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashiretal.，2001，Nature，411，494描述了通过在培养的哺乳动物细胞中导入合成的21个核苷酸RNA双链体诱导的RNAi，所述哺乳动物细胞包括人胚胎肾细胞和HeLa细胞。近来在果蝇胚胎裂解产物中进行的研究揭示了介导有效RNAi活性必需的siRNA长度、结构、化学成分以及序列的某些必要条件。这些研究已经示出21个核苷酸的siRNA双链体当含有两个2-核苷酸3’-末端核苷酸突出端时是最具活性的。此夕卜，siRNA的一或两个链由2'-脱氧核苷酸或者2'-O-甲基核苷酸的取代会消除RNAi活性，而siRNA的3’-末端核苷酸由脱氧核苷酸取代是容许的。siRNA双链体中心的错配序列也示出消除RNAi活性。此外，这些研究还表明靶RNA中裂解位点的位置由siRNA引导序列的5，-末端而不是3，-末端限定(Elbashiretal.,2001,EMBOJ.,20,6877)其它研究表明在siRNA双链体的靶互补链上的5'-磷酸酯是siRNA活性必需的，且ATP用于维持siRNA上的5'-磷酸酯部分(Nykanenetal.，2001，Cell，107，309)；然而，缺少5'-磷酸酯的siRNA分子当被外源导入时是活性的，提示siRNA构建体的5'-磷酸化可以在体内发生。在一个实施方案中，本发明涉及修饰的SiNA分子。举例的预期对磷酸酯主链的修饰包括这样的磷酸酯主链修饰，其包含一或多个硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸酯，包括甲基膦酸酯，磷酸三酯，包括烷基磷酸三酯，吗啉代，酰胺氨基甲酸酯(amidatecarbamate)，羧甲基，乙酰胺，聚酰胺，磺酸酯，氨磺酰，氨基磺酸酯(sulfamate)，formacetal,thioformacetal和/或烷基甲硅烷基取代。关于寡核苷酸主链修饰的回顾见HunzikerandLeumann,1995,NucleicAcidAnalogues:SynthesisandProperties,inModemSyntheticMethods,VCH,331-417L^i,^Mesmaekeretal.,1994,NovelBackboneReplacementsforOligonucleotides,inCarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,ACS,24-39所述。举例的预期对糖部分的修饰包括2'_烷基嘧啶，如2'-0-甲基、2'-氟、氨基和脱氧修饰等(见例如Amarzguiouietal.，2003，NucleicAcidsRes.31:589_595，美国专利出版物No.2007/0104688)。举例的预期对碱基基团的修饰包括无碱基糖(abasicsugars)，2-0-烷基修饰的嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘尿嘧啶和5-(3-氨基烯丙基)_尿嘧啶等。也可以掺入锁定核酸或者LNA'S。本领域已知许多其它修饰，只要符合上述标准即可使用。举例的修饰也在美国专利No.5，684，143,5,858，988和6，291，438以及在美国出版的专利申请NO.2004/0203145A1中揭示，所述文献并入本文参考。其它修饰在Herdewijn(2000)，AntisenseNucleicAcidDrugDev.10:297_310，Eckstein(2000)AntisenseNucleicAcidDrugDev.10:117_21,Rusckowskietal.(2000)AntisenseNucleicAcidDrugDev.10:333_345,Steinetal.(2001)AntisenseNucleicAcidDrugDev.11317-25以及Vorobjevetal.(2001)AntisenseNucleicAcidDrugDev.1177-85中揭示，所述文献并入本文参考。RNA可以通过酶处理或者通过部分/全部有机合成方法而产生，修饰的核糖核苷酸可以通过体外酶或有机合成方法导入。在一个实施方案中，每个链均是化学制备的。合成RNA分子的方法为本领域已知。抗体举例的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、双特异性抗体以及异源缀合(heteroconjugate)抗体。术语“抗体”以其最广泛的含义使用，特别包含例如单链抗Gprl2单克隆抗体(包括拮抗剂和中和抗体)、具有多肽表位特异性的抗_Gprl2抗体组合物、单链抗-Gprl2抗体，以及抗_Gprl2抗体的片段。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自一群充分均质的抗体的抗体，即该群包含的各个抗体除了也许少量存在的可能天然发生的突变之外均相同。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。举例的抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapataetal,ProteinEng.8(10)1057-1062[1995])；单链抗体分子；以及从抗体片段中形成的多特异性抗体。“特异性结合”或者“特异于”特定多肽或者特定多肽上表位的抗体是结合该特定多肽或者特定多肽上表位的抗体，其基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。抗-Gprl2抗体可包含多克隆抗体。本领域技术人员已知制备多克隆抗体的方法。多克隆抗体可以在哺乳动物中产生，例如通过一或多次注射免疫制剂以及如果需要的佐剂而产生。典型地，所述免疫制剂和/或佐剂通过多次皮下或腹膜内注射而注射进哺乳动物中。所述免疫制剂可包含Gprl2多肽或者其融合蛋白。有益的是将所述免疫制剂与已知在被免疫的哺乳动物中是免疫原性的蛋白质缀合。举例的这种免疫原性蛋白包括但不限于匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的例子包括Freund's完全佐剂和MPL-TDM佐剂(一磷酰脂质A，合成的trehalosedicorynomycolate)。所述免疫方案可以由本领域技术人员选择而不需要过多的实验。所述抗_Gprl2抗体或者可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以通过使用杂交瘤方法制备，如KohlerandMiistein,Nature,256=495(1975)所述方法。在杂交瘤方法中，将小鼠、仓鼠或者其它合适的宿主动物典型用免疫制剂免疫以诱导淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或者能产生特异性结合所述免疫制剂的抗体。或者，所述淋巴细胞可以在体外免疫。如本领域技术人员所理解，本发明可以使用多种其它基因破坏技术。非限制性的例子是可以使用同源重组、显性-阴性基因构建体的转基因表达、正常基因构建体的转基因表达以及靶基因中氨基酸序列的任何其它修饰。病毒载体也可以适当应用以输送各种这样的基因构建体至脑细胞，且这种构建体包括通过RNAi途径起作用的一些构建体(短发夹RNA，双链RNA等)。配制物可以适当配制Gprl2抑制剂化合物样品并通过任何方式将其导入哺乳动物中以使得样品的足够部分进入细胞中。例如，所述抑制剂可以在缓冲液中配制，所述缓冲液如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和壳体。具有阳离子脂质的siRNA配制物可用于促进dsRNA转染进细胞中。例如，可以使用阳离子脂质如Iipofectin(美国专利No.5，705，188，并入本文参考)，阳离子甘油衍生物以及聚阳离子分子如聚赖氨酸(出版的PCT国际申请W097/30731，并入本文参考)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或者FuGene6(Roche)，所有这些脂质均可以根据厂商指导使用。在一个实施方案中，本发明的Gprl2特异性siNA分子与聚乙烯亚胺(例如线性或分支PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物一起配制或复合，所述衍生物包括例如接枝的(grafted)PEI如半乳糖PEI、胆固醇PEI、抗体衍生的PEI以及聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(见例如Ogrisetal.，2001，AAPAPharmSci,3,1-11；Furgesonetal.,2003,BioconjugateChem.,14,840-847；Kunathetal.,2002,PharmaceuticalResearch,19,810-817；Choietal.,2001,Bull.KoreanChem.Soc,22,46-52；Bettingeretal.，1999，BioconjugateChem.,10,558-561；Petersonetal.,2002,BioconjugateChem.,13,845-854；Erbacheretal.,1999,JournalofGeneMedicinePreprint,1,1-18；Godbeyetal.，1999，PNASUSA,96,5177-5181；Godbeyetal.,1999,JournalofControlledRelease,60,149-160；Dieboldetal.,1999,JournalofBiologicalChemistry,274,19087-19094；ThomasandKlibanov，2002，PNASUSA，99，14640-14645；及Sagara，U.S.Pat.No.6，586，524，所述文献并入本文参考)。本领域技术人员可意识到将Gprl2抑制剂分子导入细胞环境中的方法依赖于细胞类型及其环境的组成。例如，当所述细胞在液体内存在时，一种优选的配制物是液体配制物如于lipofectamine中且所述抑制剂可以直接加入细胞的液体环境中。脂质配制物也可以给动物如通过静脉内、肌内或者腹膜内注射施用，或者通过口服或通过吸入或本领域已知的其它方法施用。当所述配制物适于给动物如哺乳动物及更特别是人施用时，所述配制物也是药物学可接受的。本领域已知且可以使用施用寡核苷酸的药物学可接受的配制物。在一些情况中，优选在缓冲液或盐水溶液中配制所述抑制剂并且将配制的抑制剂直接注射至细胞中。也可以直接注射dsRNA双链体。关于导入siRNA的合适方法见美国公布的专利申请No.2004/0203145A1，所述专利并入本文参考。所述Gprl2抑制剂包含药理学有效量。药理学或治疗有效量是指有效产生指定药理学、治疗或预防结果的抑制剂的量。短语“药理学有效量”和“治疗有效量”或者简单地“有效量”是指有效产生指定药理学、治疗或预防结果的抑制剂的量。例如，如果当与疾病或病症相关的可测量参数有至少20%的降低则认为指定的临床处理是有效的时候，则治疗该疾病或病症的药物的治疗有效量是实现该参数至少20%降低必需的量。必须导入适量抑制剂且这些量可以通过使用标准方法根据经验确定。典型地，细胞环境中各种siRNA的有效浓度是大约50纳摩尔或者低于10纳摩尔或更低，或者可以使用其中大约为1纳摩尔或更低浓度的组合物。在其它实施方案中，在许多情况中可以使用利用大约200皮摩尔或更低以及甚至大约50皮摩尔或更低浓度的方法。通常地，siRNA的合适剂量单位是在每个受体大约0.001至大约0.25mg/kg体重/天的范围，或者在大约0.01至大约20μg/kg体重/天的范围，或者在大约0.01至大约10μg/kg体重/天的范围，或者在大约0.10至大约5μg/kg体重/天的范围，或者在大约0.1至大约2.5μg/kg体重/天的范围。在本发明的一个实施方案中，Gprl2抑制剂可以一天施用一次。然而，该配制物也可以含有在一天中以适当间隔施用的2、3、4、5、6或更多个亚剂量的剂量单位给予。在这种情况中，在一个实施方案中，每个亚剂量中含有的抑制剂必须相应较少以达到总计每天剂量单位。该剂量单位也可以是几天的单次剂量的复合剂量，例如使用常规缓释配制物，在几天内持续及一致地释放siRNA。缓释配制物为本领域熟知。在这个实施方案中，剂量单位含有相应的多个每日剂量。无论配制物如何，所述药物组合物必须含有足够量的抑制剂以抑制Gprl2基因在动物中的表达。数据可以得自细胞培养物测定以确定合适的剂量范围。本发明组合物的剂量在较低或无毒性的循环浓度包括ED5tl(通过已知方法确定)的范围内。根据应用的剂型以及施用途径，剂量可以在此范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以从细胞培养物测定中估算。血浆中抑制剂的水平可以通过标准方法测量，例如通过高效液相层析测量。所述方法可通过将所述SiRNA组合物加入细胞可生活的任何细胞外基质中而进行，条件是配制所述siRNA组合物以便足够量的siRNA可以进入细胞发挥其作用。例如，所述方法可用于存在于液体如液体培养物或者细胞生长培养基中、在组织外植体中或者在完整生物体包括动物如哺乳动物、特别是人中的细胞。输送方法编码特异于基因靶序列的反义链或siRNA的DNA序列被导入哺乳动物细胞中表达。为了靶向基因中一个以上的序列(如不同的启动子区序列和/或编码区序列)，可以将特异于每个靶向基因序列的单独的siRNA编码DNA序列同时导入细胞中。根据另一个实施方案，哺乳动物细胞可以暴露于靶向基因中多个序列的多个siRNA。本发明的Gprl2抑制剂可以通过本领域已知的任何方式施用，例如通过胃肠外途径，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、直肠、阴道和局部(包括口腔和舌下)施用方式。在一些实施方案中，所述药物组合物通过静脉内或者腹膜内灌注或注射方式施用。在一个实施方案中，本发明特征在于使用将本发明的核酸分子输送至中枢神经系统和/或周围神经系统的方法。实验已经证实神经元在体内对核酸的有效摄取。作为将核酸局部施用给神经细胞的实例，Sommeretal.，1998，AntisenseNuc.AcidDrugDev.,8,75描述了这样的研究，其中将c-fos的15聚体硫代磷酸酯反义核酸分子通过显微注射大脑施用给大鼠。作为将核酸系统施用给神经细胞的实例，Epaetal.,2000,AntisenseNuc.AcidDrugDev.，10，469描述了体内小鼠研究，其中β-环糊精-金刚烷-寡核苷酸缀合物用于靶向神经元分化的PC12细胞中的ρ75神经营养因子受体。在IP施用两周后，在背根神经节(DRG)细胞中观测到ρ75神经营养因子受体反义核酸的显著摄取。此外，在DRG神经元中观测到Ρ75的明显和一致的下调。将核酸靶向神经元的其它方法在Broaddusetal.，1998，J.Neurosurg.，88(4)，734；Karleetal.，1997，Eur.J.Pharmocol.，340(2/3)，153；Bannaietal.,1998,BrainResearch,784(1,2),304；Rajakumaretal.,1997,Synapse,26(3)，199；ffu-pongetal.，1999，BioPharm,12(1),32；Bannaietal.，1998，BrainRes.Protoc,3(l),83；Simantovetal.，1996，Neuroscience，74(1)，39中描述。本发明的核酸分子因此适于输送至神经细胞并且被其摄取。通过各种不同策略输送靶向候选基因的本发明的核酸分子。可以使用的传统CNS输送方法包括但不限于鞘内和脑室内施用，植入导管和泵，在损伤或损害部位直接注射或灌注，注射进脑动脉系统，或者通过化学或渗透性方式使血脑屏障开放。其它方法可包括使用各种转运和载体系统，例如通过使用缀合物和生物可降解的聚合物。此外，基因治疗方法如Kaplittetal.，U.S.Pat.No.6，180,613和Davidson，WO04/013280所述方法可用于在CNS中表达核酸分子。术语“导入”包含在体外或在体内将DNA导入细胞中的各种方法。这种方法包括转化、转导、转染和感染。载体是可用且优选的将编码siRNA分子的DNA导入细胞中的物质。所述导入可以通过使用至少一种载体而实现。可能的载体包括质粒载体和病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体，或者其它载体如腺病毒载体或者腺伴随病毒载体。本发明也可以使用将SiRNA分子或者编码siRNA分子的DNA输送至细胞或组织中的另一输送系统，包括脂质体、化学溶剂、电穿孔、病毒载体、胞饮作用、吞噬作用及其它形式自发或诱导的外源物质的细胞摄取，以及本领域已知的其它输送系统。合适的启动子包括这样的启动子，其一旦与编码干扰RNA分子的序列可操纵地结合或连接则促进所述干扰RNA分子表达。如本领域所已知，这种启动子包括细胞启动子和病毒启动子。在一个实施方案中，所述启动子是RNAPolIII启动子，其优选位于编码干扰RNA分子的DNA序列的立即上游。如本领域所已知，可以使用各种病毒启动子，包括但不限于病毒LTR，以及腺病毒、SV40和CMV启动子。在一个实施方案中，本发明使用哺乳动物TORNAPolIII启动子，更优选使用人TOsnRNAPolIII启动子，其先前已经用于在人细胞中表达短的指定核酶转录物(Bertrandetal.,1997；Goodetal.，1997)。发现所述U6PolIII启动子及其简单的终止序列(4-6个尿苷)在细胞中表达siRNA。可以将适当选择的干扰RNA或siRNA编码序列插入转录盒中，提供检测RNA分子的内源表达和功能的最佳系统。表汰测量Gprl2基因的表达可以通过本领域已知的及后来揭示的任何合适方法确定。可以意识到用于测量靶基因表达的方法依赖于靶基因的性质。例如，当靶基因编码蛋白质时，术语“表达”可以是指衍生自所述基因的蛋白质或转录物。在这种情况中，靶基因的表达可以通过测量相应于靶基因的mRNA的量或者通过测量该蛋白质的量而确定。蛋白质可以在蛋白质测定中测量，如通过染色或者免疫印迹，或者如果所述蛋白质催化可以测量的反应，在通过测量反应速度而确定。所有这些方法均为本领域已知且可以使用。在基因产物是RNA的情况中，表达可以通过确定相应于基因产物的RNA的量而测量。所述测量可以对细胞、细胞提取物、组织、组织提取物或者任何其它合适源材料进行。Gprl2基因的表达是否降低的确定可以通过能可靠地检测基因表达变化的任何合适方法进行。实施例实施例1-情景和痕迹条件反射(traceconditioning)用诱导微弱记忆的情景条件反射范式(contextualconditioningparadigm)训练小鼠(图1,也见Tully，Τ.，etal,NatRevDrugDiscov2，267-77(2003))。图Ia示出了训练次数对于情景记忆形成的作用。用逐渐增加次数的成对CS-US训练小鼠，4天后评估情景记忆。用IX或2X成对CS-US训练诱导次最大记忆。痕迹条件反射随着CS与US之间时间间隔延长而变得越来越难。在痕迹恐惧条件反射(tracefearconditioning)中使用逐渐延长的长痕迹(longtraceinterval)训练小鼠并与延迟条件反射对比音调记忆。图Ib示出痕迹间隔对于时间记忆形成的作用。30秒或更长的痕迹间隔导致对于音调CS的长期记忆不佳(5、15、30、60、100和120秒的延迟条件反射和痕迹间隔分别为η=29、η=20、η=25、η=18、η=28、η=16和η=12)。事实上，如果CS与US之间的痕迹间隔是60秒或更长，则C57BL/6小鼠示出不佳的记忆(图lb)。实施例2训练后海马中Gprl2RNA水平为了评估情景记忆，使用最初为了评估CREB敲除小鼠记忆开发的标准化情景恐惧条件反射任务(Bourtchuladzeetal.，1994Cell79,59-68)0在训练当天，将小鼠置于条件反射室(MedAssociates,Inc.，VA)中2分钟，之后给予非条件刺激(US)，持续2秒的0.5mA足部电击。对于微弱训练(2个训练实验)，在电击之间以1分钟试验间隔重复两次US。对于强力训练(5个训练实验)，在电击之间以1分钟试验间隔给予5次足部电击(Bourtchouladzeetal,1998LearnMem5，365-374·)、(Scottetal，2002JMoINeurosci19，171-177)、(Tullyetal，2003NatRevDrugDiscov2，267_277)。使用自动化软件包进行训练(MedAssociates,Inc.,VA)0在最后一个训练实验后，将小鼠置于条件反射室中额外30秒，然后返回其自己笼子中。训练后24小时检测情景记忆。将小鼠置于相同训练室中，通过对僵直行为评分评估条件反射。僵直(freezing)定义为在5秒期间完全没有运动((FanselowandBolles,1979JCompPhysiolPsychol93，736-744.)、(Bourtchuladzeetal,1994Cell79,59-68)>(Bourtchouladzeetal,1998LearnMem5,365-374))全部检测时间持续3分钟。在检测每个实验对象之后，用75%乙醇、水对实验设备进行彻底清洁及干燥、通风。拍摄每个实验过程。所有实验者均为药物和训练条件双盲。设计所有行为实验并以平衡方式进行，意味着(i)每个实验条件均使用等量实验小鼠和对照小鼠；(ii)每个实验条件均重复多次，累加重复天数产生最终对象数目。拍摄每个期间的行进。在每个实验中，实验者不知道(不知情)在训练和检测期间对象的处理情况。使用软件包(StatView5.0.1；SASInstitute,Inc)通过Student's不成对t检验分析数据。除非特别指出，文中和图中所有数值均以平均值士标准差表示。对于痕迹条件反射训练，使用标准化小鼠情景恐惧条件反射设备(MedAssociates,Inc.,VA；(Bourtchuladzeetal.,1994Cell79,59-68)、(Bourtchouladzeetal.，1998LearnMem5,365-374)在训练当天，将小鼠置于条件反射室中2分钟，之后给予条件刺激(CS)，在75dB持续20秒的2800Hz音调。在该音调结束后60秒，给予动物0.5mA电击非条件刺激(US)2秒。先前的实验已经表明这个训练范式在C57BL/6小鼠中诱导不佳的痕迹恐惧记忆，且这种记忆可以通过CREB途径的增强剂而促进。在室内额外30秒之后，将小鼠返回其自己的笼子中。在检测每个实验对象之后，用75%乙醇、水对实验设备彻底清洁，并干燥和通风几分钟。在位于另一操作室内的新室内进行检测以避免情景条件反射的混淆影响。除去内部的条件反射室，用小鼠笼子代替。将不同颜色带子置于每个笼子的后面以彼此区分。交替使用三个不同笼子以降低对象之间气味污染的可能性。将30瓦的灯置于室内以保证训练和检测之间的照明差异。将笼子使用肥皂溶液而非乙醇进行清洁。每次检测以仅2分钟光照开始(pre-CS)，然后给予20秒音调(CS)，随后再仅光照30秒(post-CS)。以与训练期间相同方式，每次对一只小鼠在5秒期间的“僵直”评分，由避免此上述的情景条件反射。拍摄每个实验的进程。特异于听觉记忆的僵直应答的比例通过从CS僵直中减去preCS僵直(非特异性)而确定。在训练和检测后，收集小鼠海马组织。使用QIAgenRNeasy试剂盒(Qiagen)根据厂商指导进行各个RNA制备。使用TaqMan逆转录酶试剂盒(AppliedBiosystems)产生cDNA。使用AffymetrixGene芯片分析法分析cDNA，获得对初次实验小鼠的相对表达水平。通过Affymetrix芯片分析鉴别的在痕迹恐惧条件反射之后1小时的表达变化通过Nimble-芯片分析(NimbleGenSystems,Madison,Wl,USA)证实。通过Affymetrix-芯片分析鉴别的情景恐惧条件反射(5个训练实验)1小时后的表达变化通过另一个AfTy-芯片分析以及qPCR证实。表2比较时间点P值(ρ<0.05显著)|ES值pPCR相对定量Γ￥____练的与初次实验的)延迟条件反射的与~~6h0.0008-1.81~次实验的_____痕迹条件反射的与初10.0383NSUAqPCR验证~~0.70次实验的___\ig)__表2鉴定Gprl2作为海马中记忆调节基因。示出P值和ES值(Affymetrix基因_芯片分析)和对初次实验的相对表达(pPCR验证)实施例3使用Neuro2A细胞筛诜靶向Gprl2的siRNA实时PCR的表达谱表明Gprl2mRNA在小鼠和人CNS中表达，在周围组织中几乎无表达(图2)。Gprl2广泛存在于小鼠CNS中(图2a)，在丘脑、脑干和小脑中具有最高表达水平，这些脑区域参与摄食和感觉信息整合(丘脑)、运动控制(小脑)和自主功能(脑干)。高水平的Gprl2也在海马和新皮质中观测到，这是记忆形成的两个关键脑部区域(Fanselow2005JCompPhysiolPsychol93,736-744)这些结果与在小鼠CNS中原位杂交观测的结果相似(Ignatov2003JNeurosci23,907-914)在小鼠中，Gprl2表达在除了肝之外的大多数周围组织中低于检测水平。在人CNS中，Gprl2表达在海马、新皮质和小脑中最高(图2b)。与Gprl2最近同源的Gpr3和Gpr6存在于小鼠和人的CNS中(图2a/b)。然而，人CNS中Gprl2mRNA水平比Gpr3和6的高很多。这与在小鼠中的情况相反，其中在海马、丘脑和新皮质中Gpr6表达极为显著。体内级siSTABLEsiRNA(DharmaconInc.，Lafayette,USA)用于评估小鼠CNS中的Gprl2功能。对siRNA进行化学修饰以增强稳定性。21聚体siSTABLE非靶向siRNA用作对照。为了评估siRNA效力，使用siGENOMEsiRNA禾ΠDharmafect3(Dharmacon,Lafayette,USA)转染Neuro2A细胞。如针对海马组织所述，转染24小时后分离RNA及合成cDNA。每次处理进行三个单独的RNA制备和cDNA合成。对每次cDNA复制以一式两份确定靶mRNA水平，平均每个重复实验的ΔCT值(n=3RNA/cDNApreps；每个数值均代表两次qPCR确定的平均值)。鉴别了在体外有效降低Gprl2mRNA的三个siRNA(图3)。在处理24小时后，siRNA2使Gprl2mRNA水平降低为载体对照组的31%，选择其在体内评估Gprl2。Gpr12-2siRNA的体内级siSTABLEsiRNA得自Dharmacon(Lafayette，USA)。使用Neuro2a细胞在体外通过bDNA测定(QuantiGenebDNA测定试剂盒，Bayer)检测对Gprl2的一些未修饰的(siGENOME)siRNA。使用多成分合理设计算法(Reynoldsetal.，(2004).NatBiotechnol22，326-330)设计siRNA并通过BLAST检索控制对于Gprl2的特异性。选择如下siRNA进行进一步体内鉴定Gpt12siRNA2有义链GAGGCACGCCCAUCAGAUAUU;SEQIDNO7Gpr12siRNA2反义链UAUCUGAUGGGCGUGCCUCUU;SEQIDNO8非靴向siRNA有义链UAGCGACUAAACACAUCAAUU；SEQIDNO9非靴向siRNA反义链UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU；SEQIDNO10实施例4合成的Gorl2siRNA在小鼠中的体内输送动物和环境使用年轻成年(10-12周龄)C57BL/6雄性小鼠(Taconic，NY)。在达到时，将小鼠分组(5只)在标准实验室笼子中饲养，保持12:12小时光照-黑暗周期。实验总是在光照阶段进行。在手术插管之后，将小鼠单独圈养在单独的笼子中并饲养至实验结束。除了训练和检测时间，小鼠自由摄食和饮水。在与美国国立卫生研究院(NIH)的指导方针一致且由美国实验动物管理及使用委员会(theInstitutionAnimalCareandUseCommittee)许可的标准条件下饲养和繁殖小鼠。动物手术与siRNA沣射为了沣射siRNA，用20mg/kgAvertin麻醉小鼠并将33号导管双侧植入背侧海马(坐标:A=-1.8mm,L=+/-1.5mm，深度1.2mm)或者植入杏仁核(坐标:A=-1.58mm,L=+/-2.8mm，深度4.Omm)(FranklinandPaxinos,1997TheMouseBraininStereotaxicCoordinates)。在手术恢复后5-9天，为动物注射siRNA。将siRNA在5%葡萄糖中稀释为0.5μg/μ1并与6当量的22kDa线性聚乙烯亚胺(Fermentas)混合。在室温保温10分钟后，将2μ1通过经聚乙烯管与显微注射器连接的灌注管注入每个海马中。全部灌注程序需要2分钟，轻轻手持动物以使得应激(stress)最小化。在3天内共灌注3次siRNA(lμgsiRNA/海马/天)。siRNA介导的Gprl2敲低(knockdown)可导致海马结构损害。评估siRNA处理的脑的海马形态学。在行为实验后一天处死注射了siRNA的动物。将冷冻的脑切片成15μπι切片并用甲酚紫染色。在连续切片的照片上评估海马形态学。为了进行插管检验，为动物注射Ιμ甲基蓝染料，之后立即处死。将冷冻的脑切片成15μπ切片。利用显微镜确定染料染色的位置并对比(FranklinandPaxinos,1997TheMouseBraininStereotaxicCoordinates)。插管检验是在对于对象的处理不清楚的情况下进行的。在非靶向siRNA(图6a)与Gprl2siRNA处理的小鼠(图6b)之间海马形态学无明显差异。因此，Gprl2siRNA不导致脑形态学的任何明显改变。对于锥体细胞层的损害限于插管区域。注意，图6中可见的损害(中间部分)是由于除去海马插管引起的。其不代表海马形态学中实际手术导致的改变，其被认为是最小的损害且不影响实验对象的行为能力。为了证实siRNA在体内的靶敲低作用，在海马内用siRNA处理小鼠3天，在最后一次siRNA灌注后2天和3天确定Gprl2mRNA水平(图7)。为了评估体内Gprl2敲低，集合每组6只小鼠的注射siRNA的海马组织。使用QIAgenRNeasy试剂盒(Qiagen)根据厂商指导进行6次单独的RNA制备。使用TaqMan逆转录酶试剂盒(AppliedBiosystems)产生cDNA。使用ABIprism和SDS2.1软件对每次RNA/cDNA复制进行2个实时PCR反应。请求式ABI测定(AppliedBiosystems)用于检测Gpr12的mRNA水平。确定每个cDNA样品的平均CT值。然后将数据根据TATA结合蛋白(TBP)标准化并确定ACT值。根据非靶向对照siRNA处理的对照组标准化mRNA水平。当与非靶向对照siRNA(η=6)对比时，在处理后2天Gprl2siRNA(η=6)显著降低海马Gprl2的mRNA水平(ρ<0.01)。在处理后3天，Gprl2siRNA无显著作用，表明Gprl2mRNA敲低是短暂的(ρ=0.25)。这些结果证实siRNA在体内降低海马中Gprl2mRNA。然而，靶mRNA和蛋白质水平也许受到Gprl2siRNA的不同影响。在siRNA处理后，Gprl2的实际蛋白质水平可以极大程度降低且持续较长时间。实施例5:siRNA介导的Gprl2敲低,对情景和痕迹条件射的影口向为了评估情景记忆，使用最初为了评估CREB敲除小鼠记忆而开发的标准化情景恐惧条件反射任务(Bourtchuladzeetal.，1994Cell79，59-68)。在训练当天，将小鼠置于条件反射室(MedAssociates,Inc.，VA)中2分钟，之后给予非条件刺激(US)，持续2秒的0.5mA足部电击。对于微弱训练(2个训练实验)，在电击之间以1分钟试验间隔重复两次US。对于强力训练(5个训练实验)，在电击之间以1分钟试验间隔给予5次足部电击(Bourtchouladzeetal,1998LearnMemJ，365-374·)、(Scottetal，2002JMoINeurosci19，171-177)、(Tullyetal，2003NatRevDrugDiscov2，267_277)。使用自动化软件包进行训练(MedAssociates,Inc.,VA)。在最后一个训练实验后，将小鼠置于条件反射室中额外30秒，然后返回其自己笼子中。训练后24小时检测情景记忆。将小鼠置于相同训练室中，通过对僵直行为评分评估条件反射。僵直定义为在5秒期间完全没有运动((FanselowandBolles,1979JCompPhysiolPsychol93，736-744.)、(Bourtchuladzeetal,1994Cell79,59-68)>(Bourtchouladzeetal.,1998LearnMem5,365-374))全部检测时间持续3分钟。在检测每个实验对象之后，用75%乙醇、水对实验设备进行彻底清洁及干燥、通风。拍摄每个实验。所有实验者均为药物和训练条件双盲。设计所有行为实验并以平衡方式进行，意味着(i)每个实验条件均使用等量实验小鼠和对照小鼠；(ii)每个实验条件均重复多次，累加重复天数产生最终对象数目。拍摄每个期间的行进。在每个实验中，实验者不知道(不知情)在训练和检测期间对象的处理情况。使用软件包(StatView5.0.1；SASInstitute,Inc)通过Student's不成对t检验分析数据。除非特备指出，文中和图中所有数值均以平均值士标准差表示。首先研究情景记忆中海马Gprl2的功能。将非靶向siRNA(η=19)或Gprl2siRNA(η=20)注入小鼠海马中。在最后一次注射siRNA之后3天，用设计的情景条件反射范式训练动物以诱导弱情景记忆(Scottetal.,2002JMoINeurosci19，171-177.)、(Tullyetal，2003NatRevDragDiscov2,267-277)在训练24小时后，Gprl2DM-2siRNA处理的动物证实显著增强的情景记忆(24小时记忆p<0.05，图4a)。接下来研究杏仁核中Gprl2对于情景记忆形成的功能。在小鼠杏仁核中灌注非靶向siRNA(η=20)或者Gprl2siRNA(η=21)并检测情景记忆。正如海马中Gprl2敲低一样，在训练后24小时，Gprl2siRNA处理的动物证实显著增强的情景记忆(24小时记忆:p<0.01，图4b)。有4只小鼠由于错误插管而排除在该分析之外(2X非靶向siRNA，2XGpr12-2siRNA)。对于痕迹条件反射训练，使用标准化小鼠情景恐惧条件反射设备(MedAssociates,Inc.,VA；(Bourtchuladzeetal.,1994Cell79,59-68)、(Bourtchouladzeetal.，1998LearnMem5,365-374)在训练当天，将小鼠置于条件反射室中2分钟，之后给予条件刺激(CS)，在75dB持续20秒的2800Hz音调。在该音调结束后60秒，给予动物0.5mA电击非条件刺激(US)2秒。先前的实验已经表明这个训练范式在C57BL/6小鼠中诱导不佳的痕迹恐惧记忆，且这种记忆可以通过CREB途径的增强剂而促进。在室内额外30秒之后，将小鼠返回其自己的笼子中。在检测每个实验对象之后，用75%乙醇、水对实验设备彻底清洁，并干燥和通风几分钟。在位于另一操作室内的新室内进行检测以避免情景条件反射的混淆影响。除去内部条件反射室，用小鼠笼子代替。将不同颜色带子置于每个笼子的后面以彼此区分。交替使用三个不同笼子以降低对象之间气味污染的可能性。将30瓦的灯置于室内以保证训练和检测之间的照明差异。将笼子使用肥皂溶液而非乙醇进行清洁。每次检测以仅2分钟光照开始(pre-CS)，然后给予20秒音调(CS)，随后再仅光照30秒(post-CS)。以与训练期间相同方式，每次对一只小鼠在5秒期间的“僵直”评分，由避免此上述的情景条件反射。拍摄每个实验的进程。特异于听觉记忆的僵直应答的比例通过从CS僵直中减去preCS僵直(非特异性)而确定。研究了海马Gprl2在痕迹恐惧记忆中的功能。如情景条件反射所述，在小鼠海马中灌注非靶向siRNA(η=20)或者Gprl2siRNA(η=23)。当用一组CS/US配对和60秒痕迹间隔训练时，Gprl2DM-2siRNA处理的动物证实显著增加的痕迹条件反射(CS-preCS:p<0.01，图5)。重要地，Gpr12siRNA而非对照siRNA处理的动物增加其对于呈现的音调CS的僵直应答。因此，与情景条件反射相似，siRNA-介导的海马Gprl2敲低促进痕迹条件反射。在痕迹恐惧条件反射期间，Gprl2siRNA不显著影响即时僵直(immediatefreezing)(非靶向siRNA3.3士1.5%；Gprl2siRNA5.1士1.6%；ρ=0.44；数据未示出)。综合这些结果示出Gprl2在海马和杏仁核中均是记忆形成的负调节物，这是小鼠以及人记忆形成中关键的两个颞叶结构。重要地，Gprl2siRNA诱导“功能增益(gainoffunction)”(即记忆形成增强)。这种对于行为可塑性的作用不太可能是由Gprl2siRNA的副作用诱导的。因此，Gprl2是海马和杏仁核中记忆的关键调节物。实施例6:Gprl2敲除小鼠Gpr12敲除小鼠Gpr12敲除小鼠得到Deltagen(SanCarlos,CA94070，U.S.A)许可。通过雄性Gprl2+/_小鼠与雌性C57B1/6小鼠(TaconicFarms,USA)繁殖产生优势C57B1/6背景(C57B1/6中5次回交)中杂合Gprl2K0小鼠(称作Gpr12+/"小鼠)以及WT同窝出生的对照小鼠。通过聚合酶链反应确定小鼠基因型。将性别平衡的3-6月龄的雄性和雌性小鼠用于行为分析。评估Gpr12+/-小鼠海马中Gpr12和对照mRNA水平海马分离自Gpr12+/-小鼠(n-3)、Gprl2-/_小鼠(η=2)和WT同窝出生的对照小鼠(η=3)。使用QIAgenRNeasy试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用TagMan逆转录酶试剂盒(AppliedBiosystems)产生cDNA。使用请求式ABI测定(AppliedBiosystems)确定Gprl2、Crebl和Grinl的mRNA水平并根据TATA结合蛋白(TBP)标准化。新目标识别训练与检测手持动物3-5分钟，进行3天。在训练前一天，将各个动物置于位于暗光房间的训练设备中(Plexiglas箱，L=48cm,W=38cm,H=20cm)，使其习惯环境15分钟(也见Bourtchouladze,2003所述)。在习惯环境后24小时开始训练。将动物置于含有两个相同目标(例如小圆锥形目标)的训练箱中，使其探查这些目标。将目标置于箱子中心区，在对象之间均衡目标的空间位置(左-右侧)。训练动物10、15或20分钟。将花费少于2秒探查的小鼠从该分析中排除。为了检测长期记忆保持，在训练后24小时观测小鼠10分钟。为了检测短期(转录非依赖性)记忆，在训练后3小时观测小鼠10分钟(Bourtchouladze,2003)。为动物呈现两个目标，一个目标在训练期间使用，-并因此是“熟悉的”，另一目标是新的(例如小锥形目标)。确定目标记忆指数为((新探查-熟悉探查)/总探查X100)。为了控制对于探查的非特异性作用，也计算检测期间总探查时间。为了保证辨别目标无气味差异，在每次实验后，用90%乙醇彻底清洁设备和目标、干燥并通风几分钟。开场(Openfield)这是测量动物运动活件和探杳件的常用检测方法(Logue，1997，Barad，1998)。在开始检测之前1小时将动物从一般动物居处移至实验室中。与先前所述(Barad，1998)相似地进行实验。将小鼠置于标准开放场所中，使用计算机跟踪系统(EthoVisionbyNoldus,Inc.，VA)观测30分钟。两个箱子同时进行，对动物行进距离(步行)和直立行为评分。在各个动物实验之间，用75%乙醇彻底清洁设备、干燥并通风几分钟。由不知情的实验人员进行实验，对每个实验的行进均录像。量化如下测量1)在开放场地的水平活动(步行)，2)垂直活动(直立)。表3示出结果证实Gprl2是海马中记忆调节基因。图中示出Affymetrix基因-芯片分析的P值和delta(相对表达的log2)。痕迹条件反射数据通过Nimble-芯片分析独立地证实。情景条件反射数据通过重复Affymetrix-芯片及通过qPCR证实。表3比较时间点P值(p<0.05限制性)|Delta(l0g2值)证实痕迹条件反射的~~0.033-0.14Nimble-芯片次实验的(笼养)_____情景条件反射与初次Ih0.0003-0.28Affy-芯片，qPCR实验(笼养)_____Gprl2在杂合KO小鼠(Gprl2+/_小鼠)中的慢性抑制作用siRNA数据表明在完整的成年小鼠中Gprl2的急性抑制作用促进长期记忆。为了检测Gprl2的慢性系统性广泛的抑制作用对于长期记忆的影响，分析Gprl2+/_小鼠。先前已经分析了纯合Gprl2敲除小鼠(Gprl2-/_小鼠)。纯合敲除小鼠呈现出削弱的运动、削弱的在Rotarod上的运动能力、在莫里斯水迷宫(MorrisWaterMaze)中削弱的运动功能和学习(游泳)能力、痛觉过敏(hyperanalgesia)，且其示出肝肾疾病的迹象(专利申请WO2005/027628,Carlton,2005)。另一项研究证实纯合Gprl2敲除小鼠发生血脂异常和肥胖(BjUrSell，2006)。总之，这些发现示出纯合Gprl2敲除小鼠具有许多一般性和发展性诱导的健康问题。预期在这些突变体中由于一般健康问题而发生认知功能削弱。虽然未获得关于杂合Gprl2K0小鼠(Gprl2+/_)的数据，但是从先前的这些研究(Carlton,2005；Bjursel1，2006)中预期在这些小鼠中长期记忆被削弱，尽管程度较纯合突变体低。然而，未曾预料的结果是在Gprl2+/_小鼠中长期记忆是否被加强。两个Gprl2等位基因在Gprl2-/_小鼠中均是无活性的，这些小鼠无可检测的Gprl2mRNA表达(WT对照组0%)，Crebl表达略降低，而Grinl水平正常(分别为81士1%和102士2%对照组；图8a)。两个Gprl2等位基因中仅一个基因在Gprl2+/_小鼠中是无活性的，这些小鼠呈现51士8%的WTGprl2mRNA0Gprl2mRNA水平因此与纯合敲除小鼠不同。在Gprl2+/_小鼠中，Crebl和Grinl的mRNA不受影响(分别为102士8%和101士4%;图8a)。通过甲酚紫染色对Gprl2+/_海马进行总体组织学分析未表明杂合突变体与WT对照之间的任何明显差异(图8b)。杂合Gwl2敲除小鼠Φ—般运云M舌件和开放场所探杳件讲行开放场所检测丨以检测是否如先前从纯合KO小鼠的结果中预期的那样Gprl2+/_小鼠中一般运动活性和探查性被削弱。测量开放场所中的水平活动(步行)，发现杂合突变体与WT小鼠之间运动活性无差异(所有时间点ρ>0.05；student'st-检验；图9a)。在Gpr12+/-小鼠和WT对照之间垂直活动(直立)也无差异(所有时间点ρ>0.05；student'st_检验；图9b)。这些结果表明在杂合Gprl2突变小鼠中运动活性和探查性是正常的。在杂合GDrl2敲除小鼠中新目标识别记忆目标识别是小鼠和大鼠的行为学相关任务，其非得自负性强化(足部电击)。这个任务依赖于啮齿动物探查其环境中的新目标而非熟悉目标的天然好奇心。显然，对于目标是“熟悉的”，则动物必须在之前已经经历其并记住。因此，具有较好记忆的动物将致力于并探查新目标而非熟悉目标。近来在人体中进行的神经影像学研究证实目标识别中的记忆包含前额皮层(Deibert，1999)，这是由于年老而受显著影响的结构(Hedden，2004)。对猴子和啮齿动物进行的其它研究提示海马在新目标识别中是重要的(Teng，2000；Mumby，2001)。因此，新目标识别提供了良好的行为学模型以评估药物_化合物对于与实验动物海马和皮质功能相关认知任务的影响。与情景和痕迹条件反射一样，目标识别的长期记忆依赖于训练条件(Bourtchouladze,2003)o为了建立保持对于目标识别训练的短期记忆而非长期记忆的条件，对与Gprl2突变小鼠相同遗传背景的WT小鼠(η=19)训练10分钟、15分钟或20分钟(图10)。当24小时后检测时，训练10分钟的小鼠示出对于新目标无优选性(记忆评分2.2士8.0)，而训练15分钟或20分钟的小鼠证实对于新目标的优选性(记忆评分训练15分钟和20分钟分别为21.0士7.0和34.3士4.9)。因此，10分钟的训练不足以诱导长期目标识别记忆。接着，检测Gpr12+/"(η=15)和WT同窝出生小鼠(η=16)中在训练10分钟后的长期目标识别记忆(图11)。当在24小时后检测时，Gprl2+/-小鼠而非WT对照小鼠证实长期目标识别记忆(记忆评分=WT小鼠与Gprl2+/"小鼠分别为6.0士8.2与28.7士4.9；P<0.05，student's不成对t_检验；图Ila)。训练(ρ=0.34)和检测(ρ=0.63)期间总探查性无差异，表明Gprl2+/_小鼠中长期记忆的促进不是由于探查活性的一般性增加所致(图lib)。在Gprl2+/_小鼠(η=6)和WT同窝出生小鼠(η_8)中也进行短期目标识别记忆(图12)。当在训练后3小时检测时，突变体与对照之间短期目标识别记忆相似(记忆评分=WT小鼠与Gprl2+/_小鼠分别为25.6士6.6与18.2士4.8;p=0,41,student's不成对t-检验；图12a)。在检测期间组间总探查性无差异(ρ=0.28;图12b)。重要地且与先前的研究(BOurtChOuladze，2003)—致的是WT小鼠证实在训练10分钟后目标记忆的显著短期保持。然而，仅Gprl2+/_小鼠示出长期保持(图11)，表明Gprl2的杂合敲低特异性增强长期记忆。因此，杂合Gprl2突变小鼠(具有一个功能性Gprl2等位基因)的运动活性和探查性不具有明显缺陷。对长期目标识别记忆的分析揭示了未曾预料的发现，即在杂合Gprl2敲除小鼠中长期记忆巩固是增强的。相反，短期记忆正常。这些发现与在海马和杏仁核中siRNA对Gprl2抑制作用之后的情景和时间记忆的促进是一致的。本说明书中用于阐明本发明背景以及在特定情况中提供关于实施的额外详细描述而提及的所有出版物、专利和专利申请在此以每个单独的出版物、专利或专利申请特定和单独并入参考的相同程度并入本文作参考。虽然结合优选的实施方案特别揭示和描述了本发明，但是本领域技术人员理解在不偏离所附权利要求书包含的本发明范围的前提下可以对本发明进行各种改变。权利要求一种包括给哺乳动物施用有效量的调节哺乳动物中Gpr12活性的药剂的方法。2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是成年哺乳动物。3.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。4.权利要求1的方法，其中所述施用导致长期记忆形成调节。5.权利要求4的方法，其中长期记忆形成被增强。6.权利要求4的方法，进一步包括检测所述长期记忆形成中的所述调节作用。7.权利要求6的方法，其中所述调节作用的所述检测是检测对海马依赖性认知任务的调节作用。8.权利要求6的方法，其中所述调节作用的所述检测是检测对杏仁核依赖性认知任务的调节作用。9.权利要求6的方法，其中所述调节作用的所述检测是检测对海马依赖性认知任务和杏仁核依赖性认知任务的调节作用。10.权利要求1的方法，其中Gprl2活性的调节包括调节哺乳动物中Gprl2蛋白表达。11.权利要求1的方法，其中所述施用导致认知功能增强。12.权利要求1的方法，进一步包括在足以使得特定认知任务的执行能力(performance)改良的条件下训练所述哺乳动物的步骤。13.权利要求12的方法，其中相对于在没有所述施用的条件下单独通过训练获得的所述认知任务的执行能力而获得执行能力增益。14.权利要求12的方法，其中所述训练包括多个训练期。15.权利要求12的方法，其中所述训练包括有间隔的训练期。16.权利要求12的方法，其中所述药剂在每个训练期之前和/或期间施用。17.权利要求1的方法，其中所述药剂包含一或多种有效量的Gprl2siRNA分子、有效量的生物学活性Gprl2反义片段和/或有效量的特异于Gprl2蛋白的抗体。18.一种方法，其包括如下步骤(a)将感兴趣的药剂导入表达Gprl2蛋白的宿主细胞中；(b)确定Gprl2功能，其中在(b)中确定的Gprl2功能与未施用所述药剂的(a)的宿主细胞中Gprl2功能相对比的差异鉴定所述药剂是能调节Gprl2功能的药剂。19.一种方法，其包括如下步骤(a)给哺乳动物施用调节Gprl2功能的药剂；(b)在足以在所述哺乳动物中产生长期记忆形成的条件下训练步骤(a)的哺乳动物和与其相同物种的未给予所述药剂的对照哺乳动物；(c)评估在步骤(b)中训练的哺乳动物中长期记忆形成；(d)对比步骤(c)中评估的哺乳动物中长期记忆形成，其中评估的施用所述药物的哺乳动物中长期记忆形成相对于评估的对照哺乳动物中长期记忆形成的差异确定所述药剂是能调节长期记忆形成的药剂。20.权利要求19的方法，其中所述哺乳动物是成年哺乳动物。21.权利要求19的方法，其中所述哺乳动物是人。22.权利要求19的方法，其中所述长期记忆形成是海马依赖性长期记忆形成。23.权利要求19的方法，其中所述长期记忆形成是杏仁核依赖性长期记忆形成。24.权利要求19的方法，其中所述长期记忆形成是海马依赖性和杏仁核依赖性长期记忆形成。25.权利要求19的方法，其中Gprl2活性的调节包括调节哺乳动物中Gprl2蛋白表达。26.权利要求19的方法，其中所述训练包含多个训练期。27.权利要求19的方法，其中所述训练包含有间隔的训练期。28.权利要求19的方法，其中所述药剂在每个训练期之前和/或期间施用。29.权利要求19的方法，其中所述药剂包含一或多种有效量的Gprl2siRNA分子、有效量的生物学活性Gprl2反义片段和/或有效量的特异于Gprl2蛋白的抗体。全文摘要本发明提供了筛选药剂的方法，所述药剂具有调节长期记忆形成、海马依赖性认知任务执行能力或Gpr12功能的能力。本发明也提供了通过调节Gpr12-依赖性蛋白质表达从而调节长期记忆形成或者海马依赖性认知任务执行能力的方法。本发明进一步提供了通过抑制Gpr12功能治疗长期记忆形成缺陷的方法以及通过抑制Gpr12功能治疗海马依赖性认知任务执行能力缺陷的方法。文档编号A61K31/70GK101808647SQ200880023965公开日2010年8月18日申请日期2008年5月15日优先权日2007年5月15日发明者M·彼得斯,R·E.·M.·斯科特,T·P.·塔利申请人:海利空医疗公司