专利名称：早期预测术后认知功能障碍的MicroRNA 572试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及医学生物检测技术领域，是一种早期预测术后认知功能障碍的MicroRNA-572试剂盒及检测方法。
背景技术：
术后认知功能障碍(Post-operativeCognitive Dysfunction, POCD)是老年患者术后常见的并发症之一(参见文献Baranov, D. , et al. Consensusstatement:First International Workshop on Anesthetics and Alzheimer ' sdisease. Anesth Analg, 2009，108(5):1627-1630. Rohan D, Buggy DJ,Crowley S,LingFK, Gallagher H, Regan C, Moriarty DC. Increased incidence of postoperative cognitive dysfunction 24 hr after minor surgery in the elderly. Can JAnaesth. 2005; 52 (2) : 137-142.)。据术后认知功能障碍国际性多中心研究(ISPOCD)报道，60岁以上行非心脏手术的全麻患者，术后I周PO⑶的发生率为25. 8% (参见文献Rohan D,Buggy DJ, Crowley S，Ling FK, Gallagher H, Regan C, Moriarty DC. Increasedincidence of postoperative cognitive dysfunction 24 hr after minor surgery inthe elderly. Can J Anaesth. 2005; 52 (2) : 137-142)。据最近文献报道，老年患者行非心脏手术术后6周的PO⑶发生率为54. 3%，术后一年的发生率仍高达46. 1%(参见文献Monk，T.G.,et al.Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery.Anesthesiology, 2008, 108 (I) : 18-30)。POCD最常表现为精神错乱、焦虑、人格及记忆受损，少数病人甚至发生永久性认知功能障碍，发展为痴呆。术后认知功能障碍不仅延长患者住院时间、增加治疗费用，而且增加患者的死亡率(Steinmetz, J.，et al. Long-termconsequences of postoperative cognitive dysfunction. Anesthesiology, 2009, 110 (3):548-555),为家庭和社会带来沉重的负担。由于PO⑶多见老年术后患者，因此推测与老年认知障碍可能有类似的发生机制，然而认知障碍的研究迄今没有突破。迄今为止，并没有能够直接反应POCD的生物学指标。因此目前POCD的研究主要针对POCD的流行病学研究和诱发因素研究，但较少研究探讨其发生机制。由于目前POCD的诊断主要依靠临床表现，而缺乏特异性实验室指标，因此为临床工作带来很多不便，增加了误诊与漏诊。特别是对于POCD术前的预测更缺乏相应的指标，因此，从预防和治疗角度，急需寻找较明确的POCD生物学标记物。microRNA(miRNA)是一类长度约21 25碱基的非编码蛋白质单链小分子RNA，广泛存在于多细胞生物和病毒体内，主要通过核酸序列互补匹配结合到特定的靶mRNA上，抑制靶mRNA翻译过程或降解靶mRNA，是一种起负调控作用的分子。目前越来越多的研究显示，miRNA广泛参与了生物体多种生理过程，且相关研究报道也表明其表达及功能失调可能导致肿瘤发生、白血病以及病毒感染等多种病理现象。对于miRNA能否作为一种实验室无创性检测手段，目前更多的研究集中在对于癌症早期诊断方面。这一新兴研究领域仅仅在测定血清标志物上开始得到应用。已有实验证实，miRNA在血浆和血清中非常稳定，它们被有效保护以免接触RNases，在严酷环境条件下仍能保持稳定。因此，它们的稳定性使得其实际值与在病人身上得到的测试值吻合得很好。目前,对于miRNA的早期预测功能主要集中在肿瘤方面，比如Charles H. Lawrie等人证实弥漫性B细胞淋巴瘤病人的血清hsa-mir-21水平很高，后者与不复发存活率密切相关(参见文献 Lawrie CH, Gal S，Dunlop HM, et al. Detection of elevated levelsof tumourassociated microRNAs in serum of patients with diffuse large B—celllymphoma. Br J Haematol 2008;141:672-675)。Chen X 等人在细胞研究杂志上的报道对肺癌、结肠癌和糖尿病的患者血清miRNAs水平进行了分析，确定这些疾病都有其特异性的血清 miRNA 表型(参见文献 Chen X, Ba Y. Ma L, et al. Characterization of miRNAs inserum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res 2008;18:997-1006)。
至今未见miRNA-572作为PO⑶生物学标记物的报道，也未见一种用于检测血浆或血清中的hsa-mir-572含量，来早期预测术后认知功能障碍的试剂盒及其检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种早期预测术后认知功能障碍的MiCT0RNA 572试剂盒，以及检测方法。本发明人为了寻找参与PO⑶相关的血浆miRNA，利用miRNA芯片技术筛选了与PO⑶相关的miRNA。结果发现与患者术前相比miRNA. 572的表达具有显著差异。另有研究提不 miRNA-134 与记忆相关(参见文献 Gao J, Wang WY, Mao Yff, Graff J, Guan JS, PanL, Mak G, Kim D,Su SC, Tsai LH. A novel pathway regulates memory and plasticityvia SIRTl and miR-134. Nature. 2010，466 (7310) : 1105-1109.)。这些研究提示我们，miRNA与认知障碍有一定关系，提示血浆miRNA可能成为早期特异性潜在标记物。临床上PO⑶有相对明确的发病时间，为了寻找参与PO⑶相关的血浆miRNA，我们利用miRNA芯片技术筛选了与PO⑶相关的miRNA。结果发现与患者术前相比，PO⑶患者血浆中miRNA-572的表达明显降低。本发明人认为通过反转录聚合酶链式反应(PT-PCR)为基础技术，通过检测PO⑶患者中血浆miRNA-572的表达来实现早期诊断PO⑶是完全可行的。本发明的第一方面，提供了 MiCT0RNA 572在制备早期预测术后认知功能障碍的试剂盒中的应用。本发明的第二方面，提供了一种早期预测术后认知功能障碍的hsa-mir-572检测试剂盒，是通过检测血浆或血清中的hsa-mir-572分子含量的变化，监测或早期预测术后认知功能障碍的可能或进程，以便尽早采取措施或药物治疗，防止术后认知功能障碍发生或发展，进而防止转变成痴呆。本发明通过对术前认知功能正常患者血浆中hsa-mir-572的含量比较；术后未发生认知功能障碍者与术后认知功能障碍患者血浆中hsa-mir-572的含量比较；发现术后认知功能障碍患者血衆中hsa-mir-572含量明显低于术前认知功能正常的患者,约低于术前认知功能正常的患者群的5倍左右，这个结果显示了 hsa-mir-52的含量变化情况，可以作为术后认知功能的早期预测手段。本发明提供了一种早期预测术后认知功能障碍的hsa-mir-572检测试剂盒，该试剂盒由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的引物系统由特异性的hsa-mir-572反转录引物及Real-time PCR的上、下游引物组成，hsanir-572反转录引物为GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACTGGGCC (SEQ ID N0:1)；Real-time PCR 上游引物为GTCCGCTCGGC GGTGGCCCA (SEQ ID N0:2)；Real-time PCR 下游引物为AGTGCGAACTGTGGCGAT (SEQ ID N0:3)。本发明试剂盒的引物是根据已知的生物信息学查得hsa-mir-572的成熟体序列而设计的(详见http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/),包括其特异性的反转录引物、Real-time PCR的上下游引物均通过Primer 5引物设计软件设计。hsa-mir-572的成熟体序列⑶CCGCUCGGCGGUGGCCCA (SEQ ID NO:4)上述试剂盒的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和R N A酶抑制剂组成，扩增系统由SYBR Premix Ex Taq 试剂组成。本发明的试剂盒，具体组成如下A) hsa-mir-572 反转录引物(SEQ ID N0:1)，1 管，浓度10 μ M，100 μ I/管;B) Real-time PCR 上游引物(SEQ ID N0:2)，l 管，浓度10 μ M，100 μ I/管;Real-time PCR 下游引物(SEQ ID N0:3)，l 管，浓度10 μ M，100 μ I/管；C) Trizol reagent (总 RNA 提取试剂)，I 管，2000 μ I/ 管;D)氯仿，I 管，500 μ I/管；Ε)无水乙醇，I管，7ml/管；F) DEPC H20 (经焦炭酸乙二酯处理的纯水)，I管，1000 μ I/管G) dd H20 (双蒸水)，I 管，2000 μ I/ 管。使用本发明试剂盒监测或早期预测术后认知功能障碍，首先，将若干已知的术前认知功能正常病人编组，用本发明试剂盒分别检测术前认知功能正常病人、术后认知功能正常、术后认知功能障碍血浆中hsa-mir-572含量，以此作为对照的标准数据。再用相同的方法检测未知患者血清中hsa-mir-572含量,对照上述标准数据，即可初步确定该患者是否为术前认知功能正常病人、术后认知功能正常患者、术后认知功能障碍患者，以便作进一步检查确诊。本发明的第三方面，提供了上述早期预测术后认知功能障碍的hsa-mir-572检测试剂盒的检测方法，具体步骤如下按常规抽血取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血衆中的小RNA ;由反转录系统反转录hsa-mir-572成cDNA ;用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定hsa-mir-572含量。
图I :认知功能正常患者手术前后血浆中hsa-mir-572的含量检测；图2 :术后认知功能障碍患者手术如后血衆中hsa-mir-572的差异表达检测；
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例I :制备本发明的试剂盒(供一人用)本发明的试剂盒组成如下I.反转录引物I管，100 μ I/管浓度10 μ M反转录引物为GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACTGGGCC2. Real-time PCR 的上、下游引物各 I 管，100 μ I/管浓度10 μ M ;
上游引物为GTCCGCTCGGCGGTGGCCCA下游引物为AGTGCGAACTGTGGCGAT3.Trizol reagent I 管 2000 μ I/ 管4.氯仿I 管 500 μ I/ 管5.无水乙醇I管 7ml/管6. DEPC H20I 管 1000 μ I/ 管7. dd H2OI 管 2000 μ I/ 管。本发明根据已知的生物信息学查得hsa-mir-572的成熟体序列⑶CCG⑶CGGCGGUGGCCCA，其特异性的反转录引物、Real-time PCR的上下游引物均通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成。设计的引物序列如下(I)反转录引物
GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACTGGGCC (SEQ ID NO:I)(2) Real-time PCR 的上下游引物上游引物GTCCGCTCGGCGGTGGCCCA(SEQ ID NO:2)下游引物AGTGCGAACTGTGGCGAT(SEQ ID NO:3)制备包括下列组成成分的试剂盒总RNA提取试剂、氯仿、无水乙醇、特异性hsa-mir-572反转录引物(100 μ I/管浓度10 μ Μ)、特异性的hsa-mir-572上游引物(100 μ I/管浓度10 μ Μ)、下游引物(100 μ I/管浓度:10 μ M)、DEPCH2O (1000 μ I/管)、ddH2O (2000 μ I/ 管)DEPC H2O的配置用购买的DEPC(焦碳酸二乙酯)，纯度>99%，密度为I. 12g/ml，配置DEPC H2O0 IOOmlMiliQ纯水中加O. lmlDEPC，放在IOOml干烤过的容量瓶中静置4小时后高压灭菌，制成千分之一浓度的DEPC H2O,经检测不含RNase、DNase和proteinase。用来溶解合成的反转录引物，并作为反转录时的稀释用水。dd H2O的配置MiliQ纯水经高压灭菌后，配置成Real-time PCR用的dd H2O0特异性hsa-mir-572反转录引物通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPC H2O溶解，终浓度为10 μ Μ。特异性的hsa-mir-572上游引物通过Primer 5引物设计软件设计，由美国invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用dd H2O溶解，终浓度为10 μ Μ。实施例2 :本发明的试剂盒的检测一、采集血浆样本及样本准备由于血浆具有取材方便、无创伤性、连续检测的优点，因此从血浆中检测术后认知功能障碍生物标志物可以将预测术后认知功能障碍的转归提高到一个新的水平，从而达到早预防、早治疗的目的。
血浆样本在上海长海医院住院部部采集16例术前认知功能正常患者行骨科膝、髋关节置换，10例术后认知功能正常，6例术后认知功能障碍患者。根据美国精神病学协会诊断与统计指南(Diagnostic and Statistical Manual, DSM-IV)的定义，即无其他方面叙述的认知障碍(ICD :International Classification ofDiseases296. 5)。有神经精神系统疾病史；未经控制的高血压、糖尿病、肿瘤、血液病史；有长期应用精神活性药物或酒精史；心、肺、肝、肾功能不全；有认知障碍病史或术前MMSE评分异常的患者被排除。所有患者均无血液、肾脏、肿瘤等可能影响血清水平的疾病。入院后均经B超或CT检查排除癌症。样品收集收集约4ml病人的外周血放入含360 μ I EDTA的抗凝管中，静置约I小时。二、采集血浆样本的处理及提取其中的小RNA (I)血浆样本处理采集的外周血样品4°C离心两次，首先1600g离心lOmin，取上清，加入新的离心管中，再12000g离心lOmin，取上清，加入新离心管中。加Trizolreagent (Invitrogen 公司购买)，使 Trizol reagent :血衆=I :0.8 左右。(2)小RNA提取添加过Trizol reagent的样本摇晃混勻，放置冰上15min, IOOOg,4°C离心lOmin，取上清，分别放入经DEPC处理过的2ml EP管中。每管加入200 μ I氯仿，摇晃混匀，放置冰上IOmin左右，12000g、4°C离心15min，取上层水相。下面的步骤按照Applied Biosystems 公司购买的 mirVana miRNA Isolation Kit 中提取小 RNA 的步骤进行。使用Eppendorf紫外分光光度仪测定RNA的A260值和A260/A280的比值(I. 8-2. 2)，以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。三、miRNA的实时定量I.反转录成 hsa-mir-572 的 cDNA取富集液50ng为模板，以设计的特异性hsa-mir-572反转录引物进行反转录。按照 5 XPrime Scrip Buffer (for Real Time) 4 μ I、Prime S cript RT Enzyme Mix0. 5 μ KPrimeScript RT reagent Kit) (TaKaRa 公司)、hsa-mir-122 反转录引物 0. 5 μ I、富集的小RNA50ng、DEPC H20 (补充H20使总体积达到20 μ I)进行反转录。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后高压灭菌。2. Real-time PCR 定量 miRNA米用TaKaRa 公司的 SYBR Premix Ex Taq 试剂和美国 Applied Biosystems 公司的Step Plus One实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应Premix Ex Taqui ( 2 χ )10 μ
上游引物(10 μΜ)0.4 μ (终浓度0.2 μΜ)
下游引物(10 μΜ)0.4 μ1(终浓度0.2 μΜ)
ROX Reference Dye (50χ)0.4 μ!
反转录产物I μ
双蒸水7.8 μ
总体系20μ1经过预实验确立了 hsa-mir-572引物的合适退火温度,最终确定以下条件
权利要求
1.MicroRNA 572在制备早期预测术后认知功能障碍的试剂盒中的应用。
2.一种早期预测术后认知功能障碍的hsa-mir-572检测试剂盒，其特征在于该试剂盒是由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的引物系统由特异性的hsa-mir-572反转录引物及Real-time PCR的上、下游引物组成， hsa-mir-572反转录引物序列如SEQ ID NO: I所示， Real-time PCR上游引物序列如SEQ ID N0:2所示， Real-time PCR下游引物序列如SEQ ID N0:3所示; 其中的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和R N A酶抑制剂组成； 其中的扩增系统由SYBR Premix Ex Taq 试剂组成。
3.根据权利要求I所述的一种早期预测术后认知功能障碍的hsa-mir-572检测试剂盒，其特征在于该试剂盒具体组成如下 A)hsa-mir-572 反转录引物，I 管，浓度10 μ M，100 μ I/ 管； B)Real-time PCR 上游引物，I 管，浓度:10 μ M, 100 μ I/管； Real-time PCR 下游引物，I 管，浓度10 μ M，100 μ I/管；C)Trizol reagent, I 管，2000 μ I/ 管； D)氯仿，I管，500μ1/管； Ε)无水乙醇，I管，7ml/管;F)DEPC H20,1 管，1000 μ I/ 管;G)dd H20,1 管，2000 μ I/ 管。
4.一种根据权利要求2或3所述的早期预测术后认知功能障碍的hsa-mir-572检测试剂盒的检测方法，具体步骤如下 按常规抽血取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血衆中的小RNA ;由反转录系统反转录hsa-mir-572成cDNA ;用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定hsa-mir-572含量。
全文摘要
本发明涉及医学生物检测技术领域，是一种早期预测术后认知功能障碍的MicroRNA 572试剂盒及检测方法。目前还没有一种有效的方法来预测术后认知功能障碍，给临床上早期预测及治疗带来不便。本发明通过对术前认知功能正常患者、术后认知功能障碍患者血浆中hsa-mir-572的含量比较发现hsa-mir-572的含量变化情况可以作为术后认知功能障碍的早期预测手段。本发明提供一种早期预测术后认知功能障碍的hsa-mir-572检测试剂盒，该试剂盒包括反转录引物、Real-time PCR的上下游引物和扩增系统等，经临床试用，检测的准确率达85%左右，因此本发明试剂盒可用于早期预测术后认知功能障碍。
文档编号C12Q1/68GK102766696SQ201210289608
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者余喜亚, 刘善荣, 刘淑鹏, 毕晓莹, 邓小明 申请人:中国人民解放军第二军医大学