编码ncrna的超保守区域的制作方法

专利名称：编码ncrna的超保守区域的制作方法
编码NCRNA的超保守区域交叉引用相关申请本申请要求2007年8月3日提交的美国临时申请案60/963，329和2008年xxxxx 提交的PCT/US2008/XXXXX的权益，其全部公开内容明确地通过引用合并入本文。关于联邦政府支助的研究的声明本发明是在无任何政府支助的情况下进行的，因此政府在本发明中不具有权利。背景总体来说，癌症是美国和全世界范围内死亡率和发病率的重要来源。然而，癌症是 种类繁多的具有不同病因学的疾病。因此研究者未能开发涵盖几种类型以上的癌症的治疗 或诊断检测。例如，癌症与许多不同种类的染色体特征相关。一个这样的染色体特征是某些基 因的基因组结构的扰乱(perturbation)，例如肿瘤抑制基因的缺失或突变。基因扩增或启 动子激活(例如，通过病毒整合)、表现遗传修饰(例如，DNA甲基化的变化)和染色体易位 导致的原癌基因的激活也可引起癌症发生(cancerigenesis)。基因组结构中牵涉癌症的病 因学的此类扰乱称为“癌症相关基因组区域”或“CAGR”。染色体脆性位点是另一类牵涉癌症的病因学的染色体特征。染色体脆性位点是当 DNA合成在中期被干扰时显示异常高的缺口或断裂发生的基因组DNA的区域。这些脆性位 点被分类为“稀有的”或“普通的”。如它们的名称所暗示的，稀有脆性位点是不常见的。此 类位点与二或三核苷酸重复相关，可通过叶酸缺乏在中期染色体中诱导，并且以孟德尔方 式分离。示例性稀有脆性位点是脆性X位点。当在抑制DNA聚合酶的蚜肠霉素(aphidocolin)或5_氮杂胞苷存在的情况下培 养细胞时，显现普通型脆性位点。已鉴定了至少89个普通型脆性位点，在每一个人染色体 中发现至少一个这样的位点。因此，虽然对它们的功能了解甚少，但普通型脆性位点代表了 人染色体结构的基本组成部分。脆性位点的体外诱导导致增加的姐妹染色单体交换和高比率的染色体缺失、扩增 和易位，然而脆性位点在体内与染色体断裂点共定位。此外，在肿瘤细胞中研究的大多数 普通型脆性位点含有大的基因座内缺失或易位，已鉴定许多肿瘤在多个脆性位点中具有缺 失。因此染色体脆性位点在机制上参与产生许多通常见于癌细胞中的染色体损伤。所有恶性细胞在编码癌蛋白(oncoprotein)基因或肿瘤抑制基因的DNA基因座上 具有特殊的改变(Balmain等，2003 ；Wooster和Weber，2003)。该常见特征最近已被扩展至 包括一大类称为microRNA (miRNA)的非编码RNA(ncRNA) (Ambros, 2004)，所述RNA也参与 癌症的起始和进展(Calin 等，2002 ；Croce 和 Calin, 2005 ；Berezikov 和 Plasterk, 2005a ； Esquela-Kerscher 和 Slack，2006 ；Calin 和 Croce，2006a)。MiRNA 在转录和转录后水平上 影响基因表达的调控(Ambros，2003 ；Ambros, 2004) miRNA和其他类型的ncRNA在人肿瘤发生中的参与程度还不清楚。因此，存在对进一步研究癌症中发生改变的分子机制和信号转导途径的需要。存在对鉴定新型分子标记物和潜在治疗剂的另外的需要。
人基因组的超保守区域(UCR) (Bejerano等，2004b)也是在不同物种间几乎完全 保守的miRNA(Berezikov等，2005b)。例如，已显示miR-16_l/miR-15a簇的活性分子是慢 性淋巴细胞性白血病(CLL)的起始的必需参与者(Calin等，2005a)，并且在人、小鼠和大鼠 中完全保守，在10个已测序的灵长类动物物种的9个中高度保守(Berezikov等，2005b)。 比较序列分析已鉴定了许多高度保守的基因组序列。一些此类区域不产生翻译成蛋白质的 转录物，从而被认为是非基因的(non-genic)。已将不同的名称用于该类序列保守非基因 序列(CNG) (Dermitzakis 等，2005)、保守非编码序列(CNS/CNC) (Meisler，2001)、多物种保 守序列(MCS) (Thomas等，2003)或高度保守区域(HCR) (Duret等，1993)。UCR是位于基因区域内和基因区域间的保守序列的亚组(subset)。它们在人、大 鼠和小鼠基因组的直系同源区域之间是绝对保守的(100% ) (Bejerano等，2004b)。与其 他保守序列区域不同，53%的UCR被分类为非外显子的(non-exonic) (‘ N'，481个中256 个无编码蛋白质的证据)，而其他47%被指定为外显子的(‘E'，481个中111个与已知的 蛋白质编码基因的mRNA交叠)或可能外显子的(‘P'，481个中114个具有不确定的与蛋 白质编码基因交叠的证据)。非编码功能性基因组区域的大部分转录产物具有显著的RNA 二级结构并且是含 有其他具有功能性非编码意义的序列的簇的组成部分(Bejerano等，2004a)。UCR代表可 能具有功能但不编码蛋白质的一小部分人基因组，并且 一直以来被称为人基因组的“暗物 质(darkmatter)，，(Bejerano等，2004a)。由于高度的保守程度，UCR对于哺乳动物和其他 脊椎动物的个体发生(ontogeny)和种系发生(phylogeny)具有基本的功能重要性。这可 通过最近的发现在4亿多年前的总鳍鱼(lobe-firmed fish)和陆生脊椎动物中具有活性 并且在“活化石”腔棘鱼(coelacanth)中保持活性的来源于新型反转录子的远侧增强子和 超保守外显子来举例说明(Bejerano等，2006)。UCR的功能重要性的另外的实验证据基于具有靶向的突变的小鼠的分析。缺乏超 保守元件或高度保守序列的基因沙漠(gene desert)的兆碱基缺失(Megabase deletion) 导致产生明显无可检测表型的活小鼠(Nobrega等，2004)。相比之下，含有数个UCR的基因 沙漠(例如围绕人染色体13g21. 33上的DA CHI基因的两个基因沙漠)经显示含有远距离 增强子，它们中的一些由UCR序列组成(Nobrega等，2003)。虽然对癌症相关疾病的治疗进行了相当多的研究，但此类疾病仍然难以有效地诊 断和治疗。因此，在本领域存在对用于诊断和/或治疗癌症的改良的方法的需要。本发明 满足了这些需要，并且还提供了其他相关有利方面。发明概述本文中描述了 UCR在一大组人白血病和癌中的状态的全面基因组探询 (interrogation) 0我们调查了 UCR在各种正常样品和癌症样品中的基因组范围的表达，而且我们评 估了此类序列的基因组定位与已知的参与癌症的区域之间的关系。此外，我们鉴定了 miRNA在癌症相关UCR的转录调控中的功能性作用。本文中还描述了癌症系统中差异表达的UCR可改变恶性细胞的功能特征的证据。通过将这些数据与牵涉人肿瘤发生中的miRNA的精心建立的模型组合，本文还描 述了其中编码和非编码RNA的改变在恶性肿瘤的起始和进展中协同作用的模型。
在一个广泛的方面，本文中描述了区分人癌症的方法，其包括使用一个或多个转 录的超保守区域(T-UCR)表达特征谱，其中UCR的基因组定位与分析的癌症相关基因组元 件之间的相关性在统计学上是高度显著的并且与对于miRNA所报导的相关性相当。当根据附图阅读时，根据下列优选实施方案的详尽说明，本发明的各种目的和有 利方面对于本领域技术人员将变得显然。附图概述本专利或申请文件包含至少一个以彩色制成的图。具有彩色附图的本专利或专利 申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由Office提供。

图1A-1E.不同类型的UCR的转录特征图1A.显示不同UCR在正常组织中的表达的Northern印迹。在uc. 246 (E)和 uc. 269A(N)的情况下，长转录物的存在通过RACE克隆实验来确认。对于一些组织，获得一 式两份的样品以确认重现性。用TO进行标准化。左侧上的箭头显示已鉴定的转录物。图IB. T-UCR 291和73A的表达(针对18S rRNA进行标准化)通过在正常⑶5+/ CD19+淋巴细胞和恶性CLL样品中进行qRT-PCR(图)和微阵列分析(图下的标准化的数 字)来验证。对于qRT-PCR和微阵列数据的统计比较，P-值是显著的。各框代表对于正常 人(蓝色)和CLL患者(红色)所测量的表达的分布，框的末端界定了第25和第75百分 位数，直线表示中位数，条棒界定了第10和第90百分位数。图1C.在19个组织的1个或多个组织中表达的UCR的数目，如通过微阵列分析所 显示的；显示了 UCR类型(E，N，P)的数目。发现了 4种类型的转录遍在表达的UCR(在19 个不同组织的18或19个中)、在大部分组织(10至17个)中表达的UCR、在少数组织(2 至9个)中表达的UCR和组织特异性表达的UCR。图ID.在所有分析的组织中遍在转录(单向和双向地)的各UCR类型(E、N、P)的 百分数；各UCR类型的绝对数目示于框中。图1E.在来自3个不同供体的CD19+B细胞中有义或反义链UCR73、133和269(相 对于18S rRNA)的表达。有义/反义链特异性实时RT-PCR用于验证利用微阵列分析观察 到的UCR的链特异性表达；各图的下方是CDS+样品的微阵列结果的平均值+1-标准差。如 下命名微阵列探针有义基因组探针命名为“ + ”，而针对互补序列的探针命名为“A+”。图2A-2B.根据UCR表达的组织和肿瘤的层次聚类(Hierarchicalclustering)。使 用芯片的非外显子UCR进行的22个正常人组织(图2A)和133个白血病和癌症(图2A\B) 的无监督聚类(Unsupervisedcluster)。将组织类型(图2A)或癌症与白血病(图2B)良 好区分的一些T-UCR在右边展开。样品示于列中，T-UCR示于行中。与其在所有样品中的 中位表达相比，绿色标示的基因被下调，红色表示被上调，黄色表示无变化。组织和肿瘤的 完整UCR特征谱可见于图5和6中。图3A-3E. T-UCR代表miRNA的直接的靶(按出现的顺序，分别为SEQ ID No. 1_3、 2,4-8 禾口 2)图3A.互补T-UCR: miRNA的位点的实例。uc. 348: :miR_155配对显示为互补性水 平较低的实例，与其他4对相互作用配对的基因(对于所述配对的基因发现更高水平的互 补性)相比较。图3B.通过qRT-PCR测定的miR-155、uc. 160和uc. 346A在9个CLL患者中的表达的关系。来自4个不同个体的淋巴细胞用作正常对照。图3C.直接的miRNA: T-UCR相互作用。针对转染对照海肾萤光素酶标准化的萤 火虫萤光素酶表达的相对抑制。pGL-3 (Promega)用作空载体。以一式三份进行所有实验4 至 8 次。(η = 12-24)。图3D. MEG-Ol细胞中miR-155转染对uc. 160和uc. 346A的表达水平的作用。在 转染后0、24和48小时时通过qRT-PCR测量作用。图3E.显示mir-24-l与uc. 160以及miR-155与uc. 346A的表达值之间的散点图。 回归线显示两个基因之间的负相关性。相应的阵列探针的名称示于Y和X轴。两种探针都 识别miRNA基因的成熟形式。图4A-4D. T-UCR 73A(P)在结肠癌细胞中充当癌基因。
图4A.不同siRNA在C0L0-320细胞中的表达抑制作用。我们使用来自Dharmacon 的siRNA对照作为参照值。使用最有效的两个siRNA和4个不同的siRNA的混合物(包括 这两个最有效的siRNA)。图2B.在C0L0-320结肠直肠癌细胞中使用siRNA_uc73A减少uc. 73A(P)基因表 达的抗增殖作用。所有结果表示3个独立的一式三份实验的中位数。uc.73A(P)表达的水 平通过RT-PCR来测量。两个星号表示P <0.01的统计学上显著的作用，而一个星号表示 P < 0. 05的统计学上显著的作用。图4C. uc. 73A(P)的减少的水平(通过使用不同siRNA)导致增强的C0L0-329细 胞的细胞凋亡，如通过膜联蛋白-V染色测定所显示的。我们使用来自Dharmacon的siRNA 对照作为参照值。图4D.不同siRNA对uc. 73A(P)的抑制不影响SW620结肠癌细胞的存活。所有结 果代表3个独立的一式三份实验的中位数。图5.通过Northern印迹测定的人正常和恶性组织中的UCR表达。显示正常单核 细胞(MNC)和CLL样品中uc. 192 (N)和uc. 246 (E)的表达。用U6探针进行标准化。左侧 的箭头显示已鉴定的转录物。在凝胶图像下方的是来自微阵列实验的CLL和MNC样品中的 UCR的标准化的表达值的平均值；ρ-值来自ANOVA统计。图6.通过qRT-PCR测定的人正常和恶性组织中的UCR表达。通过qRT_PCR测定的 ⑶5+/⑶19+阳性淋巴细胞和人慢性淋巴细胞性白血病(CLL)样品中的相对基因表达。CLL 和⑶5+样品的UCR微阵列值示于图下方；ρ-值来自ANOVA统计。图7. 22个正常人组织的T-UCR表达特征谱。组织和UCR的聚类显示正常人组织 中独特的UCR表达模式。样品示于列中，T-UCR示于行中。与其在所有样品中的中位表达 相比较，绿色标示的基因被下调，红色表示被上调，黄色表示无变化。图8. 173个癌和相应的正常组织的T-UCR表达特征谱。将来自白血病和正常血细 胞的样品与上皮来源的癌和组织分开。样品示于列中，T-UCR示于行中。与其在所有样品 中的中位表达相比较，绿色标示的基因被下调，红色表示被上调，黄色表示无变化。图9.通过定量RT-PCR测定的不同结肠癌细胞系中的uc. 73A(P)基因的表达。正 常结肠中的表达代表4个不同样品的中位数值。我们使用β肌动蛋白来进行标准化。图10.在48小时时，siRNAl在C0L0-320和Sff-620细胞中对uc. 73A(P)的抑制。 在两种类型的细胞中都获得与对照SiRNA(Dharmacom)相比较相当的抑制水平。尽管如此，只在C0L0-320细胞中观察到生物学效应，其中当与正常结肠中的表达相比较时T-UCR过表 达大约2. 5倍。图11.通过轻微干扰而导致的uc. 73A(P)下调在C0L0-320细胞但非SW-620细胞 中诱导细胞凋亡。利用胱天蛋白酶_3测定在C0L0-320中获得的数据(上图)，其中发现凋 亡细胞显著增加，在对照细胞SW620中获得的数据(下图)，其中未发现差异。C0L0-320表 达高水平的uc. 73A (P)，然而在SW620中，表达与正常结肠水平相当。图12-表1.白血病和癌症中最显著差异表达的UCR。图13-表2.混合效应泊松回归产生UCR与目的区域的相关性。
图14-表3.其表达与CLL患者中差异表达的互补miRNA负相关的T-UCR。图15-表4. 22个人正常组织中的T-UCR的表达(3个组织是两份的，来自2个不 同的个体)。图 16-表 5.通过 ANOVA 分析(P < 0. 005)鉴定的(GeneSpring GX 软件)在 CLL、 CRC和HCC中差异表达的T-UCR。图17-表 6. UCR 的基因组定位与 CAGR相关。(如(Be jerano 等，2004) ； (Calin 等， 2004)中的数据库)。图18-表7. CLL患者中miRNA与T-UCR的表达之间的负相关性。考虑以0. 01的 阈值或1 %的假阳性结果通过FDR法验证的所有的负相关性(R相关性低至0. 40)。实施方案的描述如本文中所用的，“CAGR”包括含有与正常DNA不同的且与癌症相关的遗传或表观 遗传变化(或遗传或表观遗传变化的潜能)的基因组DNA的任何区域。示例性遗传变化 包括单链和双链断裂(包括在可能的癌基因或肿瘤抑制基因中或其附近的常见断裂点区 域)；染色体异位；DNA中的突变、缺失、插入(包括病毒、质粒或转座子整合)和扩增(包括 基因复制)；暗示存在肿瘤抑制基因的最小杂合性丢失(LOH)区域；和暗示存在癌基因的最 小扩增区域。示例性表观遗传变化包括DNA甲基化模式的任何变化(例如，DNA超甲基化 或低甲基化，特别是在启动子区域中)。人基因组中许多已知的miR基因在CAGR中或其附近，包括正好位于与多种癌症相 关的最小LOH区域或最小扩增区域中的80个miR基因。其他miR基因位于断裂点区域、缺 失区域或扩增区域中或其附近。例如，与CAGR相关的癌症包括白血病(例如，AML、CLL、幼淋巴细胞性白血 病(pro-lymphocytic leukemia))、肺癌(例如，小细胞和非小细胞肺癌)、食管癌、 胃癌、结肠直肠癌、脑癌(例如，星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤 (medulloblastoma)、脑膜瘤、神经母细胞瘤(neuroblastoma))、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、 上皮癌、鼻咽癌(例如，口或喉鳞状细胞癌)、淋巴瘤(例如，滤泡性淋巴瘤)、子宫癌(例如， 恶性纤维组织细胞瘤)、肝癌(例如，肝细胞癌)、头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)、肾癌、雄 性生殖细胞肿瘤、恶性间皮瘤、骨髓增生异常综合征、卵巢癌、胰腺或胆管癌、前列腺癌、甲 状腺癌(例如，散发性滤泡性甲状腺肿瘤(sporadic follicularthyroid tumor))和尿路
(urothelial cancer)。如本文中所用的，“FRA”包括染色体中的任何稀有或普通型脆性位点；例如，可通 过在DNA复制期间使细胞经历胁迫诱导的FRA。例如，稀有FRA可通过在DNA复制期间使细胞经历叶酸缺乏来诱导。普通型FRA可通过在DNA复制期间用蚜肠霉素或5-氮杂胞苷处理 细胞来诱导。染色体脆性位点的鉴定或诱导在本领域技术人员的能力范围内；参见，例如， Arlt 等(2003) ,Cytogenet. Genome Res. 100 :92_100禾口Arlt 等(2002),Genes, Chromosomes and Cancer 33 :82_92，其全部公开内容通过引用合并入本文。大约20%的已知的人miR基因位于克隆的FRA中(13个miR)或其3Mb (22个miR) 内。实际上，脆性位点内的miR基因的相对发生率比非脆性位点中的高9. 12倍。此外，在 研究人核型中的113个脆性位点后，发现61个miR基因位于与FRA相同的染色体条带中。例如，与FRA相关的癌症包括膀胱癌、食管癌、肺癌、胃癌症、肾癌症、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、尤文肉瘤(Ewingsarcoma)、血液肿瘤(hematopoietic tumors)、实体 瘤和白血病。下列实施例用于例证本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，随后的 实施例中公开的技术代表了本发明者发现的在本发明的实施中行之有效的技术，从而可被 认为构成本发明实施的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，可在公 开的特定实施方案中进行许多改变并且依然获得相同或相似的结果，而不背离本发明的精 神和范围。实施例1基因组范围的特征谱分析揭示超保守区(UCR)在正常人组织中的广泛转录。为了研究UCR在人癌症中的参与状况，我们通过Northern印迹法、定量 PCR(qRT-PCR)和微阵列分析了 481个长度在200bp以上的基因组区域(Bejerano等， 2004b)。外显子(E)和非外显子(N)UCR探针在大范围的长度上检测来自不同正常组织的 转录物(以有义或反义-A，方向)(图IA和图5)。两个转录物的长度通过克隆cDNA (利用来自正常人结肠的外显子uc. 246 (E)和来 自正常人骨髓的非外显子uc. 269A(N)的5'-和3' -RACE)来确认。这两个cDNA中均不 包含有效长度的开放阅读框架(ORF)，从而确认它们可能是非蛋白质编码性质的。我们称 为非编码超保守基因nc-UCG的此类非剪接的全长cDNA的长度是可变的(对于超保守基因 UCG. 246为大约0. 8kb，对于超保守基因UCG. 269A为大约1. 8kb和2. 8kb)。此类nc-UCG的转录可始于富含多腺嘌呤的基因组区域，如最近对来自小鼠的几 个长ncRNA所提及的(Furuno等，2006)。我们使用微阵列分析，然后通过qRT-PCR和Northern印迹确认比较了来自正常和 患病组织的几个UCR的转录水平。正常⑶5+/⑶19+淋巴细胞中uc. 291 (P)和uc. 73A(P) 的表达显著高于CLL细胞中的表达(P < 0. 05)(图1B)。已在不同的研究中验证了使用该 微阵列平台获得的数据(Calin 等，2005a ；Yanaihara 等，2006 ；Volinia 等，2006)。将独立的两组正常⑶5细胞包括在微阵列和定量RT-PCR实验中的事件增强了 我们的数据的说服力。当在CD5/CD19阳性B细胞和恶性B细胞的两个不同的组中利用 qRT-PCR和微阵列来研究uc. 291 (P)和uc. 73A(P)时，由两种测定检测到的差异表达在统计 学上是显著的(图1B)。此外，qRT-PCR和Northern印迹(分别11个和6个UCR)产生与微阵列结果一致 的结果(图5和图6)。
通过使用微阵列分析，我们发现大多数转录的UCR(在本文中称为T-UCR)以遍在 和组织特异性的方式在正常人组织中表达(图1C)。大约34%的推定的T_UCR(325/962)在所有19个组织样品具有强度高于背景(计 算为空白点的平均信号+2 SD)的杂交信号。在B细胞中发现最大数目的T-UCR，然而在卵 巢中发现最低数目。大约93%的UCR(962个中的890个)在至少一个样品中表达高于背 景，从而我们将这些UCR当作T-UCR。3种不同类型的UCR以相似的频率转录41 %的外显 子UCR、33%的可能的外显子UCR和30%的非外显子UCR。微阵列平台以有义和反义方向包含推定的T-UCR。在所有分析的正常 组织中，962 个UCR中有84个(9% )是双向转录的，而241个只从一条链转录(图1D，图IE和表4)。由于基因组DNA的痕量污染可能妨碍通过微阵列分析进行的双向转录的鉴定，因 此我们将uc. 269 (N)、uc. 233 (E)和uc. 73 (P)的微阵列结果与链特异性qRT-PCR的结果相 比较。在所有3种情况下，数据是一致的，显示来自1条链的优势转录(图1E)。要指出的是，在所有19个组织中表达的156个非外显子T-UCR中，92个(大约 60%)是基因间的，而64个是基因内的。在后者中，与宿主基因相比较，37个以反义方向存 在，这表明大约83% (129/156)的非外显子T-UCR不代表已知的宿主基因的长前体转录物 的基因内转录(intronic transcription)，但代表真实的独立的非编码转录物。与miRNA —样(Liu等，2004)，我们在造血组织(由B淋巴细胞、T淋巴细胞和单核 细胞代表，各自从两个健康个体收集)和非造血组织中进行了 T-UCR表达的层次聚类。将 来自不同个体的相同类型的组织聚类为最近邻(closest neighbor)(图2A和图7)。这些发现表明，UCR在大部分情况下代表了正常人组织中的非编码转录物，并且这 些T-UCR的表达是组织特异性的。人白血病和癌症中的独特UCR特征由于已广泛地描述了蛋白质编码基因和miRNA在癌细胞中的大范围的基因表达 变化(Esquela-Kerscher 禾口 Slack，2006 ；Calin 禾口 Croce，2006a ；Calin 禾口 Croce，2006b ；Lu 等，2005)，因此我们研究了 UCR在一组173个样品(包括133个人癌症组织和40个相应的 正常组织)中的表达。样品的层次聚类显示，不同类型的癌症按照它们的发育来源产生不同的聚类白 血病(CLL)和正常造血组织分别从结肠直肠癌(CRC)和肝细胞癌(HCC)以及它们的正常对 应物分支而来(图8)；此外，特定类型的UCR似乎在肿瘤类型中差异表达(图2B)。因为不同的组织具有特定的UCR特征，因此该聚类模式可以是肿瘤的不同组织特 异性来源的结果。因此，我们比较了相同来源的正常和肿瘤细胞之间的UCR表达。在962 个可能的T-UCR中，88个(9. )以统计学上高度显著的水平(P < 0. 005)在至少一种类 型的癌症中差异表达(表1和表5)。我们发现与相应的正常组织中的表达相比较在癌症中被下调和上调的T-UCR。通 过将各癌症类型与相应的正常组织相比较，我们发现CLL特征由19个UCR (8个被上调和11 个被下调)组成、CRC特征由61个UCR(59个被上调和2个被下调)组成以及HCC特征由8 个UCR (3个被上调和5个被下调)组成(表5)。18个特征转录物是外显子UCR(20% )，28个是可能的外显子UCR(32% )以及42 个是非外显子UCR(48% )。在18个外显子T-UCR中，9个代表已知的宿主蛋白质编码基因转录物的反义方向。从而我们证明了 T-UCR表达特征谱可用于区分人癌症。UCR通常位于脆性位点和牵涉癌症的基因组区域我们将UCR的基因组定位与之前报导的在人肿瘤中鉴定的非随机遗传改变和如 所描述的克隆的脆性位点(FRA)的基因组定位相比较(Calin等，2004b)。我们使用之前报 导的一组186个miRNA (Calin等，2004b)和一组297个锌指蛋白质编码基因(ZNF) (genome, ucsc. edu)(熟知的显示与癌症相关的转录因子家族(Huntley等，2006))。我们之前报导了 miRNA基因通常位于FRA位点、HOX基因簇和牵涉癌症 的基因组区 域例如最小杂合性丢失区域(LOH)和最小扩增区域(统称为癌症相关基因组区域(CAGR)) (Calin 等，2004b)。通过使用高分辨阵列比较基因组杂交(aCGH)，最近的研究确认了 miRNA基因座在 人癌症中以高频率展示基因组改变(Zhang等，2006)。此外，通过分析NCI-60细胞系中的 miRNA表达，另一个小组发现候选肿瘤抑制基因和致癌miRNA位于CAGR中(Gaur等，2007)。在本文中，我们显示UCR的基因组定位与分析的癌症相关基因组元件之间的相关 性在统计学上是高度显著的并且与对于miRNA所报导的相当。ZNF转录因子未显示与任何 分析的目的区域的任何显著相关性(表2和表6)。对于更小的参与RNA剪接的蛋白质编码基因的家族(80个基因，数据未显示)相 似地不存在相关性。例如，UCR或miRNA与最小LOH区域对非缺失基因组区域的相关性的 概率在两种情况下都低于0. 001 (分别地，IRR为2. 02和4. 08)。我们使用通常存在于FRA 位点中的人乳头状瘤病毒16 (HPV 16)整合位点作为内部对照。如果UCR与FRA显著相关， 那么我们预期发现与HPV 16整合位点的相关性。这正好是我们对于UCR和miRNA而非对 于ZNF蛋白质编码基因(表2)或参与RNA剪接的蛋白质编码基因(数据未显示)所观察 到的。另外的数据举例说明了 UCR的基因组定位的重要性。首先，我们发现，当与所有其 他UCR(189个中的97个对292个中的71个)相比较时，遍在表达的T-UCR(图IC中，在18 或19个正常组织中表达)以明显更高的频率位于CAGR中(P < 0. 005，Fisher精确检验)。 第二，在人癌症中差异表达的T-UCR位于与该类型的癌症特异性相关的CAGR中。例如，染 色体区域13g 21. 33-g22. 2与对家族性CLL的易感性相关(Ng等，2007)。在该间隔内，在 筛选的13个蛋白质编码基因的任一个基因中未发现突变。我们鉴定了位于该CAGR内的7个UCR(uc. 347至uc. 353)的簇。其中两个， uc. 349A(P)和uc. 352 (N)属于在正常和恶性B-CLL CD5阳性细胞之间差异表达的T-UCR。这表明，至少在该情况下，不是蛋白质编码基因而是UCR代表了位于CAGR内的“未 知的”肇事者(culprit)。这些数据一起提供了 UCR位于在恶变过程中发生改变的基因组 区域内的证据，并且表明T-UCR可能是癌症易感性的候选基因。通过与microRNA直接相互作用对T-UCR进行的负调节为了开始功能性表征一些参与人癌症的UCR，我们在相同组的上面研究的CLL 样品中进行了基因组范围的表达研究。我们发现5个UCR :uc. 269A (N)、uc. 160 (N)、 uc. 215 (N)、uc. 346A(P)和uc. 348 (N)的特征能够区分之前通过70-kDa的zeta相关蛋白 (ZAP-70)的表达区别的两个主要CLL预后组群。这5个T-UCR在它们的表达水平上展示了与CLL中报导的miRNA表达特征负相关的变化(Cahn 等，2005a)(表 3)。然而不希望受理论束缚，本发明者现于本文中认为该发现产生了 miRNA与 T-UCR之间的复杂调控机制的可能性。我们通过序列比对发现，5个UCR中的3个 与13个特征m i RNA中的5个具有显著的反义互补性，从而产生6个可能的相互作 M M :uc. 160::rniR-24> uc. 160::miR-155> uc. 160::miR-223> uc. 160::miR-146a> uc. 346A::miR-155 和 uc. -348::miR_29b(图 3A)。在所分析的miRNA UCR对中，验证了对于miRNA mRNA相互作用所描述的 5'-末端“6碱基种子(base seed)”互补性规则；此外，3'-末端互补性的水平是可变 的高于60%的互补性(对于miR-24: :ucl60或miR-155: :uc. 346A对)至低于25%的互 补性(对于miR-155: :uc. 160对)。作为对照，当比较随机产生的5个UCR与13个miRNA 的组合时，有义和反义互补性不显著。通过针对来自独立组的CLL患者和正常对照的淋巴细胞的选择的T-UCR和miRNA 的qRT-PCR验证特定T-UCR与预测的相互作用miRNA (interactor miRNA)的微阵列表达值 之间的负相关性(图3B)。我们进行了 miRNA: :UCR相互作用(牵涉在CLL的攻击形式(Calin等，2005)、一 些淋巴瘤和癌(Eis等，2005 ；Kluiver等，2005 ；Volinia等，2006))中过表达的miR-155以 及在来自CLL患者的原始转录物中携带突变的miR-24-l和miR29_b (Calin等，2005a))的 体外测定。我们将UCR uc. 160 (N)、uc. 346A (P)和uc. 348 (N)克隆到萤光素酶报告基因 载体中以评估与miR-155、miR-24-l或miR-29-b的可能的直接相互作用。我们对4个 miR: T-UCR配对观察到萤光素酶表达的一致且可重现的减少，与体外发生的相互作用一致 (图 3C)。相比之下，uc. 348 (N)不与miR155相互作用(如通过萤光素酶测定表明的)，这是 与这两个基因在CLL患者中的正表达相关性和低序列互补性(图3A)相一致的结果。体内相互作用为了确定这些相互作用是否在体内发生，我们将miR-155转染入MEGOl白血病细 胞并且估量uc. 346A和uc. 160(两者在该细胞系中都良好地表达)的水平。在转染后24 小时，miR-155显著减少这两个T-UCR的表达水平；在48小时后，外源miR-155水平的减少 伴随着T-UCR表达的增加(图3D)。该可恢复效应支持特异性miRNA对T-UCR的调控。由于已证明“ZAP-70特征，，的 基因的该相互作用，我们研究所有miRNA与T-UCR在所有50个CLL患者的基因组范围水平 上的表达之间的相关性。有趣地，我们发现87个miRNA (在点在芯片上的235个miRNA中， 37% )与T-UCR的表达水平之间的显著负相关(以低于0. 01的假检出率(FDR))(表7)。此外，在相关基因中，我们鉴定了经实验证明相互作用的miR-24-l::uc. 160和 miR155: :uc346A(P)对(图 3E)。此外，在实验中不相互作用的miR-155和uc. 348不是该列表的成员。针对其鉴定 到阳性萤光素酶测定的其他可能的相互作用对是miR-15-a: :uc. 78和miR16: :uc. 78(数据 未显示)。因此，非编码T-UCR代表miRNA的可能的靶，并且此类相互作用对于癌症患者可 具有生物学和预后意义。
T-UCR可充当癌基因为了扩展T-UCR的功能特征，我们在癌症模型中检查了 uc. 73A(P)的生物学效应。 由于这是结肠癌中在统计学上最显著(P < 0. 001)上调的T-UCR之一，我们决定研究其在 表达高水平uc.73A(P)的C0L0-320结肠直肠癌细胞中下调的作用。我们使用其中该基因 的表达与正常结肠细胞无差别的SW620结肠癌细胞作为对照(图9)。两个小干扰RNA(siRNAl和siRNA3)以及4个siRNA的混合物(siRNApool)被设 计为靶向uc. 73A(P)并且被转染入C0L0-320和SW620细胞。在48小时(图4A和图10)、 72小时和144小时(数据未显示)后在用siRNA 1、3和混合物处理的C0L0-320细胞中 uc. 73A(P)的表达显著减少。对于SW-620细胞也发现相同的结果(图6)。C0L0-320细胞的生长在用特异性siRNA处理144小时后与未处理的(空)或 siRNA-处理的对照细胞相比较显著降低(P < 0. 05，在96小时时，和P < 0. 005，在144小 时时)(图4B)。相比之下，SW620对照细胞的增殖未发生显著变化(在96和144小时时，分别地P =0. 83和P = 0. 23)(数据未显示)。细胞周期研究显示，在C0L0-320细胞但非SW620细 胞中sub-Gl部分的细胞增加(表明凋亡细胞的存在，数据未显示)，该发现通过细胞凋亡特 异性膜联蛋白V测定(图4C和图4D)和通过胱天蛋白酶-3测定(图11)验证。此外，对细胞增殖和存活的作用的强度与siRNA产生的抑制的程度成正比(图4)。这些数据表明在结肠直肠癌中，uc. 73A(P)如癌基因一样通过增加恶性细胞数目 (作为减少的细胞凋亡的结果)来起作用。讨论根据分子肿瘤学的教导，癌症是牵涉肿瘤抑制基因和癌基因蛋白的遗传疾病 (Bishop, 1991 ；Hunter, 1991 ；Weinberg, 1991)。最近的发现强有力地支持 microRNA 参与 大多数分析的癌症的发病机理，并且为人癌症的分子体系结构(molecular architecture) 增加了新的一层复杂性(Calin 等，2002 ;Esquela-Kerscher and Slack, 2006 ；Calin ^P Croce, 2006a)。然而，MiRNA仅代表特定的一组参与人癌症的ncRNA。已显示，在前列腺癌 中反义基因内ncRNA水平与肿瘤分化的程度相关(Reis等，2005)并且MALAT-I ncRNA的表 达预示早期非小细胞肺癌的转移和存活(Ji等，2003)，从而暗示ncRNA与肿瘤生物学之间 的更深层的关联。为了明确地阐明该问题，我们在基因组水平上研究了全新的ncRNA种类，即转录 的非编码超保守区(T-UCR)。我们使用生物信息学工具来证明UCR位于在恶变过程中被靶 向的基因组区域中(这预示着其可能参与人肿瘤发生)。如现在本文中所显示的，我们能够通过RACE扩增来克隆相应于uc. 246(E)和 uc. 269A(N)的cDNA，只要UCR是被表达的并且可通过标准方法克隆的真实的基因(在本文 中称为nc-UCG)。各种表达技术(包括Northern印迹法、qRT_PCR和基因组范围的微阵列特征谱分 析)证明UCR频繁转录并且在人白血病和癌症中存在独特的特征。我们将注意力集中于慢 性淋巴细胞性白血病(西方国家中最常发生的成人白血病)(Chiorazzi等，2005)、结肠直 肠癌(工业化国家中最常见的癌症之一)(de la Chapelle, 2004)和肝细胞癌(在美国增 加最快速的癌症类型)(Wilson，2005)。
我们发现对于所有检查的肿瘤类型，当与相应的正常细胞相比较时，恶性细胞具 有独特的UCR表达谱，这表明T-UCR表达中的显著变化牵涉恶变过程。表征T-UCR的改变在人癌症中的功能意义不是繁琐的工作。可假设T-UCR的 许多推定的功能，包括对蛋白质编码基因或其他非编码RNA的反义抑制作用，或作为“非 特异性(aspecific) ”miRNA的作用，意指具有独特性的miRNA例如非常长的前体(例如 uc. 339 (P)，其具有为通常miRNA的两倍的前体长度)。几个UCR不像基因一样起作用并且 被发现具有如增强子一样的调控功能(Nobrega等，2003 ；Pennacchio等，2006)，然而其他 UCR代表了具有已知/未知癌症相关性的蛋白质编码基因的外显子的事实使该难题变得更 复杂。特别有趣的区域是在大约700kb中含有7个UCR的DA CHI基因座(Bejerano等， 2004b)。来自该区域的UCR中的3个在分析的癌症中差异表达，其中两个是CLL特征的成 员。在小鼠模型中大部分来自该基因座的经扫描的保守区域是增强子，包括在我们的研究 中不在任何分析的组织中表达的uc. 351 (N)。有趣地，未能具有增强子功能的仅有的两个区域是uc. 348 (N)和uc. 352 (N)，两者 都被分类为非编码性的并且两者在人癌症中都差异表达。进一步增加对此类特定T-UCR的 兴趣是由于发现该基因组区域与对家族性CLL的易感性相关并且已知的蛋白质编码基因 中没有一个发生突变(Ng等，2007)。最近发现，来自人基因组的非编码部分的数十bp的短片段(block)(称为pyknon) 存在于几乎所有已知的蛋白质编码基因内(Rigoutsos等，2006)。然而pyknon与UCR不同， 含有pyknon数目最多(4个)的超保守元件是uc. 73 (P)，我们发现其为在CLL和CRC中最 差异表达的T-UCR之一。这些吸引人的观察结果暗示着uc. 73 (P)对具有互补序列的编码 基因的可能的调控作用。通过进一步探索该T-UCR在人癌症中的参与情况，我们能够证明uc. 73⑵在结肠 癌中的致癌功能，因为其过表达的减少诱导了细胞凋亡并且特别地在异常表达该T-UCR的 结肠癌细胞中具有抗增殖作用。我们的发现另一种类型的ncRNA，T-UCR，在高百分比的分析的白血病和癌症中 在基因组水平上发生了一致的改变，支持其中编码和非编码基因参与人肿瘤发生并且在其 中协同作用的模型(Calin和Croce，2006b)。此外，CLL患者中UCR与miRNA的表达之间的相关性产生了其中两个或更多个类 型的ncRNA相互作用和影响表型的复杂功能调控途径的吸引人的可能性。我们还证明其中两个不同类型的ncRNA相互作用的miRNA: :T_UCR相互作用的存在。我们发现在高百分比的白血病和癌症中nc-UCG在基因组水平上发生了一致的改变，并且在白血病中可能与miRNA相互作用。该发现为其中编码和非编码基因参与人肿瘤 发生且在其中协同作用的模型提供了支持。实施例I实验方法A) RACE克隆和通过微阵列、qRT_PCR和Northern印迹法进行的表达分析DRACE 克隆使用设计用于扩增短产物的PCR引物的各种组合来分析6个UCR (uc. 47 (N)、uc. IlO(N)、uc. 192 (N)、uc. 246 (E)、uc. 269A (N)和 uc. 352 (N))在大脑、睾丸、骨髓、小肠、 结肠和肝组织中的表达。此类产物包括在微阵列分析中用于探针的40-聚体和全长大于 200bp的UCR序列。通过在5 ‘和3 ‘方向上快速扩增cDNA末端(RACE)来克隆两个UCR产 物，一个外显子uc. 246(E)和一个非外显子uc. 269A(N)。按照厂商方案(Marathon-ready cDNAs, Clontech, Palo Alto, CA)，从其克隆序列的组织来源是骨髓、白细胞、胎儿脑和结 肠。2)通过微阵列讲行的UCR表汰研究
使用Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)从 19 个正常人组织(Liu 等，2004) 和从50个来自经诊断患有CLL的患者的CLL样品中提取总RNA。从美国CLL Research Consortium institutions中的所有患者获得知情同意。如(Calin等，2005a)中所报导的， 使用来自6个健康个体的CDS+B细胞(4个不同的样品，两个为来自两个不同的健康个体的 混合物)和来自3个个体的单核细胞(MNC)作为对照。还从在University of Ferrara, University of Bologna 禾口 UniversityTor Vergata, Rome(Italy)收集的 78 个原发性结 肠直肠癌、21个正常结肠粘膜、9个原发性肝细胞癌和4个正常肝提取RNA。按照用于保护 人类受试者的制度化指导方针(institutional guideline)，所有样品都在书面知情同意 的情况下获得。利用如(soe. ucsc. edu/-jill/ultra)中的总共481个人UCR序列开发微阵列芯 片。对于每一个UCR，设计两个40聚体的探针，一个相应于有义基因组序列(称为“ + ”)， 另一个相应于互补序列(称为“A+”)。设计标准如(Liu等，2004)所述。将每一个寡聚物 以一式两份印制在两个不同的载玻片位置，从而可获得一式四份的数值用于分析。数千个 (3484)空白点用于背景扣除。如在其他地方(Liu等，2004 ;Calin等，2004a)所详述的，进 行RNA提取和微阵列实验(由UCR微阵列装配、靶的制备和阵列杂交组成)。简而言之，使用随机六聚物通过逆转录用生物素标记5yg来自各组织样品的 RNA。在我们的第二版miRNA-芯片(ArrayExpress目录号A_MEXP_258)上进行杂交，所述 芯片含有962个UCR探针、238个用于成熟miRNA的探针和143个用于前体miRNA的探针。 以一式两份将各寡聚物印制在两个不同的载玻片位置。使用GenePix 4000B扫描仪(Axon Instruments)，利用链霉抗生物素-AleXa647缀合物(单色信号)的生物素结合检测杂交 信号。使用GenePix Pro 6. 0 (AxonInstruments)对图像进行定量。在GeneSpring GX 7. 3 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)中对原始数据 进行标准化和分析。22个组织样品的表达数据使用Bioconductor中的Lowess功能(Limma package)来进行标准化，然后使用GeneSpring标准化来确定中位数；用于测定UCR表达 水平的阈值计算为空白点的平均值+2 SD(标准差)。使用GeneSpring软件的on-chip和 on-gene中位数标准化来对肿瘤进行标准化。使用平均连锁(average linkage)和皮尔森 相关性(Pearson correlation)作为相似性的量度来进行层次聚类。通过对倍数变化进行 过滤，然后使用GeneSpring软件的ANOVA (方差分析)统计以及Benjamin和Hochberg校 正(以减少假阳性)来进行肿瘤和正常组织的统计比较。将对倍数变化的过滤设定为1. 2， 因为已用于使用相同芯片分析的microRNA的该阈值[参见例如(Cahn等，2005a ；Cimmino 等，2005 ；Iorio等，2005)]经证明反映真实的生物学差异。通过将ANOVA结果与SAM(微阵 列的显著性分析)和PAM(微阵列的预测分析)分析组合来鉴定在CLL患者之间差异表达的T-UCR (其按照70-kDa的zeta相关蛋白(ZAP-70)的表达分组)。将它们的表达与microRNA 的表达(Calin等，2005a)相比较。使用MIAMExpress将所有数据提交至ArrayExpress数 据库，并且可使用登录号E-TABM-184检索所述数据。3) UCR 的定量 RT-PCR。定量RT-PCR是我们用于确认微阵列结果的第一方法。我们利用qRT-PCR在不同 的样品组合(包括15至17个从50个样品的阵列组随机选择的CLL样品和各种正常CD 19+/CD5+B细胞以及B和T淋巴细胞对照)中验证了 11个UCR(包括uc. 73 (P)/73A (P)、 uc. 135 (E)、uc. 160 (N)、uc. 233 (E) /233A (E)、uc. 269 (N) /269A (N)、uc. 289 (N)、uc. 291 (P) 和uc.346A(P))的微阵列数据。未用于微阵列研究的另外一组3个正常⑶19+/⑶5+阳 性B细胞购自AllCells (Berkeley，CA)，并且用作独立的确认组。在所有情况下，qRT-PCR 数据确认了微阵列数据。使用无RNA酶的DNA酶I处理RNA，然后使用随机引物和 Superscript II逆转录酶将其反转录成cDNA。为了确定有义或反义UCR转录物是否被表 达，使用Thermoscript RT和基因特异性(即有义或反义)引物反转录总RNA。RT条件如 (Schmittgen等，2004)所描述的。使用实时PCR和SYBR green检测，利用经设计用于扩增 与微阵列上的寡核苷酸探针相同的40bp的区域的PCR引物扩增cDNA。使用公式2" dcT, 其中dCT = (CTUCR-CT18s rRNA)，来测定每一个UCR相对于18S rRNA的相对量。将相对基 因表达数据乘以106以简化表述。4) T-UCR 的 Northern 印迹分析我们通过Northern 印迹法分析了 5 个 UCR :uc. IlO(N)、uc. 192 (N)、uc. 246 (E)、 uc. 269A(N)和uc. 352 (N)，然后通过RACE实验克隆其中两个。对于第6个UCR，uc. 47 (N)， 未显示数据。将总RNA在15% PAA-尿素凝胶上进行电泳(Calin等，2002)。RNA来源包括 一式二份或一式三份的11个正常组织(乳腺、肝、肺、肾和胰腺)(购自Ambion和Clontech) 和实验室中制备的4个正常MNC样品和16个CLL样品。由于这代表通过Northern印迹法 进行的对UCR表达的研究，因而我们使用来自相同组织的多个样品来验证数据的重现性。 探针经设计与芯片上的寡核苷酸同一，以检测与微阵列相同的转录物，如(Calin等，2002) 所描述的进行杂交。B)数据库和统计分析1)用于基因组定位的数据库。用于本文中报导的所有研究的UCR数据库如(Bejerano等，2004b)所公布的。我 们将我们的分析限制于481个长度在200个碱基对(bp)以上的区段。脆性位点(FRA)数 据库和癌症相关基因组区域(CAGR)的数据库如之前(Cain等，2004b)所公布的。2)基因组定位的统计分析。为了检测超保守区域(UCR)的发生与脆性位点、癌症中被扩增的区域和癌症中的 缺失区域相关的假设，我们使用随机效应Poisson和负二项回归模型。在这些模型下，“事 件”被定义为UCR的数目，暴露“时间”(即脆性位点对非脆性位点)定义为目的区域的非交 叠长度。区域的“长度”是确切的(如果已知的话)，或估计为1Mb (如果未知的话)。例如， 对于各染色体，计算所有非交叠脆性位点的总长度，并且将其用作脆性位点的暴露时间。然 后我们计数各染色体的脆性位点内发生的UCR的数目。各染色体的剩余长度(总Mb-脆性 位点Mb)假定是非脆性的，并且假定各染色体中的剩余UCR在非脆性区域发生。然后对于各区域，拟合备选的随机效应模型，零膨胀泊松和零膨胀负二项模型，在这三个模型中，使 用 Akaike' s Information Criteria(基于对数似然(log likelihood)和参数的数目) 选择最佳模型。该相同方法用于分析来自锌指蛋白的表达的数据。对于具有UCR的脆性 位点和具有锌指蛋白的L0H，最佳拟合模型是零膨胀负二项模型。对于所有其他情况，报导 了 Poisson模型。当具有零事件的分类的数目大于对于泊松分布预期的时，零膨胀负二项 模型是优选的。当事件的总数对于区域太少时，模型似然(model likelihood)不能收敛， 结果未报导。泊松、零膨胀泊松和零膨胀负二项回归模型中的随机效应是单个染色体，因为 染色体内的数据被假定是相关的。各模型中的固定效应由待比较的区域类型的指示变量 (indicator variable)组成。我们报导了发生率比(IRR)、发生率比的两侧95%置信区间 和两侧P值(用于检验发生率比为1. O的假设)。IRR显著大于1表示区域内UCR的数目 的增加高于偶然事件所预期的。使用两个独立比例的差异的渐近检验来比较miRNA和锌指蛋白的聚簇的比例，其中我们报导了差异、差异的95%的置信区间和P值。要指出的是，当与microRNA相比较时， 基因的ZNF转录因子类型显示显著更低的聚簇(聚簇定义为至少两个相同种类的基因在小 于50kb基因组距离上的定位)(32%，95/297聚簇的ZNF基因对48%，90/186聚簇的miRNA， 差异=16. 4%，95% CI = (7· 5%，25· 2% )，P < 0. 001)。使用 STATA ν7· 0 和 StatXact v7.0进行所有计算。3)UCR和miRNA的微阵歹U表汰少间的命、相关的统i十分析。在实施例II和本文的数据中提供了详细描述。简而言之，输入数据由一列T-UCR 和一列miRNA( “种子”)以及相应的表达值的矩阵组成。我们计算r，各对(miR，UC)基因 的斯皮尔曼秩相关系数；即，我们估计相关性检验的P-值，并且选择其相关性值在给定的 剔除值(value of rejection)上是显著的基因。如果进行大量的相关性检验，则通过使用 假检出率(FDR)修正多重检验的P值，如(Benjamini和Hochberg，1995)中所述。这样，P 值控制高于真实空检验(trulynull test)数目的假阳性数目，而FDR控制高于显著检验数 目的假阳性数目。C)功能研究1)通过与microRNA肓接相互作用进行的UCR下调。使用萤光素酶终止密码子的紧邻下游的XbaI位点将uc. 160，uc. 346A和uc. 348 的基因组序列克隆入PGL3-对照载体(Clontech)。如ATCC所推荐的，培养人巨核细胞 MEG-01和宫颈癌HeLa细胞系。按照厂商的方案使用siPORT neoFX(Ambion)，用0. 4 μ g 萤火虫萤光素酶报告基因载体和0. 08 μ g含有海肾萤光素酶的对照载体PRL-TK(Promega) 在12孔板中共转染细胞。对于每一个孔，使用IOnM miRNA-有义前体和混杂的寡核苷酸 (Ambion)。在转染后24小时，使用双萤光素酶测定(Promega)连续测量萤火虫和海肾萤光 素酶活性。以一式三份进行所有实验，进行4至6天不等的天数(η = 12至18)。使用实时PCR分析超保守RNA和成熟miRNA的表达。如上所述，利用实时PCR测 定UCR RNA的表达。如所描述的(Chen等，2005)，使用针对miR-155的TaqMan环状引物测 定(Applied Biosystems)分析成熟miRNA的表达。成熟miRNA的表达表示为2_dCT，其中 dCT = CTmiRNA-CTl ss rRNA)；将数据乘以106以简化表述。关于患者的相关性，使用一组13个样品(包括9个CLL患者和4个正常淋巴细胞样品)，如本文中所述分析miR-155、uc. 346A和uc. 160的水平。为了在MEGOl中鉴定 miR-155转染的“体内”效应，在使用Lipofectamine试剂用pre_miRNA 155 (Ambion)转染 后0、24和48小时，如所描述的利用qRT-PCR测量uc. 346A和uc. 160的水平。2) uc. 73A(P)抑制对癌细胞增殖的作用。通过使用 Dharmacon 算法(Dharmacon s iDESIGN (harmacon. com/s i des i gn))输 入UCR的完整序列来设计针对uc.73A(P)的siRNA。检测8个最高等级的靶序列。在 转染后48、72和144小时，利用半定量RT-PCR评估性能。使用最有效的两个siRNA 和4个不同siRNA (包括这两个)的混合物。我们称这些siRNA为siRNAl、siRNA3禾口 siRNApool。对于细胞生长测定，将人结肠癌细胞系C0L0-320和SW620培养于补充有10% FBS的RPMI1640培养基中，在转染前一天将IxlO4个细胞铺板在96孔板中。按照厂商 的方案，通过使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，以 200nM 的终 浓度用siRNA-uc. 73A (P)转染细胞。将si CONTROL非靶向性siRNA混合物(Dharmacon Research, LaFayette, CO, USA)用作阴性对照。每隔一天(在第48小时和96小时)在 相同的条件下重复转染。为了评估细胞数目，使用CellTiter 96 Aqueous One Solution CellProliferation Assay (Promega U. S.，Madison, WI, USA)。使用 ELISA 酶标仪(plate reader) (Spectra MAX, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)测量在 490nm 处的吸光 率，分别在第0、48、96和144小时时进行读数。对于各处理以一式三份进行细胞生长测定 3次。使用t检验计算相对于时间O在不同时间点上细胞数目之间的统计差异。对于细胞周期和细胞凋亡测定，将细胞以6xl05个细胞/孔铺板在6孔板中。第 二天然后每48小时，用200nM siRNA转染细胞。收集细胞，将其固定在冷的70%乙醇中， 进行至少 30 分钟。在第 48,96 和 144 小时时在 50 μ g/mL PI (Sigma Aldrich, St. Louis, M0)禾Π 5ig/mL 无 DNA 酶 RNA 酶(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)的 PBS 溶 液中进行碘化丙啶(PI)染色。按照厂商的方法，使用膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂 盒(BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)和使用PE-缀合的单克隆活性胱天蛋白酶-3抗 体细胞凋亡试剂盒(BDBiosciences)在第O和144小时时进行细胞凋亡染色，然后使用 FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)获取数据。每一个实验进行 3 次。本研究中所述的克隆的T-UCR的GeneBank登录号如下DQ644536 (UCG. 246)、 DQ644537 (UCG. 269A,短的形式)和 DQ644538 (UCG. 269A,长的形式)。实施例II实验方法UCR与miRNA的微阵列表达之间的负相关性的统计分析。输入数据由一列UCG和一列miRNA( “种子”)以及相应的表达值矩阵组成。我们计算r，各对(miR，UCR)基因的斯皮尔曼秩相关系数，基于秩评定的数据趋势相关性的非参 数量度；即，我们评估相关性检验的P-值，并且选择其相关性值在给定的剔除值上是显著 的基因。通过假定相关性值使用学生氏t累积分布进行分布，来进行P值的评估，自由度 的数目相应于微阵列实验中样品的数目。P值测量单个相关性(在几对基因间)的“良好 性”，从而，以了解真实的相关性是偶然产生的还是代表生物学上重要的信息，我们选择重 排列的方法，对每一行(miR或UCR)改变样品的顺序，以不同的改变的样品顺序计算基因对 (miR，UCR)之间的相关性。我们重复样品的重排列并计算相关性100次，这样，每一个真实的相关性具有100个随机相关性用于比较。通过使用所有(100*n° MIR*n° UC)随机相关 性和真实相关性，我们基于随机相关性秩评定和真实相关性的位置计算P值。如果进行大量的相关性检验，则通过使用假检出率(FDR)修正多重检验的P值，如 (Benjamini和Hochberg，1995)中所述。这样，P值控制高于真实空检验数目的假阳性数 目，而FDR控制高于显著检验数目的假阳性数目。已提出几种估计该数目的方法，我们采用 由 TomNichols (参见 froi. sourceforge. net/documents/technical/matlab/FDR)设计的 解决方法，所述方法通过将单个检验获得的P值乘以与所进行的检验的总数相关的指数的 组合来重新调整该P值。逐个种子地进行修正，意指种子列表中的基因被认为是独立的检 验。该统计学上有效的废物过滤(tripe filtering)允许靶向提取候选基因的入围名单， 从而节约用于进行随后的昂贵且耗时的遗传分析的资源。为了建立miR-24-l与uc. 160表达值之间的散点图，我们使用MatLab函数 R0BUSTFIT绘制回归线，以解释这两个基因之间的负相关性的假设。注意，只有11.67% (7/60)的点(表达值的对)是离群值。实施例III另外的实施例和信息如本文中所用的，miR和UCR可互换使用；以非限定性方式包括“miR基因产物”、 “111化1~01 ^”、“1^1 ”或“1^1 ^”是指来自miR基因的未经加工的(例如，前体)或已加工的 (例如，成熟)RNA转录物。使用UCR(miRNA)进行的诊断在一个方面，本文中提供了诊断受试者是否患有癌症或处于发生癌症的风险中的 方法，其包括测量来自受试者的测试样品中至少一种UCR的水平和将测试样品中该miR基 因产物的水平与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比较。如本文中所用的，“受试者” 可以是患有或怀疑患有癌症的任何哺乳动物。在优选实施方案中，受试者是患有或怀疑患 有癌症的人。可在从受试者获得的生物样品(例如，细胞、组织)中测量至少一种miR基因产物 的水平。例如，可通过常规的活组织检查技术从怀疑患有癌症相关疾病的受试者中取出组 织样品(例如，来自肿瘤)。在另一个实施方案中，可从受试者中取出血液样品，并且可通 过标准技术分离血细胞(例如，白细胞)以用于DNA提取。优选在开始放射疗法、化学疗法 或其他疗法之前从受试者获得血液或组织样品。可从受试者的未受影响的组织、从正常人 个体或正常个体的群体或从相应于受试者的样品的大部分细胞的培养细胞获得相应的对 照组织或血液样品。然后将对照组织或血液样品与来自受试者的样品一起进行处理，以便 可将从受试者的样品的细胞中给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品 的细胞的相应的miR基因产物的水平进行比较。生物样品的参照miR表达标准也可用作对 照。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，从受试者获得的样品中miR基因 产物水平的改变(例如，增加或减少)表示受试者中存在癌症相关疾病。在一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平高于对照样品中相应 的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达“上调”)。如本文中所使用的，当来自受 试者的细胞或组织样品中miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时，miR基因产物的表达“上调”。在另一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平低于对照样品中相应miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达“下调”)。如本文中所使用的，当从来自 受试者的细胞或组织样品中的该基因产生的miR基因产物的量低于从对照细胞或组织样 品中的相同基因产生的量时，miR基因的表达“下调”。可根据一个或多个RNA表达标准确定对照和正常样品中相对miR基因表达。所述 标准可包括例如OmiR基因表达水平、标准细胞系中的miR基因表达水平、受试者的未受影 响的组织中miR基因的表达水平或之前获得的正常人对照的群体的miR基因表达的平均水平。可使用适合用于检测生物样品中RNA表达水平的任何技术测量样品中miR基因产 物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞、组织)中的RNA表达水平的合适技术(例如， Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交)对于本领域技术人员来说是熟知的。在特定的实施 方案中，使用Northern印迹分析检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过在核酸 提取缓冲液存在的情况下进行勻浆，接着进行离心来从细胞纯化总的细胞RNA。沉淀核酸， 然后通过用DNA酶处理和沉淀来除去DNA。然后按照标准技术在琼脂糖凝胶上通过凝胶电 泳分离RNA分子，并将其转移至硝酸纤维素滤器。然后通过加热将RNA固定在滤器上。使 用适当标记的与所述RNA互补的DNA或RNA探针进行特定RNA的检测和定量。参见，例如， Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.，第 2 片反，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，Chapter 7，其全部公开内容通过引用合并入本文。用于给定的miR基因产物的Northern印迹杂交的合适的探针可根据核酸序列产 生，其包括但不限于与目的miR基因产物具有至少大约70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %， 98%，99%或完全的互补性的探针。用于制备标记的DNA和RNA探针的方法以及用于其与靶 核苷酸序列的杂交的条件描述于 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.，第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapters 10 禾口 11，其 公开内容通过引用合并入本文。在一个非限定性实例中，可用例如放射性核素例如3H、32P、33P、14C或35S ；重金属； 能够用作已标记的配体的特异性结合对成员的配体(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗 体)；荧光分子；化学发光分子；酶等来标记核酸探针。可通过Rigby 等人(1977)，J. Mol. Biol. 113 :237_251 的切口 平移法(nick translation method) Fienberg ^A (1983), Anal. Biochem. 132 6-13 白勺 Ρ Ι弓L夕去 (其全部公开内容通过引用合并入本文)将探针标记至高比放射性(specific activity)。 后者是选择用于从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的方法。例如， 按照切口平移法通过用高放射性的核苷酸置换预先存在的核苷酸，可能制备具有大大超过 IO8Cpm/微克的比放射性的32P-标记的核酸探针。然后可通过将杂交滤器暴露于照相胶片 来进行杂交的放射自显影检测。暴露于杂交滤器的照相胶片的光密度扫描提供了 miR基因 转录物水平的精确测量。使用另一个方法，可通过计算机化的成像系统例如可从Amersham Biosciences, Piscataway, N.丁获f导白勺 Molecular Dynamics 40Q-B 2D Phosphorimager 量miR基因转录物水平。当不能进行DNA或RNA探针的放射性核素标记时，可使用随机引物法将类似物例如dTTP类似物5- (N- (N-生物素基-ε -氨基己酰基)~3~氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺 入探针分子。可通过与偶联至荧光染料或产生颜色反应的酶的结合生物素的蛋白质例如抗 生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗体(例如抗生物素抗体)反应来检测生物素化的探针 寡核苷酸。除了 Northern和其他RNA杂交技术外，可使用原位杂交技术来测定RNA转录物的 水平。该技术需要比Northern印迹技术更少的细胞，其包括将整个细胞置于显微镜盖玻片 上和用含有放射性标记的或另外标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的 核酸含量。该技术特别适合用于分析来自受试者的组织活检样品。原位杂交技术的实施在 美国专利5，427，916 (其全部公开内容通过引用合并入本文)中进行了更详细的描述。在一个非限定性实例中，用于给定的miR基因产物的原位杂交的合适的探针可从 核酸序列产生。并且包括但不限于与目的miR基因产物具有至少大约70%，75%，80%， 85%,90%,95%,98%,99%或完全的互补性的探针，如上所述的。细胞中miR基因转录物的相对数目还可通过对miR基因转录物进行逆转录，然后 通过聚合酶链式反应扩增经逆转录的转录物(RT-PCR)来进行测定。可通过与内部标准例 如来自存在于相同样品中的“持家”基因的mRNA的水平相比较来定量miR基因转录物的 水平。用作内部标准的合适的“持家”基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (G3PDH)。用于进行定量和半定量RT-PCR的方法和其变型对于本领域技术人员来说是熟知 的。
在一些情况下，可能期望同时测定样品中多个不同miR基因产物的表达水平。在 其他情况下，可能期望测定与癌症关联的所有已知miR基因的转录物的表达水平。评估数 百种miR基因或基因产物的癌症特异性表达水平非常费时并且需要大量的总RNA(例如，对 于每一个Northern印迹需要至少20 μ g)和需要放射性同位素的放射自显影技术。为了克服这些限制，可构建以微芯片形式(即，微阵列)存在的寡核苷酸文库 (oligolibrary)，该文库包含特异于一组miR基因的一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸) 探针。使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，且将它们与微阵列上 的探针寡核苷酸杂交以产生杂交特征谱或表达特征谱来测定生物样品中多个microRNA的 表达水平。然后将受试样品的杂交特征谱与对照样品的杂交特征谱比较，从而确定在癌细 胞中具有改变的表达水平的microRNA。如本文中所使用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷 酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如，通过杂交)的 分子。“miR-特异性探针寡核苷酸”或“特异于miR的探针寡核苷酸”是指具有选择用于与 特定miR基因产物或特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。特定样品的“表达特征谱”或“杂交特征谱”本质上是样品的状态指纹；虽然两种 状态可能具有相似表达的任何特定基因，但同时评价大量基因允许产生对于细胞的状态是 独特的基因表达特征谱。即，正常组织可与癌(例如，肿瘤)组织相区别，并且在癌组织中， 可确定不同的预后状态(例如，良好的或不良的长期存活希望)。通过比较不同状态中癌组 织的表达特征谱，获得关于哪个基因在这些状态的各状态中是很重要(包括基因的上调和 下调)的信息。在癌组织中差异表达的序列的鉴定以及导致不同预后结果的差异表达的鉴 定允许以许多方法使用该信息。
在一个非限定性实例中，可评估特定的治疗方案(例如，以确定化疗药物是否改 善特定患者的长期预后)。类似地，可通过将患者样品与已知的表达特征谱比较来进行或确 认诊断。此外，这些基因表达特征谱(或个体基因)允许筛选抑制癌症表达特征谱或将不 良预后特征谱转变成更好的预后特征谱的药物候选物。因此，本文中还提供了诊断受试者是否患有癌症或处于发展癌症的风险中的方 法，该方法包括逆转录获自受试者的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将靶寡 脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供受试样品的杂交特征 谱，和将受试样品杂交特征谱与从对照样品或参照标准产生的杂交特征谱比较，其中至少 一种miRNA的信号的改变表示受试者患有癌症或处于发展癌症的风险中。在一个实施方案中，微阵列包含大部分所有已知的人miRNA的miRNA特异性探针 寡核苷酸。在特定的实施方案中，微阵列包含一种或多种选自miR29a、miR-29b、miR-29C和 其组合的miRNA的miRNA特异性探针寡核苷酸。可利用基因特异性寡核苷酸探针(所述探针从已知的miRNA序列产生)制备微阵 列。对于各miRNA，阵列可包含两种不同的寡核苷酸探针，一种探针包含活性成熟序列，而 另一种探针特异于miRNA的前体。阵列还可包含可用作杂交严格性条件的对照的对照，例 如与人直系同源物只相异于少数几个碱基的一个或多个小鼠序列。还可将来自两个物种的 tRNA或其他RNA(例如，rRNA.mRNA)印制在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对 稳定的阳性对照。还可将用于非特异性杂交的一个或多个合适的对照包含在微芯片上。为 了该目 的，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源性选择序列。可使用本领域内已知的技术制备微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如 40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5 ’ -胺修饰，并且使用可商购获得的微阵列系统例如 GeneMachine OmniGrid IOOMicroarrayer 和 Amersham CodeLink 活化的载玻片进行印 制。通过用标记的引物逆转录靶RNA来制备相应于靶RNA的标记的cDNA寡聚物。在第一 链合成后，使RNA/DNA杂交物变性以降解RNA模板。然后将所制备的标记的靶cDNA在杂 交条件(例如在25°C下于6X SSPE/30%甲酰胺中进行18小时，然后在37°C下于0. 75X TNT(TrisHCl/NaCl/Tween 20)中清洗40分钟)下与微阵列芯片杂交。在阵列上的其中固 定的探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置上，发生杂交。标记的靶cDNA标记阵列上 的其中发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出信号由一列杂交事件组成，其 标示了特定cDNA序列的相对丰度，从而标示了患者样品中相应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标 记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素蛋白-AleXa647缀合物直接检测包含生物素的 转录物来处理微阵列，和使用常规扫描方法扫描微阵列。阵列上的各点的图像强度与患者 样品中相应的miR的丰度成比例。使用阵列对于miRNA表达的检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点上鉴 定相同样品中的数百个基因的整体表达。第二，通过寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成 熟分子和前体分子的表达。第三，与Northern印迹分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用 2. 5yg总RNA可提供可重现的结果。数目相对有限的miRNA (每物种数百个)允许对数个 物种构建共同的微阵列，其中对每一物种使用不同的寡核苷酸探针。这样的工具允许分析 各已知的miR在不同条件下的跨物种表达。
除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于miRNome的大部分(优选 整个miRNome)的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于进行miR基因表达特征谱分 析，以分析miR的表达模式。可使不同的miR特征与已建立的疾病标志物关联或直接与疾 病状态关联。按照本文中描述的表达特征谱分析法，对来自怀疑患有癌症相关疾病的受试者的 样品的总RNA进行定量逆转录以提供一组与样品中的RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸。 然后将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供样品 的杂交特征谱。结果是显示样品中miRNA的表达模式的样品的杂交特征谱。杂交特征谱包 括来自靶寡脱氧核苷酸(其来自样品)与微阵列中的miRNA-特异性探针寡核苷酸结合的 信号。所述特征谱可记录为结合的存在或不存在(信号对0信号)。更优选地，记录的特征谱包括来自各杂交的信号的强度。将所述特征谱与从正常 的(即非癌的)对照样品产生的杂交特征谱相比较。信号的改变表示受试者中存在癌症或 发生癌症的倾向。用于测量miR基因表达的其他技术也在本领域技术人员的能力范围之内，并且包 括用于测量RNA转录和降解的速率的各种技术。本文中还提供了测定患有癌症的受试者的预后的方法，该方法包括测量受试者的 测试样品中至少一种miR基因产物的水平，所述水平与癌症相关疾病的特定预后(例如，良 好或积极的预后，不良或不利的预后)相关。根据这些方法，与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比较，测试样品中与 特定预后相关的miR基因产物的水平的改变表明受试者患有具有特定预后的癌症。在一个 实施方案中，miR基因产物与不利的(即，不良的)预后相关。不利预后的实例包括但不限 于低存活率和快速疾病发展。在某些实施方案中，这样测量至少一种miR基因产物的水平， 即通过逆转录获自受试者的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将该靶寡脱氧核 苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交特征谱， 然后将受试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较来进行测量。不希望受任何理论束缚，据信，细胞中一种或多种miR基因产物水平的改变可导 致这些miR的一种或多种预期的靶失调，这可导致癌症形成。因此，改变miR基因产物水平 (例如，通过减少在癌细胞中被上调的miR基因产物的水平，通过增加在癌细胞中被下调的 miR基因产物的水平)可成功地治疗癌症。因此，本文中还提供了抑制受试者中的肿瘤发生的方法，所述受试者患有或怀疑 患有癌症，其中至少一种miR基因产物在受试者的癌细胞中失调(例如，下调，上调)。当至 少一种分离的miR基因产物(例如，miR-29家族)在癌细胞中被下调时，方法包括施用有 效量的至少一种分离的miR基因产物，或其分离的变体或生物活性片段，以便在受试者中 抑制癌细胞的增殖。例如，当miR基因产物在受试者的癌细胞中被下调时，对受试者施用有效量的分 离的miR基因产物可抑制癌细胞的增殖。对受试者施用的分离的miR基因产物可与在癌细 胞中被下调的内源野生型miR基因产物(例如，miR基因产物)相同或其可以是其变体或 生物活性片段。如本文所定义的，miR基因产物的“变体”是指与相应的野生型miR基因产物具有低于100%的同一性并且具有相应的野生型miR基因产物的一种或多种生物活性的miRNA。 这样的生物活性的实例包括但不限于靶RNA分子的表达的抑制(例如，抑制靶RNA分子的 翻译，调节靶RNA分子的稳定性，抑制靶RNA分子的加工)和与癌症相关的细胞过程(例如， 细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。此类变体包括物种变体和其为miR基因中一个或 多个突变(例如，置换、缺失、插入)的结果的变体。在某些实施方案中，变体与相应的野生 型miR基因产物至少大约70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%或99%的同一。如本文所定义的，miR基因产物的“生物活性片段”是指miR基因产物的RNA片段，其具有相应的野生型miR基因产物的一个或多个生物活性。如上所述，此类生物活性的实 例包括但不限于靶RNA分子的表达的抑制和与癌症相关的细胞过程的抑制。在某些实施方 案中，生物活性片段的长度是至少大约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在特定的实施方案中，可将分离的miR基因产物与一种或多种另外的抗癌疗法组 合来对受试者施用。适当的抗癌疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法和其组合(例如，放 化疗(chemoradiation)) ο当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中被上调时，方法包括对受试者施用有 效量的至少一种用于抑制至少一种miR基因产物的表达的化合物(在本文中称为miR基 因表达_抑制化合物)，以便癌细胞的增殖被抑制。在特定的实施方案中，至少一种miR表 达_抑制化合物特异于选自miR29家族的miR基因产物(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c 和其组合)。如本文中所使用的，术语“治疗”、“医治”和“疗法”是指改善与疾病或病况例如癌 症相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减少疾病或病况的症状的严重性 或频率。术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中定义为包括动物例如哺乳动物，包括但 不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊科、马 科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实施方案中，动物是人。如本文中所使用的，分离的miR基因产物的“有效量”是足以在患有癌症的受试者 中抑制癌细胞增殖的量。通过考虑因素例如受试者的大小和体重；疾病侵入的程度；受试 者的年龄、健康和性别；施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容 易地确定对给定的受试者施用的miR基因产物的有效量。例如，分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量。肿瘤块 的大致重量可通过计算肿瘤块的大致体积来测定，其中1立方厘米的体积大约等于1克。基 于肿瘤块的重量的分离的miR基因产物的有效量可在大约10至500微克/克肿瘤块的范 围之内。在某些实施方案中，肿瘤块可以是至少大约10微克/克肿瘤块，至少大约60微克 /克肿瘤块或至少大约100微克/克肿瘤块。分离的miR基因产物的有效量还可基于待治疗的受试者的大致或估计的体重。优 选，如本文中所描述的，胃肠外或肠内施用这样的有效量。例如，对受试者施用的分离的miR 基因产物的有效量可在大约5至大约3000微克/kg的体重，大约700至1000微克/kg的 体重的范围内，或大于大约1000微克/kg的体重。本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用分离的miR基因 产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用一次(例如，作为单次注射或沉积 (cbp0Siti0n))miR基因产物。可选择地，可以每天1次或2次对受试者施用miR基因产物，进行大约3至大约28天，特别地大约7至大约10天的时期。在特定的给药方案中，每天1 次施用miR基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，应理解，对受试者施用的miR 基因产物的有效量可包括在整个给药方案期间施用的基因产物的总量。如本文中使用的，“分离的”miR基因产物是合成的或通过人工介入从天然状态改 变或取出的miR基因产物。例如，合成的HliR基因产物，或部分或完全从其天然状态的共存 材料分离的miR基因产物被认为是“分离的”。分离的HliR基因产物可以以大体上纯化的形 式存在，或可以存在于已将所述miR基因产物递送入其中的细胞中。因此，有意地被递送至 细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是“分离的”miR基因产物。在细胞内从miR前 体分子产生的miR基因产物也被认为是“分离的”分子。根据一个特定的实施方案，本文所 描述的分离的miR基因产物可用于制造用于治疗受试者(例如，人)中的癌症的药物。
分离的miR基因产物可使用许多标准技术获得。例如，可使用本领域已知的方法 化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰 胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成miR基因产物。合成RNA分子或合成试剂的提供商包 括例如 Proligo (Hamburg, Germany) >Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A. )、Pierce Chemical(part of Perbio Science,Rockford,IL,U. S. A. )>Glen Research(Sterling,VA, U. S. A. ) > ChemGenes (Ashland, MA, U. S. A.)禾口 Cruachem (Glasgow, UK)。可选择地，可使用任何合适的启动子从重组环形或线性DNA质粒表达miR基因产 物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如TO或Hl RNA pol III启动子序列或巨 细胞病毒启动子。其他合适启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质 粒还可包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。还 可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至癌细胞并且在其中直接表达。下面更详细地论 述重组质粒将miR基因产物递送至癌细胞的用途。miR基因产物可从分开的重组质粒表达，或它们可从相同的重组质粒表达。在一个 实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后通过合适的加工系统(包 括但不限于癌细胞中现有的加工系统)将该前体分子加工成功能性miR基因产物。其他合 适的加工系统包括例如体外果蝇细胞裂解物系统(例如，如属于Tuschl等人的美国公开专 利申请2002/0086356中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文)和大肠杆菌RNA 酶III系统(例如，如属于Yang等人的美国公开专利申请2004/0014113中所描述的，其全 部公开内容通过引用合并入本文)。适合用于表达miR基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒以表达基 因产物的方法以及将重组质粒递送至目的细胞的方法在本领域技术人员的能力之内。参 见，例如，Zeng 等(2002), MolecularCell 9 :1327_1333 ；Tuschl (2002)，Nat. Biotechnol， 20 446-448 ；BrummeIkamp 等(2002)，Science 296 :550_553 ；Miyagishi 等(2002)，Nat. Biotechnol. 20 497-500 ；Paddison 等(2OO2)，Genes Dev. 16 948-958 ；Lee 等(2OO2)， Nat. Biotechnol. 20 :500_505 ；和 Paul 等(2002)，Nat. Biotechnol. 20 :505_508，其全部公 开内容通过引用合并入本文。在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV立即早期启动子 (intermediate-early promoter)控制下编码miR前体RNA的序列。如本文中所使用的，“在启动子的控制下”是指编码miR基因产物的核酸序列位于启动子的3'端，以便启动子 可起始miR基因产物编码序列的转录。miR基因产物还可从重组病毒载体表达。预期miR基因产物可从两个分开的重组 病毒载体或从相同的病毒载体表达。可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组病 毒载体表达的RNA或所述RNA可在癌细胞中直接表达。下面更详细地论述重组病毒载体将 mi R基因产物递送至癌细胞的用途。本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何 合适的启动子。合适的启动子包括但不限于U6或HlRNA pol III启动子序列，或巨细胞病 毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载 体还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，来源于腺病毒 (AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒(Rhabdoviruses)、鼠白 血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化 载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白(如果合适)来改变病毒载体的趋向性。例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies)、埃博拉病毒 (Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。可通过对载体 进行工程改造以表达不同的衣壳蛋白血清型来制备本发明的AAV载体，使之靶向不同的细 胞。例如，在血清型2型基因组上表达血清型2型衣壳的AAV载体称为AAV 2/2。AAV 2/2 载体中的该血清型2型衣壳基因可用血清型5型衣壳基因替换，从而产生AAV 2/5载体。用 于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的能力之内；参见， 例如，Rabinowitz, J. E.，等(2002)，J. Virol. 76 :791_801，其全部公开内容通过引用合并 入本文。适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将用于表达RNA的核酸序列 插入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法和表达的RNA产物的回收在本 领域技术人员的能力之内。参见，例如，Dornburg(1995)，Gene Therap. 2 301-310 ； Eglitis(1988)，Biotechniques 6 608-614 ；Miller(1990), Hum. Gene Therap. 1 :5_14 ；禾口 Anderson(1998)，Nature 392 :25_30，其全部公开内容通过引用合并入本文。特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达miR基因产物的合适 的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Xia 等(2002)，Nat. Biotech. 20 :1006_1010，其全部公开内容通过引用合并入本文。用于表达 miR基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及用于将载体递送至靶细 胞的方法描述于 Samulski 等(1987)，J. Virol. 61 :3096_3101 ；Fisher 等(1996) ,J. Virol, 70 520-532 ；Samulski 等(1989)，J. Virol. 63 :3822_3826 ；美国专利 5，252，479 ；美国专利 5，139,941 ；国际专利申请WO 94/13788 ；和国际专利申请W093/24641，其全部公开内容通 过引用合并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV载体 表达miR基因产物。在某些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人TO RNA启动子控制下的 与polyT终止序列有效连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文中所使用的，“与polyT 终止序列有效连接”是指编码有义或反义链的核酸序列以5 ‘方向与polyT终止信号紧密邻接。在从载体转录miR序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。在本发明的治疗方法的其他实施方案中，可对受试者施用有效量的至少一种抑制 miR表达的化合物。如本文中所使用的，“抑制miR表达”是指治疗后miR基因产物的前体 和/或活性成熟形式的产量低于治疗前产生的量。通过使用例如上述用于诊断方法的测定 miR转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定miR的表达在癌细胞中是否已被抑 制。抑制可在基因表达的水平上(即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录)或 在加工的水平上(例如，通过抑制miR前体至成熟的活性miR的加工)发生。如本文中所使用的，抑制miR表达的化合物的“有效量”是足以在患有癌症(例如， 癌症)的受试者中抑制癌细胞的增殖的量。通过考虑因素，例如受试者的大小和体重；疾病 侵入的程度；受试者的年龄、健康和性别；施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本 领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的miR表达抑制化合物的有效量。例如，表达抑制化合物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量，如本文中所 描述的。抑制miR表达的化合物的有效量还可基于待治疗的受试者的大致的或估计的体 重，如本文中所描述的。本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用抑制miR表达的化合 物的适当的给药方案。用于抑制miR基因表达的合适的化合物包括双链RNA(例如短或小干扰RNA或 "siRNA")、反义核酸和酶促RNA分子例如核酶。这些化合物中的每一种可被靶向给定的miR 基因产物并且干扰靶miR基因产物的表达(例如，抑制其翻译，诱导其切割或破坏)。例如，给定的miR基因的表达可通过用分离的双链RNA( "dsRNA")分子诱导miR 基因的RNA干扰来抑制，所述双链RNA分子与miR基因产物的至少一部分具有至少90%、例 如至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同源性。在特定的实施方案中，dsRNA分 子是“短或小干扰RNA”或“siRNA”。用于本方法的siRNA包括长度大约17个核苷酸至大约29个核苷酸、优选长度大 约19至大约25个核苷酸的短双链RNA。siRNA包含通过标准Watson-Crick碱基配对相互 作用(在下文中称为“碱基配对”)退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包 含与靶miR基因产物内包含的核酸序列大体上同一的核酸序列。如本文中所使用的，siRNA中与靶mRNA内包含的靶序列“大体上同一”的核酸序列 是与靶序列同一的核酸序列或与靶序列相异于1或2个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义 和反义链可包括两个互补的单链RNA分子或可包括其中两个互补部分碱基配对并且通过 单链“发夹结构”区域共价连接的单个分子。siRNA还可以是与天然存在的RNA相异于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和 /或改变的经改变的RNA。这样的改变可包括非核苷酸材料的添加(例如至siRNA的末端 或至siRNA的一个或多个内部核苷酸的添加)，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修饰或用脱氧 核糖核苷酸对siRNA中的一个或多个核苷酸的置换。siRNA的一条或两条链还可包含3'悬突。如本文中所用的，“3'悬突”是指从双 链RNA链的3'-末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA 包含至少一个长度为1至大约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度为 1至大约5个核苷酸、长度为1至大约4个核苷酸或长度为大约2至大约4个核苷酸的3 ‘悬突。在特定的实施方案中，3'悬突存在于siRNA的两条链上，且其长度为2个核苷酸。例 如，siRNA的各条链可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“im”)的3'悬突。siRNA可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分 离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于 属于Gewirtz的美国公开专利申请2002/0173478和属于Reich等人的美国公开专利申请 2004/0018176，两者的全部公开内容通过引用合并入本文。给定的miR基因的表达还可通过反义核酸抑制。如本文中所使用的，“反义核酸” 是指通过RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用与靶RNA结合的核酸分子，其改变靶 RNA的活性。适合用于本方法的反义核酸是通常包含与miR基因产物中的连续核酸序列互 补的核酸序列的单链核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合物、肽核酸(PNA))。反义核酸可 包含与miR基因产物中的连续核酸序列50-100%互补、75-100%互补或95-100%互补的核 酸序列。不希望受任何理论束缚，据信，反义核酸激活RNA酶H或降解miR基因产物/反义 核酸双链体的另一种细胞核酸酶。反义核酸还可包含对核酸主链或对糖和碱基部分(或它们的等价物)的修饰，从 而增加靶特异性、核酸酶抗性、递送或与分子的功效相关的其他性质。此类修饰包括胆固醇 部分、双链体嵌入剂例如吖啶或一种或多种抗核酸酶基团。反义核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文 对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测的示例性方法在本领域技术人员的能力 之内；参见，例如，Stein和Cheng(1993) ,Science 261 1004以及属于Woolf等人的美国专 利5，849，902，其全部公开内容通过引用合并入本文。给定的miR基因的表达还可通过酶促核酸(enzymatic nucleicacid)抑制。如本 文中所使用的“酶促核酸”是指包含与miR基因产物的连续核酸序列具有互补性的底物结 合区并且能够特异性切割miR基因产物的核酸。酶促核酸底物结合区可以例如与miR基因 产物中的连续核酸序列50-100%互补、75-100%互补或95-100%互补。酶促核酸还可包括 在碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。用于本方法的示例性酶促核酸包括从头甲基转移酶包括DNMT3A和DNMT3B，如本 文中的实施例中所描述的。酶促核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上 文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性 方法描述于 Werner 和 Uhlenbeck (1995)，Nucl. Acids Res. 23 2092-96 ；Hammann 等人 (1999) ,Antisense andNucleic Acid Drug Dev. 9 :25_31 ；以及属于 Cech 等人的美国专利 4，987，071，其全部公开内容通过引用合并入本文。 至少一种miR基因产物或至少一种用于抑制miR表达的化合物的施用将在患有癌症的受试者中抑制癌细胞的增殖。 如本文中所使用的，“抑制癌细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性或暂时地阻止或 减缓细胞的生长。如果受试者中癌细胞的数目在施用miR基因产物或miR基因表达抑制化 合物后保持恒定或减少，那么可推断癌细胞增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但肿 瘤生长的速度下降，则也可推断癌细胞增殖被抑制。
受试者体内的癌细胞数目可通过直接测量或通过对原发性或转移性肿瘤块的大小的估计来确定。例如，受试者中癌细胞的数目可通过免疫组织学方法、流式细胞术或经设 计用于检测癌细胞的特征表面标志物的其他技术来测量。肿瘤块的大小可通过直接目测观察或通过诊断成像法例如X射线、磁共振成像、 超声和闪烁造影术(scintigraphy)来测定。可在使用造影剂或不使用造影剂的情况下使 用用于测定肿瘤块的大小的诊断成像法，这在本领域内是已知的。肿瘤块的大小还可通过 物理方法例如组织块的触诊或利用测量仪器例如测径器测量组织块来测定。可通过适合用于将此类化合物递送至受试者的癌细胞的任何方法来对受试者施 用HliR基因产物或HliR基因表达抑制化合物。例如，可通过适合于用此类化合物或用包含 编码此类化合物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用HliR基因产物或HliR表达抑 制化合物。在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合 物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。用于真核细胞的转染方法在本领域内是熟知的，包括例如核酸至细胞的细胞核或 前核(pronucleus)的直接注射、电穿孔、脂质体转移或由亲脂材料介导的转移、受体介导 的核酸递送、基因枪或微粒加速、磷酸钙沉淀以及由病毒载体介导的转染。例如，细胞可用质脂体转移化合物例如DOTAP (N- [1_ (2，3_ 二油酰氧基)丙基]-N， N，N-三甲基-甲基硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或等价物例如LIP0FECTIN进行转染。使 用的核酸的量对于实施本发明不是至关重要的；可接受的结果可用0. 1-100微克核酸/IO5 个细胞来获得。例如，可使用在3微克DOTAP中的大约0. 5微克质粒载体/IO5个细胞的比 例。还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用miR基因产物或miR基 因表达抑制化合物。用于本方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠或鼻内递送。合 适的胃肠外施用途径包括例如血管内施用(例如，静脉内团注(bolus injection)、静脉内 输注、动脉内团注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注)；组织外周(peri-tissue)和 组织内注射(例如，肿瘤外周和肿瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或 沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其他安 置装置(例如，视网膜丸剂(retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无孔的或凝胶状材料 的植入物)；以及吸入。特别合适的施用途径是注射、输注和直接注射入肿瘤。在本方法中，miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物可以以裸露的RNA形 式、与递送试剂一起或以包含表达miR基因产物或miR基因产物表达抑制化合物的序列的 核酸(例如，重组质粒或病毒载体)的形式对受试者进行施用。合适的递送试剂包括例如 Mirus TransitTKO 亲脂试剂、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如， 多聚赖氨酸)和脂质体。 含有表达miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的重组质粒和病毒载体 以及用于将此类质粒和载体递送至癌细胞的技术在本文中进行了论述和/或在本领域内 是熟知的。 在特定的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物或miR基因表达抑制化合物 (或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体还可增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质形成用于本发明的合适的脂质体，所述脂质通常 包括中性的或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素例如期 望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期来进行指导。已知许多用于制备脂质体的方 法，例如如 Szoka 等人(1980)，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 467 ；和美国专利 4，235，871、 4，501，728,4, 837，028和5，019，369 (其全部公开内容通过引用合并入本文)中所描述的方 法。用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合在癌细胞中普 遍的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。
用于本方法的脂质体还可进行修饰以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状 内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体在表面具有调理作用-抑制部分或所述部 分被整合入脂质体结构。在特别优选实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用-抑制 部分和配体。用于制备本发明的脂质体的调理作用-抑制部分通常是与脂质体膜结合的巨大 的亲水聚合物。如本文中所使用的，调理作用-抑制部分，当其通过化学或物理方式(例如 通过将脂溶性锚嵌入膜本身或通过与膜脂质的活性基团直接结合)附着至膜时，与脂质体 膜“结合”。此类抑制调理作用的亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES吸收的保 护性表面层；例如，如美国专利4，920，016中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本 文。适合于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有大约500至大约40，000道尔 顿，更优选大约2，000至大约20，000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合 物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG 硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性的、分支的或树枝 状聚酰胺-胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基或氨基化学连接的聚木糖 醇和聚乙烯醇，以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GMl。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其 衍生物的共聚物也是合适的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多 糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是包含 氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神 经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶(carrageenan)；胺化的多糖或低聚糖(线性或分支的)；或羧基 化的多糖或低聚糖，例如与碳酸的衍生物反应从而与羧基连接的多糖或低聚糖。优选，调理 作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG 化的脂质体”。可通过许多熟知的技术中的任一种将调理作用抑制部分结合至脂质体膜。例如， 可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯与磷脂酰乙醇胺脂质可溶性锚结合，然后再与膜结合。类 似地，可使用Na(CN)BH3和溶剂混合物(例如以30 12比例的四氢呋喃和水)在60°C下 通过还原胺化作用，用硬脂酰胺脂质可溶性锚衍生葡聚糖(dextran)聚合物。用调理作用-抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持更长时间。 因此，此类脂质体有时称为“隐形(stealth) ”脂质体。已知隐形脂质体在通过多孔或“渗漏” 微脉管系统供养的组织中积累。因此，由此类微脉管系统缺陷表征的组织例如肿瘤将有效 地积累这些脂质体；参见 Gabizon 等(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. Α.，18 :6949_53。此外，减少的通过RES的吸收通过阻止脂质体在肝和脾中的大量积累来降低隐形脂质体的 毒性。因此，用调理作用-抑制部分修饰的脂质体特别适合用于将miR基因产物或miR基 因表达抑制化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。可在对受试者施用前，按照本领域已知的技术将miR基因产物或miR基因表达抑 制化合物配制为药物组合物，有时称为“药剂”。因此，本发明包括用于治疗癌症的药物组合 物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物或其分离的变 体或生物活性片段，和药学上可接受的载体。在特定的实施方案中，至少一种miR基因产物 相应于在癌细胞中，相对于适当的对照细胞具有减少的表达水平的miR基因产物。在其他实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种miR表达抑制化合物。在 特定的实施方案中，至少一种miR基因表达抑制化合物对于miR基因(所述miR基因的表 达在癌细胞中比在对照细胞中高)是特异性的。本发明的药物组合物的特征在于至少是无菌的且无热原的。如本文中所用的， “药物组合物”包括用于人和兽医用途的制剂。制备本发明的药物组合物的方法在本领域 技术人员的能力范围内，例如如Remington' s Pharmaceutical Science，第17版，Mack PublishingCompany, Easton, Pa. (1985)中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文。本药物组合物包含至少一种与药学上可接受的载体混合的miR基因产物或miR基 因表达抑制化合物(或至少一种含有编码它们的序列的核酸)(例如，按重量计算0. 1至 90% )，或其生理学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的药物组合物额外包含一种 或多种抗癌剂(例如，化学治疗剂)。本发明的药物制剂还可包含至少一种被脂质体封装的 miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种含有编码它们的序列的核酸)和药 学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物包含为miR29a、miR-29b和miR-29c的 一种或多种的miR基因或基因产物。特别适合的药学上可接受的载体是水、缓冲的水、生理盐水、0.4%的盐水、0.3%
的甘氨酸、透明质酸等。在特定的实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种抗核酸酶降解的miR基 因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少一种含有编码它们的序列的核酸)。本领域技术人员可通过将一个或多个在2'-位置上进行修饰的核糖核苷酸掺 入miR基因产物来容易地合成抗核酸酶的核酸。适当的2'-修饰的核糖核苷酸包括在 2'-位置上用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修饰的核糖核苷酸。药物组合物本发明的药物组合物还可包含常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形 剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂(osmolalityadjusting agent)、缓冲剂和pH调节 齐U。合适的添加剂包括例如生理上生物相容性缓冲剂(例如，氨丁三醇盐酸盐)、螯合剂(例 如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合络合物(例如，DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)的添加， 或任选地，钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的添加。本发明的 药物组合物可以以液体形式包装使用或可以进行冻干。对于本发明的固体药物组合物，可使用常规无毒性的固体的药学上可接受的载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。例如，用于口服施用的固体药物组合物可包含上文所列的任何载体和赋形剂以及 10-95%，优选25% -75%的至少一种miR基因产物或miR基因表达抑制化合物(或至少 一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可包含封装在 上文所述的脂质体中的按重量计算0.01-20%，优选-10%的至少一种miR基因产物或 miR基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和喷射剂。需要时还 可包含载体例如卵磷脂以用于鼻内递送。本发明的药物组合物还可包含一种或多种抗癌剂。在特定的实施方案中，组合物 包含至少一种HliR基因产物或HliR基因表达抑制化合物(或至少一种含有编码它们的序列 的核酸)和至少一种化学治疗剂。适合于本发明的方法的化学治疗剂包括但不限于DNA-烷 化剂、抗肿瘤抗生素剂、抗代谢剂(anti-metabolic agent)、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去 稳定剂、激素拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、CDK抑制剂、细 胞周期蛋白抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三链螺旋DNA、核酸 适体和分子修饰的病毒、细菌和外毒素剂(exotoxic agent) 0用于本发明的组合物的适当 的试剂的实例包括但不限于阿糖胞苷(cytidinearabinoside)、甲氨蝶呤、长春新碱、依托 泊苷(VP-16)、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、顺钼(CDDP)、地塞米松、arglabin、环磷 酰胺、溶肉瘤素(sarcolysin)、甲基亚硝脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、长春碱、喜树碱、 放线菌素D、丝裂霉素C、过氧化氢、奥沙利钼、伊立替康、托泊替康、亚叶酸、卡莫司汀、链佐 星、CPT-11、紫杉醇、它莫西芬、达卡巴嗪、利妥昔单抗、柔红霉素、l-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶 (arabinofuranosylcytosine)、伊马替尼、氟达拉滨、多西他赛、F0LF0X4。肿瘤发生的抑制剂本文中还提供了鉴定肿瘤发生抑制剂的方法，所述方法包括给细胞提供测试试剂 和测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，方法包括给细胞提供测 试试剂和测量至少一种在癌细胞中具有减少的表达水平的miR基因产物的水平。在提供试 剂后，相对于适当的对照细胞(例如，未提供试剂)，细胞中miR基因产物的水平的增加表示 测试试剂是肿瘤发生的抑制剂。在其他实施方案中，方法包括给细胞提供测试试剂和测量至少一种在癌细胞中具 有增加的表达水平的miR基因产物的水平。在提供试剂后，与适当的对照细胞(例如，未提 供试剂)相比较，细胞中miR基因产物水平的减少表示测试试剂是肿瘤发生的抑制剂。在特 定的实施方案中，至少一种在癌细胞中具有增加的表达水平的miR基因产物选自miR29a、 miR-29b、miR-29c 和其组合。适当的试剂包括但不限于药物(例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白质、 核酸)。试剂可重组产生、合成产生，或其可从天然来源分离(即，纯化)。用于给细胞提供此 类试剂的各种方法(例如，转染)在本领域内是熟知的，且下文中描述了几种这样的方法。 用于检测至少一种miR基因产物的表达的方法(例如，Northern印迹、原位杂交、RT-PCR、 表达特征谱分析)在本领域内也是熟知的。在下文中也描述了几种此类方法。实施例IV用于诊断、分期、预后、监控和治疗癌症相关疾病的方法、试剂和试剂盒。
应理解，本文所中有实施例在它们的范围内将被认为是非限定性的。在下面部分 更详细地描述各个方面。诊断方法在一个实施方案中，提供了评估患者是否患有癌症相关疾病或具有高于正常的发 生癌症相关疾病的风险的诊断方法，所述方法包括将患者样品中标志物的表达水平与对照 例如来自无癌症相关疾病的患者的样品中的标志物的正常表达水平相比较的步骤。与正常水平相比，患者样品中显著更高的标志物表达水平表示患者患有癌症相关 疾病或具有高于正常的发生癌症相关疾病的风险。选择标志物以使该方法的阳性预测值为至少大约10%，在某些非限定性实施方案 中，大约25%、大约50%或大约90%。也优选用于本方法的是与正常细胞相比较在至少大 约20%，在某些非限定性实施方案中，大约50%或大约75%的细胞中差异表达至少2倍的 标志物。在一个评估患者是否患癌症相关疾病的诊断方法(例如，新检测(“筛查”)、复 发的检测、反射测试(reflex testing))中，方法包括比较a)患者样品中标志物的表达水 平，和b)对照非癌症相关疾病样品中标志物的正常表达水平。与正常水平相比较患者样品 中显著更高的标志物表达水平表示患者患有癌症相关疾病。
还提供了用于评估抑制患者的癌症相关疾病的疗法的效果的诊断方法。此类方法 包括比较a)在对患者提供至少一部分治疗之前从患者获得的第一样品中标志物的表达， 和b)在提供部分治疗后从患者获得的第二样品中标志物的表达。相对于第一样品中标志 物的表达水平，第二样品中显著更低的标志物的表达水平表示疗法对于抑制患者的癌症相 关疾病是有效的。应理解，在此类方法中，“疗法”可以是治疗癌症相关疾病的任何疗法，包括但不限 于药物组合物、基因疗法和生物疗法例如抗体和趋化因子的施用。因此，本文中描述的方法 可用于评估治疗前、治疗期间和治疗后的患者，例如用于评估疾病状态的减轻。在某些方面，诊断方法关注于使用化学或生物试剂的疗法。此类方法包括比较a) 从患者获得的并且在化学或生物试剂存在的情况下维持的第一样品中标志物的表达，和b) 从患者获得的并且在所述试剂不存在的情况下维持的第二样品中标志物的表达。相对于第 一样品中标志物的表达水平，第二样品中显著更低的标志物的表达水平表示试剂对于抑制 患者的癌症相关疾病是有效的。在一个实施方案中，第一和第二样品可以是从患者获得的 单个样品的部分或从患者获得的混合样品的部分。评估预后的方法还提供了用于评估患者的癌症相关疾病的进展的监控方法，所述方法包括a)在 第一时间点检测患者样品中标志物的表达；b)在随后的时间点及时重复步骤a)；和c)比 较步骤a)和b)中检测的表达水平，从而监控患者的癌症相关疾病的进展。与第一时间点 上的样品的标志物的表达水平相比，在随后的时间点上的样品中显著更高的标志物的表达 水平表示癌症相关疾病已向前发展，而显著更低的表达水平表示癌症相关疾病已消退。还提供了用于确定癌症相关疾病是否已恶化或可能在将来恶化的诊断方法，所述 方法包括比较a)患者样品中标志物的表达水平，和b)对照样品中标志物的正常表达水 平。与正常水平相比较，患者样品中显著更高的表达水平表示癌症相关疾病已恶化或可能在将来恶化。评估抑制性、治疗性和/或有害组合物的方法还提供了用于选择抑制患者的癌症相关疾病的组合物的检测方法。该 方法包括步 骤a)从患者获得含有细胞的样品；b)在多种受试组合物存在的情况下分别维持样品的等 分；c)比较各等分中标志物的表达；和d)选择其中的一种受试组合物，所述组合物，相对于 在其他受试组合物存在的情况下标志物的表达水平，显著减少含有该受试组合物的等分中 标志物的表达水平。另外提供了评估化合物在引起癌症相关疾病中的有害潜能的检测方法。该方法包 括步骤a)在化合物存在和不存在的情况下维持分开的细胞等分；和b)比较各等分中标志 物的表达。相对于在化合物不存在的情况下维持的等分中标志物的表达水平，在化合物存 在的情况下维持的等分中显著更高的标志物的表达水平表示化合物具有这样的有害潜能。此外，还提供了抑制患者的癌症相关疾病的方法。该方法包括步骤a)从患者获 得含有细胞的样品；b)在多种组合物存在的情况下分别维持样品的等分；c)比较各等分中 标志物的表达；和d)对患者施用至少一种组合物，所述组合物，相对于在其他组合物存在 的情况下标志物的表达水平，在含有该组合物的等分中显著降低标志物的表达水平。样品中标志物的表达水平可以例如通过检测下列物质在样品中的存在来估量相 应的标志物蛋白或所述蛋白的片段(例如，通过使用特异性结合所述蛋白或蛋白片段的试 齐 ，例如抗体、抗体衍生物、抗体片段或单链抗体)、相应的标志物核酸(例如，核苷酸转录 物或其互补序列)或所述核酸的片段(例如，通过将从样品获得的转录的多核苷酸与在其 上附着有一个或多个具有完整的所述核酸的序列或其区段或其互补序列的核酸的基质接 触)、由相应的标志物蛋白直接(即，催化)或间接产生的代谢产物。可使用至少一个或多个(例如，2、3、5或10或更多个)癌症相关疾病标志物进行 任何上述方法。在此类方法中，将多个标志物(其中至少一个是标志物)中的每一个在样 品中的表达水平与多个标志物中的每一个在从未患有癌症相关疾病的对照人获得的相同 类型的样品中的正常表达水平相比较。相对于该标志物的相应的正常或对照水平，一个或 多个标志物或其一些组合在样品中显著改变的(即，如在上述使用单个标志物的方法中所 详细说明的增加或减少)表达水平表示患者患有癌症相关疾病。对于所有上述方法，选择 标志物以使方法的阳性预测值是至少大约10%。候选试剂的实例候选试剂可以是本领域已知的药理学试剂(pharmacologicagent)或可以是之前 未知的具有任何药理活性的试剂。试剂可以是天然产生的或实验室中设计的。它们可从微 生物、动物或植物分离，或可重组产生或通过任何适当的化学方法合成。它们可以是小分 子、核酸、蛋白质、肽或模拟肽(ρ印tidomimetics)。在某些实施方案中，候选试剂是具有大 于50且小于大约2，500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构性 相互作用所必需的官能团。还在生物分子中发现候选试剂，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、 类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。可从多种来源(包括合成的或天然化合物的文库)获得候选试剂。存在例如许 多可获得用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法，包括随机化寡核苷酸和 寡肽的表达。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然化合物的文库是可获得的或可容易地产生。此外，天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、 物理和生物学方法进行修饰，并且可用于产生组合文库。在某些实施方案中，候选试剂可 使用组合文库方法领域中的许多方法中的任一方法来获得，所述方法包括非限定性实例 生物文库法；空间可定位平行固相或溶液相文库法(spatially addressable parallel solidphase or solution phase libraries)；需要角军卷禾只(deconvolution)白勺合成文库 法；“一珠一化合物(one-bead one-compound) ”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库 法。在某些其他实施方案中，可将某些药理学药剂经历定向或随机化学修饰，例如酰 化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以产生结构类似物。用于鉴定治疗癌症相关疾病的治疗剂的相同方法还可用于验证体外研究产生的 前导化合物(lead compound)/试剂。候选试剂可以是上调或下调一个或多个癌症相关疾病应答途径的试剂。在某些实 施方案中，候选试剂可以是影响这样的途径的拮抗剂。用于治疗癌症相关疾病的方法本文提供了用于治疗、抑制、减轻或逆转癌症相关疾病应答的方法。在本文所述的 方法中，对有此需要的个体施用干扰信号级联的试剂，所述个体例如但不限于其中这样的 并发症还不明显的癌症相关疾病患者和已具有至少一种癌症相关疾病应答的患者。在前一种情况下，这样的治疗用于预防此类癌症相关疾病应答的发生和/或减轻 它们发生的程度。在后一种情况下，这样的治疗用于减轻此类癌症相关疾病应答发生的程 度，阻止它们进一步发展或逆转癌症相关疾病应答。在某些实施方案中，干扰癌症相关疾病应答级联的试剂可以是对此类应答特异的 抗体。标志物的表达可以以许多方式抑制标志物的表达，所述方式包括非限定性实例可对癌症相关 疾病细胞提供反义寡核苷酸以抑制标志物的转录、翻译或两者。备选地，可对细胞提供编码 特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且与适当的启动子/调节子区域 有效连接的多核苷酸，以产生抑制所述蛋白的功能或活性的细胞内抗体。标志物的表达和/ 或功能还可通过用特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理癌症相关疾 病细胞来抑制。通过使用本文中描述的方法，可筛选多种分子，特别地包括足够小以使它们 能够穿过细胞膜的分子，以鉴定抑制标志物的表达或抑制标志物蛋白的功能的分子。可对 患者提供如此鉴定的化合物以抑制患者的癌症相关疾病细胞。任何标志物或标志物的组合，以及与所述标志物组合的任何特定标志物可用于本 文中描述的组合物、试剂盒和方法中。一般地，期望使用这样的标志物，对于所述标志物，癌 症相关疾病细胞中该标志物的表达水平与正常细胞中相同标志物的表达水平之间的差异 尽可能大。虽然该差异可以小至用于估量标志物的表达的方法的检测极限，但期望差异至 少大于估量方法的标准误，在一些实施方案中，与正常组织中相同标志物的表达水平相比， 至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000 倍或更大的差异。已公认，某些标志物蛋白被分泌至围绕细胞的细胞外空间。由于此类标志物蛋白 可在癌症相关体液样品中检测，因此将这些标志物用于组合物、试剂盒和方法的某些实施方案，所述体液样品可以比组织活检样品更容易地从人患者收集。此外，用于检测标志物蛋 白的体内技术包括将抗所述蛋白的标记抗体引入受试者。例如，抗体可用其在受试者中的 存在和定位可利用标准成像技术来检测的放射性标记物进行标记。为了确定任何特定的标志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳动物细胞例如人 细胞系中表达标志物蛋白，收集细胞外液体，估量蛋白质在细胞外液体中的存在或不存在 (例如，使用特异性结合所述蛋白的标记抗体)。应理解，含有组织和/或体液细胞的患者样品可用于本文中所述的方法。在这些 实施方案中，标志物的表达水平可通过估量样品中标志物的量(例如，绝对量或浓度)来 估量。当然，可在估量样品中标志物的量之前将细胞样品经历多种收集后制备和贮藏技术 (例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。还应理解，可使标志物流出细胞进入消化系统、血流和/或间质间隙。可以例如通 过检查血清或血浆来检测流出的标志物。组合物、试剂盒和方法可用于检测标志物蛋白的表达，所述标志物蛋白具有至少 一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。例如，可将免疫学方法用于检测完整细胞上的 此类蛋白，或可将基于计算机的序列分析法用于预测至少一个细胞外结构域(即，包括分 泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白质)的存在。可检测标志物蛋白的表达而无 需裂解细胞(例如，使用特异性结合蛋白的细胞表面结构域的标记抗体)，所述标志物蛋白 具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。标志物的表达可通过用多种用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的方法中的任 一种来估量。此类方法的非限定性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白 或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交法、核酸逆转 录法以及核酸扩增法。在特定的实施方案中，标志物的表达可使用特异性结合标志物蛋白或其片段(包 括已经历所有或部分其正常翻译后修饰的标志物蛋白)的抗体(例如，放射性标记的、发色 团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，缀合有底物或蛋白质或蛋 白质-配体对的配体的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等)来估量。在另一个特定的实施方案中，标志物的表达通过下述来估量从患者样品的细胞 制备mRNA/cDNA (即，转录的多核苷酸)，然后将mRNA/cDNA与为标志物核酸的互补序列的参 照多核苷酸或其片段杂交。任选地，可在与参照多核苷酸杂交前使用多种聚合酶链式反应 方法中的任一种来扩增cDNA ；优选，其不进行扩增。同样可使用定量PCR检测一个或多个 标志物的表达以估量标志物的表达水平。备选地，可使用检测标志物的突变或变体(例如， 单核苷酸多态性、缺失等)的许多方法中的任一种来检测患者中标志物的存在。在相关实施方案中，将获自样品的转录的多核苷酸的混合物与在其上固定有多核苷酸(其与标志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更 多个核苷酸残基)互补或同源)的基质接触。如果可在基质上差异地检测到互补或同源的 多核苷酸(例如，可使用不同的发色团或荧光团检测或固定至不同的选择的位置)，那么可 使用单个基质(例如，固定在所选择的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时估量 多个标志物的表达水平。当使用包括将一个核酸与另一个核酸杂交的估量标志物表达的方法时，期望在严格杂交条件下进行杂交。生物标志物的测定在某些实施方案中，可使用质谱法或表面等离子共振术进行生物标志物测定 (biomarker assay)。在不同的实施方案中，鉴定活性抗癌症相关疾病的试剂的方法可包括 a)提供含有一个或多个标志物或其衍生物的细胞的样品；b)从所述细胞制备提取物；c)将 所述提取物与含有标志物结合位点的标记核酸探针混合；和，d)在测试试剂存在或不存在 的情况下测定标志物与核酸探针之间的复合物的形成。测定步骤可包括将所述提取物/核 酸探针混合物经历电泳迁移率试验(electrophoretic mobility shift assay)。在某些实施方案中，测定步骤包括选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于荧光的测 定和超高通量测定，例如，表面等离子共振术(SPR)或荧光相关光谱(FCS)测定的测定。在 此类实施方案中，sra传感器用于指导生物分子相互作用的实时观察，因为sra对金属-电 介质表面上的微小折射率改变非常敏感。Sra是对大约200nm的SI5R传感器/样品介面内 的IO5至10_6折射率(RI)单位的改变敏感的表面技术。因此，sra光谱法用于监控沉积在 传感层上的薄有机薄膜的生长。因为组合物、试剂盒和方法依赖于一种或多种标志物的表达水平的差异的检测， 因此期望标志物的表达水平显著大于用于估量至少一种正常细胞和受癌症影响的细胞中 的表达的方法的最小检测极限。应理解，通过使用一种或多种标志物对另外的患者样品进行常规筛选，将了解某 些标志物在不同类型的细胞，包括特定的癌症相关疾病细胞中过表达。此外，通过就标志物的表达评估更大数量的患者样品，并且使从其获得样品的个 体患者的结果相互关联，还将确认某些标志物的改变的表达与癌症相关疾病强相关以及其 他标志物的改变的表达与其他疾病强相关。从而组合物、试剂盒和方法可用于表征患者的 癌症相关疾病的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种。当组合物、试剂盒和方法用于表征患者的癌症相关疾病的分期、分级、组织学类型 和性质中的一种或多种时，期望选择标志物或标志物组以使在至少大约20%，在某些实施 方案中，至少大约40%、60%或80%和基本上所有患者(其患有相应分期、分级、组织学类 型或性质的癌症相关疾病)中获得阳性结果。可选择本发明的标志物或标志物组以使对于 一般群体可获得大于大约10%的阳性预测值(在非限定性的实例中，外加大于80%的测定 特异性)。当多个标志物用于组合物、试剂盒和方法时，可在单个反应混合物(即，使用针对 各个标记物的试剂，例如不同的荧光探针)或在相应于一个或多个标志物的单独的反应混 合物中，将患者样品中各标志物的表达水平与相同类型的非癌症样品中多个标志物中的每 一个的正常表达水平相比较。在一个实施方案中，相对于相应的正常水平，样品中一个以上 的标志物的显著增加的表达水平表示患者患有癌症相关疾病。当使用多个标志物时，可使 用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多个单独的标志物；在某些实施方案中，可能期望 使用更少的标志物。为了使组合物、试剂盒和方法的灵敏性最大化(即在干扰可归因于患者样品中非 组织和/或体液来源的细胞的情况下)，期望本文中所使用的标志物是具有受限制的组织 分布(例如通常不在非组织细胞中表达)的标志物。
应认识到，组合物、试剂盒和方法对于具有增加的发生癌症相关疾病的风险的患者和他们的医学顾问将是特别有用的。被认为具有增加的发生癌症相关疾病的风险的患者 包括例如具有癌症相关疾病家族史的患者。可以以多种方法估量正常人细胞中标志物的表达水平。在一个实施方案中，该正 常表达水平通过下述来估量估量一部分表现正常的细胞中标志物的表达水平且将该正常 表达水平与一部分怀疑为异常的细胞中的表达水平相比较。备选地，特别是当由于常规进 行本文中所述的方法而可获得进一步的信息时，可使用标志物的正常表达的群体平均值。 在其他实施方案中，标志物的“正常”表达水平可通过估量标志物在从未患有癌症的患者获 得的患者样品、在怀疑癌症相关疾病在患者中发作之前从患者获得的患者样品、编档保存 的患者样品等中的表达来进行测定。本文中还提供了用于估量癌症相关疾病细胞在样品(例如编档保存的组织样品 或从患者获得的样品)中的存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本 上与上述的相同，除了必要时，使组合物、试剂盒和方法适用于除了患者样品外的样品。例 如，当待使用的样品是石蜡包埋的(parafinized)编档保存的人组织样品时，可能必需在 用于估量样品中标志物表达水平的组合物、试剂盒或方法中调整化合物的比例。产生抗体的方法本文中还提供了制备产生用于估量患者是否患有癌症相关疾病的抗体的分离的 杂交瘤的方法。在该方法中，合成或分离(例如通过从其中表达其的细胞纯化或通过体内 或体外转录和翻译编码蛋白质或肽的核酸)含有完整标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽。 使用蛋白质或肽免疫脊椎动物例如哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔或绵羊。任选地(和优选 地)可用蛋白质或肽免疫脊椎动物至少另外一次，从而使脊椎动物呈现强烈的针对蛋白质 或肽的免疫应答。从免疫的脊椎动物分离脾细胞，使用多种方法中的任一种将其与永生化 的细胞系融合从而形成杂交瘤。然后使用标准方法筛选以该方式形成的杂交瘤，从而鉴定 一个或多个产生特异性结合标志物蛋白或其片段的抗体的杂交瘤。本文还提供了通过该方 法制备的杂交瘤和使用这样的杂交瘤制备的抗体。估量功效的方法本文还提供了估量测试化合物抑制癌症相关疾病细胞的功效的方法。如本文中 述，标志物的表达水平的差异与细胞的异常状态相关。虽然公认，某些标志物的表达水平的 变化可能由细胞的异常状态引起，但同样公认，其他标志物的表达水平的变化诱导、维持和 促进此类细胞的异常状态。因此，抑制患者的癌症相关疾病的化合物将使一个或多个标志 物的表达水平改变至更接近该标志物的正常表达水平(即，所述标志物在正常细胞中的表 达水平)的水平。因此本方法包括将在测试化合物存在的情况下维持的第一细胞样品中的标志物 的表达与在测试化合物不存在的情况下维持的第二细胞样品中的标志物的表达相比较。在 测试化合物存在的情况下标志物的显著减少的表达表示该测试化合物抑制癌症相关疾病。 细胞样品可以例如是获自患者的正常细胞的单个样品的等分、获自患者的正常细胞的混合 样品、正常细胞系的细胞、获自患者的癌症相关疾病细胞的单个样品的等分、获自患者的癌 症相关疾病细胞的混合样品、癌症相关疾病细胞系的细胞等。在一个实施方案中，样品是获自患者的癌症相关疾病细胞，并且检测多种据认为对于抑制各种癌症相关疾病是有效的化合物，以鉴定可能最佳地抑制患者的癌症相关疾病 的化合物。同样可将该方法用于估量疗法抑制患者的癌症相关疾病的功效。在该方法中，估 量一个或多个标志物在样品对(一个样品经历疗法，另一个不经历疗法)中的表达水平。与 估量测试化合物的功效的方法一样，如果疗法诱导显著更低的标志物表达水平，则疗法对 于抑制癌症相关疾病是有效的。如上，如果来自选择的患者的样品用于本方法，那么可在体 外估量备选疗法以选择对于抑制患者的癌症相关疾病最可能有效的疗法。用于评估有害潜能的方法如本文中所描述的，人细胞的异常状态与标志物的表达水平的变化相关。还提供 了用于评估测试化合物的有害潜能的方法。该方法包括在测试化合物存在和不存的情况下 维持分开的人细胞等分。比较各等分中标志物的表达。在测试化合物存在的情况下维持的 等分中标志物的显著更高的表达水平(相对于在测试化合物不存在的情况下维持的等分) 表示测试化合物具有有害的潜能。各种测试化合物的相对有害潜能可通过比较相关标志物 的表达水平的增强或抑制的程度，通过比较其表达水平被增强或抑制的的标志物的数目， 或通过比较两者来估量。
分离的蛋白质和抗体一个方面涉及分离的标志物蛋白和其生物活性部分，以及适合用作免疫原以引发 抗标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，天然标志物蛋白可使用标 准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中，含 有完整的标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽通过重组DNA技术产生。除重组表达外，可使 用标准肽合成技术化学合成此类蛋白质或肽。 “分离的，，或“纯化的，，蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞材料或来自细胞 或组织来源(所述蛋白质源自于其)的其他污染性蛋白，或当化学合成时基本上不含化学 前体或其他化学药品。术语“基本上不含细胞材料”包括其中将蛋白质与从其分离或重组 产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞材料的蛋白 质包括具有低于大约30%、20%、10%或5% (按干重计算)的异种蛋白质(在本文中也称 为“污染性蛋白”)的蛋白质制剂。当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，其也优选基本上不含培养基，S卩，培养基 占据低于大约20%、10%或5%的蛋白质制剂的体积。当通过化学合成产生蛋白质时，其优 选基本上不含化学前体或其他化学药品，即，其与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学 药品分离。因此，此类蛋白质制剂具有低于大约30%、20%、10%、5% (按干重计算)的化 学前体或除了目的多肽外的化合物。标志物蛋白的生物活性部分包括含有与标志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源 自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且展示相应的全长蛋 白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应的全长蛋白质的至少一种活性的 结构域或基序。标志物蛋白的生物活性部分可以是其长度为例如10、25、50、100或更多个 氨基酸的多肽。此外，其中标志物蛋白的其他区域被缺失的其他生物活性部分可通过重组 技术来制备，并且可就标志物蛋白的天然形式的一种或多种功能活性对其进行评估。在某 些实施方案中，有用的蛋白质与此类序列之一基本上同一(例如，至少大约40%，在某些实施方案中，50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一)并且保持相应的天然发生的标 志物蛋白的功能活性但因天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同。此外，标志物蛋白的区段文库可用于产生用于筛选和随后选择变异标志物蛋白或 其区段的多肽的多样化(variegated)群体。预测医学本文中还提供了动物模型和标志物在预测医学领域中的用途，其中诊断测定、预 后测定、药物基因组学和监控临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性治疗个体。因 此，本文中还提供了用于测定一个或多个标志物蛋白或核酸的表达水平以确定个体是否处 于发生癌症相关疾病的风险中的诊断测定。此类测定可用于预后或预测目的，从而在癌症 相关疾病发作之前预防性治疗 个体。在另一个方面，方法可用于相同个体的至少周期性筛查以观察该个体是否已暴露 于改变他/她的表达模式的化学药品或毒素。另一方面涉及监控试剂(例如，被施用以抑制癌症相关疾病或治疗或预防任何其 他障碍的药物或其他化合物(例如，以了解这样的治疗可能具有的任何系统性作用))在临 床试验中对标志物的表达或活性的影响。药物基因组学标志物还可用作药物基因组学标志物。如本文中所用的，“药物基因组学标志物” 是其表达水平与患者中特定临床药物应答或易感性相关的目的生物化学标志物。药物基因 组学标志物表达的存在或量与预测的患者应答和更特别地患者的肿瘤对用特定药物或药 物种类的疗法的应答相关。通过估量患者中一个或多个药物基因组学标志物的表达的存在 或量，可选择最适合于患者的或预测具有更大的成功程度的药物疗法。监控临床试验监控试剂(例如，药物化合物)对标志物的表达水平的影响不仅可用于基础药物 筛选，而且还可用于临床试验。例如，可在接受癌症相关疾病治疗的受试者的临床试验中监 控试剂影响标志物表达的有效性。在一个非限定性实施方案中，本发明提供了用于监控利用试剂(例如，激动剂、拮 抗剂、模拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法， 该方法包括步骤(i)在施用试剂之前从受试者获得施用前的样品；(ii)检测一个或多个选 择的标志物在施用前的样品中的表达水平；(iii)从受试者获得一个或多个施用后样品； (iv)检测标志物在施用后样品中的表达水平；(ν)将施用前样品中标志物的表达水平与施 用后样品中标志物的表达水平相比较；以及(Vi)相应地改变试剂至受试者的施用。例如，在治疗过程中增加的标志物基因的表达可表明无效剂量，从而需要增加剂 量。相反地，减少的标志基因的表达可表明有效治疗，从而不需要改变剂量。电子设备可读介质、系统、阵列和使用其的方法如本文中所使用的，“电子设备可读介质”是指用于存储、保存或包含可用电子设 备直接阅读和存取的数据或信息的任何适当介质。此类介质可包括但不限于磁性存储 介质，例如软盘、硬盘存储介质以及磁带；光学存储介质例如光盘；电子存储介质例如RAM、 ROM、EPROM、EEPROM等；以及普通硬盘和这些类别的混合体例如磁性/光学存储介质。可对 介质进行改造或设定以用于在其上记录本文中所述的标志物。
如本文中所用的，术语“电子设备”旨在包括任何适当的计算或处理设备或其他经 改造或设定用于存储数据或信息的装置。适合用于本发明的电子设备的实例包括独立的计 算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网络(WAN)因特网、内联网和外联网；电子器具例如 个人数字助理(PDA)、手机、寻呼机(pager)等；以及局域和分布式处理系统。如本文中所使用的，“记录”是指在电子设备可读介质上存储或编码信息的过程。 本领域技术人员可容易地采用任何用于在介质上记录信息的方法来产生包含本文中所述 的标志物的材料。许多软件程序和格式可用于在电子设备可读介质上存储本发明的标 志物信息。 为了获得或产生在其上记录了标志物的介质，可使用许多数据处理程序构建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或数据库)。通过以可读形式提供标志 物，可常规存取用于多种目的的标志物序列信息。例如，本领域技术人员可使用可读形式的 核苷酸或氨基酸序列来将靶序列或靶结构基序与存储在数据存储工具中的序列相比较。搜 索工具用于鉴定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或区域。因此，本文中还提供了用于保存进行确定受试者是否具有癌症相关疾病或对 癌症相关疾病的易感性的方法的说明书的介质，其中所述方法包括步骤确定标志物 的存在或不存在并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否具有癌症相关疾 病或对癌症相关疾病的易感性和/或推荐用于癌症相关疾病或癌症相关疾病前状况 (pre-cancer-related disease condition)白勺特定治疗。本文中还提供了电子系统和/或在网络中提供了用于确定受试者是否患有癌症 相关疾病或具有对与标志物相关的癌症相关疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步 骤确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否患有 癌症相关疾病或具有对癌症相关疾病的易感性和/或推荐用于癌症相关疾病或癌症相关 疾病前状况的特定治疗。方法还可包括接收与受试者相关的表型信息和/或从网络获取与 受试者相关的表型信息的步骤。本文中还提供了网络，用于确定受试者是否患有癌症相关疾病或具有对与标志物 相关的癌症相关疾病的易感性的方法，所述方法包括步骤接收与标志物相关的信息，接收 与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或癌症相关疾病的信息，并且基 于表型信息、标志物和获取的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有癌症相关疾病或 具有对癌症相关疾病的易感性。方法还包括推荐用于癌症相关疾病或癌症相关疾病前状况 的特定治疗的步骤。本文中还提供了用于确定受试者是否患有癌症相关疾病或具有对癌症相关疾病 的易感性的商业方法，所述方法包括步骤接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的 表型信息，从网络获取相应于标志物和/或癌症相关疾病的信息，并且基于表型信息、标志 物和获得的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有癌症相关疾病或具有对癌症相关疾 病的易感性。方法还包括推荐用于癌症相关疾病或癌症相关疾病前状况的特定治疗的步 马聚ο阵列本文中还提供了可用于测定阵列中一个或多个基因的表达的阵列。在一个实施方 案中，阵列可用于测定组织中基因的表达，从而确定阵列中基因的组织特异性。这样，可就表达同时测定直至大约7000或更多个基因。这使得能够产生显示在一个或多个组织中特 异性表达的一组基因的特征谱。除了此类定性测定外，本文中还提供了基因表达的定量。因此，不仅组织特异性而 且一组基因在组织中的表达水平也是可确定的。因此，可基于基因本身的组织表达和在该 组织中的表达水平来对基因进行分类。这可用于例如确定组织间基因表达的关系。因此， 可干扰一个组织，然后可测定对第二组织中的基因表达的影响。在本说明书中，可测定一种 细胞类型对另一种细胞类型(响应生物刺激)的影响。
此类测定可用于例如在基因表达的水平上了解细胞间相互作用的效果。如果试 剂被治疗性施用以治疗一种细胞类型但其对另一种细胞类型具有不期望的作用，则所述方 法提供了确定不期望的作用的分子基础的测定，从而提供共施用中和剂(counteracting agent)或另外治疗不期望的作用的机会。类似地，即使在单个细胞类型中，可在分子水平上 测定不期望的生物学效应。因此，可确定和中和试剂对非靶基因的表达的作用。在另一个实施方案中，阵列可用于监控阵列中一个或多个基因的表达的时程。如 本文中所公开的，这可发生在各种生物学背景(例如癌症相关疾病的发生，癌症相关疾病 的进展)和过程(例如与癌症相关疾病相关的细胞转化)中。阵列还可用于确定基因的表达或其他基因的表达在相同细胞或不同细胞中的作 用。如果不能调控最终或下游靶，那么这提供了例如用于治疗性干预的备选分子靶的选择。阵列还可用于确定一个或多个基因在正常和异常细胞中的差异表达模式。这提供 了可用作诊断或治疗性干预的分子靶的一组基因。替代 + 示志物(Surrogate Marker)标志物可用作一种或多种障碍或疾病状态或导致癌症相关疾病状态的状况的替 代标志物。如本文中所使用的，“替代标志物”是与疾病或障碍的不存在或存在，或与疾病或 障碍的进展相关的目的生物化学标志物。此类标志物的存在或量不依赖于疾病。因此，此 类标志物可用于指示特定的疗程在减轻疾病状态或障碍中是否有效。当疾病状态或障碍的 存在或程度难以通过标准方法来评估，或当在达到潜在危险的临床终点之前期望评估疾病 进展时，替代标志物是特别有用的。标志物还可用作药效标志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，“药 效标志物”是与药物作用特异性相关的目的生物化学标志物。药效标志物的存在或量与将 对其施用药物的疾病状态或障碍无关；因此，标志物的存在或量表示药物在受试者中的存 在或活性。例如，药效标志物可表示药物在生物组织中的浓度，因为标志物在该组织中表达 或转录，或者不表达或转录与药物的水平相关。这样，药物的分布或吸收可通过药效标志物 来监控。类似地，药效标志物的存在或量可与药物的代谢产物的存在或量相关，这样标志物 的存在或量表示药物在体内的相对分解速率。药效标志物在增加药物作用的检测的灵敏性中特别有用，特别是当以低剂量施用 药物时。由于即使少量的药物也可足以激活多轮的标志物转录或表达，因此扩增的标志物 可以以比药物本身更容易检测的量存在。同样，标志物由于其本身的性质而可以更容易地 进行检测；例如，通过使用本文中描述的方法，可将抗体用于针对蛋白标志物的基于免疫的 检测系统，或可使用标志物特异性放射性标记探针来检测mRNA标志物。此外，药效标志物 的使用可提供由于药物治疗而产生的超出可直接观察的范围的风险的基于机制的预测。
用于检测的方案检测癌症相关疾病的方法包括例如在一段时间内测量各标志物基因在来自受试 者的生物样品中的表达水平和将该水平与对照生物样品中标志物基因的水平相比较。当标志物基因是本文中描述的基因之一并且表达水平差异表达(例如，比对照中 的表达水平更高或更低)时，受试者被判断为患有癌症相关疾病。当标志物基因的表达水 平落在容许的范围内时，受试者不可能患有癌症相关疾病。可通过测量对照中标志物基因的表达水平来预先测定对照的标准值，以比较表达 水平。例如，可基于上述标志物基因在对照中的表达水平来测定标准值。例如，在某些实施 方案中，容许的范围基于标准值采用士2S.D.。在测定标准值后，可通过只测量来自受试者 的生物样品中的表达水平并将该值与测定的对照的标准值相比较来进行检测方法。
标志物基因的表达水平包括标志物基因至mRNA的转录和至蛋白质的翻译。因此， 基于相应于标志物基因的mRNA的表达强度或由标志物基因编码的蛋白质的表达水平的比 较，进行检测癌症相关疾病的一个方法。探针可根据各种基因分析方法在癌症相关疾病的检测中测量标志物基因的表达水平。 具体地，可使用例如利用与此类基因杂交的核酸作为探针的杂交技术，或利用与标志物基 因杂交的DNA作为引物的基因扩增技术。可基于标志物基因的核苷酸序列设计用于检测的探针或引物。本文中描述了各标 志物基因的核苷酸序列的标识号。此外，应理解，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程 中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与癌症相关疾病相关的具有与标志物 基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而 具有核苷酸序列差异。也应理解，标志物基因可包括除了人外的其他物种的同源物。因此，除非明确指 出，否则表述“标志物基因”是指对于物种独特的标志物基因的同源物或已被导入个体的外 源标志物基因。同样，应理解，“标志物基因的同源物”是指来源于除了人以外的物种的基因，其在 严格条件下可作为探针与人标志物基因杂交。这样的严格条件对于本领域技术人员(其可 通过实验或凭经验选择适当的条件来产生相同严格性)来说是已知的。含有标志物基因的核苷酸序列或与标志物基因的核苷酸序列的互补链互补并且 具有至少15个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探针。因此，“互补链”是指由 A:T (对于RNA为U)和G:C碱基对组成的双链DNA中相对于另一条链的一条链。此外，“互补”不仅意指与至少15个连续核苷酸的区域完全互补的序列，而且还指 具有在某些情况下至少40 %，在某些情况下50 %，在某些情况下60 %，在某些情况下70 %， 至少80%、90%和95%或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之间的同源性的程 度可利用算法BLAST等来测定。此类多核苷酸可用作检测标志物基因的探针，或用作扩增标志物基因的引物。当 用作引物时，多核苷酸通常包含15bp至lOObp，在某些实施方案中15bp至35bp的核苷酸。 当用作探针时，DNA包含标志物基因的整个核苷酸序列(或其互补链)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。当用作引物时，3'区域必须与标志物基因互补，而5'区域可连接至限 制性内切酶识别序列或标签(tag)。“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此类多核苷酸可以是合成的或天然发生的。同样， 通常也标记用作杂交探针的DNA。本领域技术人员易于理解此类标记方法。在本文中，术语 “寡核苷酸”意指具有相对低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸内。用于癌症相关疾病的检测可使用例如Northern杂交、斑点印迹杂交或DNA微阵列技术进行利用杂交技术的 癌症相关疾病的检测。此外，可使用基因扩增技术例如RT-PCR法。通过在RT-PCR的基因 扩增步骤中使用PCR扩增监控法，可更加定量地分析标志物基因的表达。在PCR基因扩增监控法中，将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸 收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5' -3'外切核酸酶活 性降解探针时，荧光染料与猝灭剂彼此分离，从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测 量其中靶的拷贝数是已知的标准样品，可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试 者样品中靶的拷贝数。同样，本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法 来进行。
还可通过检测标志物基因编码的蛋白质来进行检测癌症相关疾病的方法。在下文 中，标志物基因编码的蛋白质被描述为“标志物蛋白”。对于此类检测方法，可通过使用结合 各标志物蛋白的抗体来应用例如，Western印迹法、免疫沉淀法和ELISA法。用于检测的结合标志物蛋白的抗体可通过任何适当的技术来产生。同样，为了检 测标志物蛋白，可适当地标记这样的抗体。备选地，可不标记抗体，而是标记特异性结合抗 体的物质例如蛋白A或蛋白G以间接检测标志物蛋白。更特别地，此类检测方法可包括 ELISA 法。可以例如通过将标志物基因或其部分插入表达载体，将构建体导入适当的宿主细 胞来产生转化株，培养所述转化株以表达重组蛋白，然后从培养物或培养上清液纯化表达 的重组蛋白来获得用作抗原的蛋白质或其部分肽。备选地，可化学合成由基因编码的氨基 酸序列或含有由全长cDNA编码的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。此外，可通过使用指数(不仅生物样品中标志物基因的表达水平而且标志物蛋白 的活性)来进行癌症相关疾病的检测。标志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物活性。 可使用各种方法测量每一种蛋白的活性。即使在常规检测中患者未被诊断为患有癌症相关疾病(尽管症状暗示此类疾 病)，这样的患者是否患有癌症相关疾病也可通过按照本文中所述的方法进行检测来容易 地确定。更特别地，在某些实施方案中，当标志物基因是本文描述的基因之一时，其症状至 少暗示对癌症相关疾病的易感性的患者中标志物基因的表达水平的增加或减少表明症状 主要由癌症相关疾病引起。此外，检测可用于确定癌症相关疾病是否在患者中得到改善。换句话说，本文中描 述的方法可用于判断癌症相关疾病治疗的治疗效果。此外，当标志物基因是本文描述的基 因之一时，已被诊断为患有癌症相关疾病的患者中标志物基因的表达水平的增加或减少意 味着疾病已向前发展。
还可基于表达水平的差异测定癌症相关疾病的严重性和/或易感性。例如，当标 志物基因是本文描述的基因之一时，标志物基因的表达水平的增加程度与癌症相关疾病的 存在和/或严重性相关。标志物的表达的控制此外，标志物基因本身的表达可通过向基因的转录调控区导入突变来控制。本领 域技术人员理解此类氨基酸置换。同样，被突变的氨基酸的数目不受特别限制，只要活性得 到保持即可。通常，其在50个氨基酸以内，在某些非限定性实施方案中，在30个氨基酸以 内，在10个氨基酸以内，或在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任何位点，只要活性得到 保持即可。筛选方法在另一个方面，本文中提供了治疗癌症相关疾病的治疗剂的候选化合物的筛选方 法。一个或多个标志物基因选自本文中描述的基因。可通过选择能够增加或减少标志物基 因的表达水平的化合物来获得癌症相关疾病的治疗剂。
应理解，表述“增加基因的表达水平的化合物”是指促进基因转录、基因翻译或蛋 白质活性的表达的步骤中的任一步骤的化合物。另一方面，表述“减少基因的表达水平的化 合物”，如本文中所用的，是指抑制这些步骤中的任一步骤的化合物。在特定的方面，可在体内或体外进行筛选癌症相关疾病的治疗剂的方法。该筛选 方法可以例如通过下列步骤来进行(1)对动物受试者施用候选化合物；(2)测量动物受试 者的生物样品中标志物基因的表达水平；或(3)选择与对照(其未与候选化合物接触)中 标志物基因的表达水平相比较增加或减少标志物基因的表达水平的化合物。在另一个方面，本文中提供了这样的方法，其通过将动物受试者与候选化合物接 触，然后监控化合物对来源于动物受试者的生物样品中标志物基因的表达水平的作用来评 估药剂的候选化合物对标志物基因的表达水平的功效。来源于动物受试者的生物样品中标 志物基因的表达水平的变化可使用与上述检测方法中所用的相同的技术来监控。此外，基 于评估，可通过筛选来选择药剂的候选化合物。试剂盒在另一个方面，提供了各种诊断和检测试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒可用于 估量患者是否患有癌症相关疾病。试剂盒包含用于估量标志物的表达的试剂。在另一个实 施方案中，试剂盒可用于估量化学或生物试剂用于抑制患者的癌症相关疾病的适合性。此 类试剂盒包含用于估量标志物的表达的试剂，并且可包含一种或多种此类试剂。在另外的实施方案中，试剂盒可用于估量癌症相关疾病细胞的存在或治疗癌症相 关疾病。此类试剂盒包含特异性结合标志物蛋白或所述蛋白的片段的抗体、抗体衍生物或 抗体片段。此类试剂盒还可包含多种抗体、抗体衍生物或抗体片段，其中多种此类抗体试剂 特异性结合标志物蛋白或所述蛋白的片段。在另外的实施方案中，试剂盒可用于估量癌症相关疾病细胞的存在，其中试剂盒 包含特异性结合标志物核酸或所述核酸的片段的核酸探针。试剂盒还可包含多种探针，其 中每一种探针特异性结合标志物核酸或所述核酸的片段。本文中所述的组合物、试剂盒和方法尤其可具有下列用途1)估量患者是否患有 癌症相关疾病；2)估量人患者中癌症相关疾病的分期；3)估量患者中癌症相关疾病的分级；4)估量患者中癌症相关疾病的性质；5)估量患者中发生癌症相关疾病的可能性；6)估 量患者中与癌症相关疾病相关的细胞的组织学类型；7)制备用于治疗癌症相关疾病和/或 评估患者是否患有癌症相关疾病的抗体、抗体片段或抗体衍生物；8)估量癌症相关疾病细 胞的存在；9)估量一种或多种测试化合物抑制患者的癌症相关疾病的功效；10)估量疗法 抑制患者的癌症相关疾病的功效；11)监控患者的癌症相关疾病的进展；12)选择抑制患者 的癌症相关疾病的组合物或疗法；13)治疗患有癌症相关疾病的患者；14)抑制患者的癌症 相关疾病；15)评估测试化合物的有害潜能；和16)在处于发生癌症相关疾病的风险中的患 者中预防癌症相关疾病的发生。试剂盒可用于评估癌症相关疾病细胞(例如在样品例如患者样品中)的存在。试剂盒包含多种试剂，每一种所述试剂能够特异性结合标志物核酸或蛋白。适合于结合标志 物蛋白的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。适合于结合标志物核酸(例如基因组 DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定至基质 的寡核苷酸(标记或未标记的)、未与基质结合的标记的寡核苷酸、PCR引物对、分子信标探 针等。试剂盒可任选地包含用于进行本文中所述的方法的另外的成分。例如，试剂盒可 包含适合于使互补核酸退火或适合于使抗体与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如 SSC缓冲液)、一个或多个样品隔室、描述方法的进行的说明书、正常细胞样品、癌症相关疾 病细胞样品等。动物模型可产生用于评估至少一种癌症相关疾病的非人动物模型。该方法包括将动物暴露 于重复剂量的至少一种据认为引起目的癌症的化学药品。在某些方面，该方法还包括收集 一种或多种选择的动物样品；和将收集的样品与一种或多种潜在的癌症起始或发生的指示 物(indicia)相比较。产生动物模型的方法包括在无特定化学药品的环境中维持动物并且用至少一种 据认为引起癌症的化学药品敏化动物。在某些实施方案中，通过多次连续暴露敏化动物的 至少一部分。筛选有效地抗至少一种癌症相关疾病的试剂的方法通常包括对受试动物施 用至少一种试剂，确定试剂是否减轻或加重癌症相关疾病的一个或多个症状；使一个 或多个症状的减轻与试剂抗癌症相关疾病的有效性相互关联；或使一个或多个症状的 减轻的不存在与试剂的无效性相互关联。动物模型用于评估一个或多个代谢途径，所 述代谢途径促成了至少一种癌症相关疾病的起始、进展、严重性、病状、攻击性、分级、活 性、失能(disability)、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在的致病或病理特征中的 至少一种。可利用层次聚类(hierarchical clustering)、特征网络构建(signature networkconstruction)、质谱蛋白组学分析、表面等离子共振术、线性统计建模、偏最小二 乘法判别分析(partial least squares discriminantanalysis)禾口多次线性回归分析中 的一种或多种来进行分析。可通过检查一个或多个标志物或其功能等同物的表达水平来就至少一种癌症相 关疾病评估动物模型。动物模型可用于筛选可用于治疗或预防癌症相关疾病的治疗剂。因此，方法可用于鉴定用于治疗或预防癌症相关疾病的治疗剂。方法包括对由本文中所述方法产生的动物 模型施用候选试剂，评估与未施用候选试剂的对照动物模型相比动物模型中至少一种癌症 相关疾病应答。如果至少一种癌症相关疾病应答在症状上减轻或在发生上延迟，则候选试 剂是用于治疗或预防癌症相关疾病的试剂。癌症相关疾病的动物模型可包括动物，其中一个或多个标志物基因或功能上与标 志物基因等同的基因的表达水平在所述动物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等 同的基因”通常是编码具有与由标志物基因编码的蛋白质的已知活性相似的活性的蛋白质 的基因。功能上等同的基因的代表性实例包括受试动物的标志物基因对应物，其是动物本 身固有的。癌症相关疾病动物模型可用于检测由于癌症相关疾病而引起的生理学变化。在某 些实施方案中，动物模型可用于揭示标志物基因的另外的功能和评估其靶为标志物基因的 药物。在一个实施方案中，癌症相关疾病动物模型可通过控制对应物基因的表达水平或 施用对应物基因来产生。方法可包括通过控制选自本文中所述的基因的基因的表达水平来 产生癌症相关疾病动物模型。在另一个实施方案中，方法可包括通过施用由本文中所描述 的基因编码的蛋白质或施用抗所述蛋白的抗体来产生癌症相关疾病动物模型。还应理解， 在某些其他实施方案中，可过表达标志物，以便可使用适当的方法测量标志物。在另一个实施方案中，癌症相关疾病动物模型可通过导入选自此类基因的基因， 或通过施用由这样的基因编码的蛋白质来产生。在另一个实施方案中，癌症相关疾病可通过抑制选自此类基因的基因的表达或由 这样的基因编码的蛋白质的活性来诱导。反义核酸、核酶或RNAi可用于抑制表达。蛋白质 的活性可通过施用抑制所述活性的物质例如抗体来有效地控制。动物模型可用于阐明癌症相关疾病背后的机制，还可用于检测通过筛选获得的化 合物的安全性。例如，当动物模型产生癌症相关疾病的症状时，或当牵涉某种癌症相关疾病 的测量值在动物中改变时，可构建筛选系统以探测具有减轻疾病的活性的化合物。如本文中所使用的，表述“表达水平的增加”是指下列情况的任一种在人工表达 作为外源基因导入的标志物基因的情况下；在受试动物本身固有的标志物基因的转录和其 至蛋白质的翻译得到增强的情况下；或在作为翻译产物的蛋白质的水解被抑制的情况下。 如本文中所用的，表述“表达水平的减少”是指其中受试动物的标志物基因的转录和其至蛋 白质的翻译被抑制的状态，或其中作为翻译产物的蛋白质的水解被增强的状态。基因的表 达水平可以例如通过DNA芯片上信号强度的差异来测定。此外，翻译产物(蛋白质)的活 性可通过与正常状态中的活性相比较来测定。也在预期的范围内的是动物模型可包括转基因动物，包括例如其中已人工导入 并且表达标志物基因的动物；标志物基因敲除动物；和其中已用另一个基因置换标志物基 因的基因敲入动物。已向其中导入了标志物基因的反义核酸、核酶、具有RNAi作用的多核 苷酸或用作诱饵核酸的DNA等的转基因动物可用作转基因动物。此类转基因动物还包括例 如这样的动物，在所述动物中标志物蛋白的活性已通过将突变导入基因的编码区而被增强 或被抑制，或氨基酸序列已被修饰而变得抗水解或对水解敏感。氨基酸序列中的突变包括 置换、缺失、插入和添加。
治疗性应用本发明可广泛用于多种情况，其中期望能够以快速、有效和受控的方式调节基因 表达的水平(例如通过“打开”和“关闭”基因表达)而不引起多效性或细胞毒性。本发 明可特别用于人中的基因治疗，用于治疗遗传或获得性疾病。基因治疗的一般方法包括将 一个或多个核酸分子导入细胞以使一个或多个由导入的遗传物质编码的基因产物在细胞 中产生，从而恢复或增强功能活性。关于基因治疗方法的综述，参见Anderson，等(1992)； Miller 等(1992) ；Friedmann 等(1989) ；and Cournoyer 等(1990)。然而，目前的基因治疗 载体通常利用对内源转录因子作出应答的组成型调控元件。此类载体系统没有提供在受试 者中调控基因表达的水平的能力。相比之下，本发明的调控系统提供了该能力。为了将本发明的系统用于基因治疗目的，将至少一种DNA分子导入需要基因治疗 的受试者(例如，患有遗传或获得性疾病的人受试者)的细胞以修饰细胞。对细胞进行修饰 以使其包含1)以适合于在宿主细胞中表达诱导型调节子的形式存在的编码本发明的诱 导型调节子的核酸；和2)与组织特异性启动子例如s-shipl启动子有效连接的siRNA(例 如，用于治疗目的)。可使用编码本发明的调控系统的组件的单个DNA分子，或备选地，可使 用编码各组件的分开的DNA分子。可对受试者的细胞进行离体修饰，然后将其导入受试者 或可通过用于将核酸导入细胞的常规技术直接在体内修饰细胞。因此，本发明的调控系统 提供了优于组成型调控系统的有利方面，其允许根据治疗状况的需要而调控基因表达的水 平。在受试者的细胞中待抑制或敲除以治疗遗传或获得性疾病的特别吸引 人的基因 包括编码有害基因产物例如异常蛋白质的基因。非限定性疾病的实例包括贫血症、血液相 关癌症、帕金森病和糖尿病。本发明可用于开发用于治疗目的的自体或同种异体细胞系。例如，在细胞和/或 器官移植中特别吸引人的基因治疗应用可利用本发明。在示例性实施方案中，移植抗原的 下调(例如，通过siRNA下调β2-微球蛋白的表达)允许同种异体细胞的移植同时使患者 的免疫系统产生排异反应的风险降至最低。本发明将允许在不利作用(例如移植的细胞的 不可控制的复制)的情况下关闭RNAi。可使其经历本发明的细胞类型包括造血干细胞、成肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、气 道上皮细胞、皮肤上皮细胞、胰岛细胞、多巴胺能神经元、角质细胞等。关于用于基因治疗 的细胞类型、基因和方法的进一步描述，参见例如，Armentano等(1990) ；WoIff等(1990)； Chowdhury 等(1991) ； Ferry 等(1991) ； Quant in 等(1992) ； Dai 等(1992) ； van Beusechem 等(1992) ；Rosenfeld 等(1992) ；Kay 等(1992) ；Cristiano 等(1993) ；Hwu 等(1993)；以 及 Herz 和 Gerard (1993)。在本发明的特定实施方案中，存在治疗顺从于使用s-ship启动子的治疗的任何 疾病状况的方法。在特定的实施方案中，方法包括制备具有编码与启动子有效连接的治疗 性或诊断性(标志物)基因的区域的多核苷酸构建体，其中由构建体编码的基因用于治疗 所述疾病状况。A.药物制剂、递送和治疗方案在本发明的实施方案中，设想了治疗方法。药物组合物的有效量通常定义为足以 可检测地和重复地改善、减轻、最小化或限制疾病或其症状的程度的量。可使用更严格的定义，包括疾病的消除、根除或治愈。施用途径当然可随损伤的位置和性质而变化，并且包括，例如，皮内、经皮、胃肠 夕卜、静脉内、肌内、鼻内、皮下、透皮、气管内、腹膜内、瘤内、灌注、灌洗、直接注射和□服施用 和制剂。可在与表面活性剂例如羟丙纤维素适当地混合的水中制备以游离碱或药理学上 可接受的盐形式存在的活性化合物的溶液。还可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中和油 中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，此类制剂含有防腐剂以防止微生物生长。适合 于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体以及用于无菌注射液或分散体的临时制 备的无菌粉剂(美国专利5，466，468，明确地以其全文通过引用合并入本文)。在所有情况 下，所述形式必须是无菌的且必须具有达到容易注射的程度的流动性。其在制造和贮存的 条件下必须是稳定的并且必须进行保护以防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可 以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其适当的混合物 和/或植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过 维持所需的颗粒大小(在分散体的情况下)和通过使用表面活性剂来维持。预防微生物的 作用可利用各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞 等来实现。在许多情况下，优选包含等渗剂例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长的吸收 可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。对于水溶液中的胃肠外施用，例如，应当适当缓冲溶液(必要时)并且首先用充 足的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。此类特定的水溶液特别适合用于静脉内、肌内、皮 下、瘤内和腹膜内施用。就此而论，根据本公开内容，可使用的无菌水性介质对于本领域 技术人员来说是已知的。例如，可将一个剂量溶解在Iml等渗NaCl溶液中，然后加入至 IOOOml皮下输液液体(hypodermoclysis fluid)或在打算输注的位点进行注射，(参见，例 如，“Remington' s PharmaceuticalSciences〃 第 15 版，第 1035-1038 页和 1570-1580 页)。取决于待治疗的受试者的状况，剂量必需发生一些变化。负责施用的人将，在任何情 况下，确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足FDA Office of Biologies standards要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度的标准。通过将活性化合物以所需的量与各种上面列举的其他成分(需要时)一起掺入适 当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将不同的已灭菌的活性成分 掺入无菌媒介物(其含有基本分散介质和所需的来自上面例举的那些的其他成分)来制备 分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻 干燥技术(所述技术从其之前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何额外的期望的成分的 粉剂)。可以以中性或盐形式制备本文中公开的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐 (与蛋白质的游离氨基形成的)，其由无机酸例如盐酸或磷酸，或这样的有机酸如乙酸、草 酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐还可来源于无机碱例如，氢氧化钠、氢氧化 钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因 等。在配制后，以与剂量配方(dosage formulation)相容的方式和以这样的量如治疗有效 量施用溶液。制剂可以以多种剂型例如注射液、药物释放胶囊等容易地施用。如本文中所用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和 试剂用于药物活性成分的用途在本领域内是熟知的。除非任何常规介质或试剂与所述活性 成分不相容，否则预期其在治疗性组合物中的用途。还可将补充活性成份掺入组合物中。短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用给人时不产生变应性 反应或类似的不利反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制 备在本领域内是熟知的。通常，此类组合物可制备为可注射的液体溶液或悬浮液；还可制备 适合用于在注射前配制于液体形式的溶液或悬浮液中的固体剂型。B.联合治疗可在常规疗法的背景中使用本发明的化合物和方法。为了增加使用本发明的组合 物的治疗的功效，可能期望将此类组合物与有效治疗此类疾病和状况的其他试剂组合。例 如，可用本发明的治疗性化合物和其他抗癌疗法例如抗癌剂或手术进行癌症的治疗。同样， 血管疾病或状况的治疗可包括本发明和常规血管药物或疗法。
可应用不同的组合；例如，本发明的宿主细胞是“A”并且第二抗癌剂/疗法是“B” TABLE-US-00005 Α/Β/Α Β/Α/Β Β/Β/Α Α/Α/Β Α/Β/ΒΒ/Α/Α Α/Β/Β/Β Β/Α/Β/Β Β/Β/Β/Α B/B/ Α/Β A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/AB/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/ A/B/A。考虑到治疗的毒性(如果有的话)，本发明的治疗性表达构建体至患者的施用将 遵从用于施用该特定的第二疗法的一般方案。预期必要时重复治疗周期。还设想可将各种 标准疗法以及手术介入(surgicalintervention)与所述疗法组合使用。本文中所引用的所有专利、专利申请和参考文献以其全文通过引用合并入本文。 虽然对于制备和使用其的本领域技术人员来说已十分详尽地描述和例示了本发明，但各种 改变、修饰和改进是显然的，且不背离本发明的精神和范围。本领域技术人员易于理解，本 发明可进行适当地改变以适合实现目的和获得提及的目标和有利方面以及其中固有的那 些。本文中所描述的方法和试剂代表优选实施方案，是示例性的，并且不意欲限制本 发明的范围。其中的改进和其他用途对于本领域技术人员来说显然的。这些改进包括在本 发明的精神内并且由权利要求的范围界定。对于本领域技术人员来说，同样极显然的是可 对本文中公开的发明进行各种替代和改进而不背离本发明的范围和精神。应理解，虽然本发明已通过优选实施方案和任选特征明确地公开，但本领域技术 人员可采用本文中公开的概念的改进和变化，并且此类改进和变化被认为在由所附权利要 求界定的本发明的范围内。虽然通过参考各种和优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解， 可进行各种变化并且可用等同物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许 多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。因此，本发明不意欲限定于本文中公开的预期用于进行本发明的特定实施方案， 而是意欲包括落在权利要求的范围内的所有实施方案。根据本公开内容，可制备和执行本文中公开和要求保护的所有组合物和/或方法 和/或设备。虽然已根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术 人员很明显的是，可对本文中描述的组合物和/或方法和/或设备以及方法的步骤或步骤的顺序进行变动而不背离本发明的概念、精神和范围。更特别地，很明显的是，可用在化学 和生理学上都相关的某些试剂替代本文中描述的试剂同时获得相同或相似的结果。对于本 领域内技术人员来说很显然的所有此类类似的替代和修改视为在由所附权利要求界定的 本发明的精神、范围和概念之内。在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明 书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用合并入本文以更全面地描 述本发明涉及的现有技术。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，细 胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学领域)技术人员通常所理解的意义相 同的意义。标准技术用于在本领域技术人员的能力范围 之内的分子、遗传学和生物化学方 法。此类技术在文献中得到详尽的解释。参见，例如，Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 2 版，由 Sambrook,Fritsch禾口 Maniatis 编著(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) ；DNA Cloning,第 I 和 II 卷(Glover ed.，1985) ；Oligonucleotide Synthesis (Gait ed.，1984) ;Mullis 等，美国专 ^lJ 4, 683, 195 ；Nucleic Acid Hybridization(Hames & Higgins eds. ,1984) ；Transcription And Translation(Hames & Higgins eds. ,1984) ；Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) ；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press,1986) ；Perbal, A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984) ；the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N. Y. ) ；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells (Miller 禾口 Calos eds. ,1987, Cold Spring HarborLaboratory) ；Methods In Enzymology，第 154 禾口 155 卷(Wu 等 eds.)， Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer 禾口 Walker, eds., Academic Press,London,1987) ；Handbook OfExperimental Immunology,第 I-IV卷(Weir 禾口 Blackwell, eds. , 1986) ；The Laboratory Rat,主编:Mark A. Suckow ；作者Sharp 禾口 LaRegina. CRC Press，Boston，1988，所述文献通过引用合并入本文)和化学方法。参考文献本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的公开 案和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见提供于下列参考书目中。本文中引用的任何文献的引用不意欲作为任何前述内容是相关现有技术的承认。 关于日期的所有声明和关于这些文献的内容的所有陈述基于申请人可获得的信息，并且不 构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。1. Ambros, V. (2003). MicroRNA pathways in flies and worms growth, death， fat，stress，and timing. Cell 113,673-676.2.Ambros, V. (2004).The functions of animal microRNAs. Nature 431， 350-355.3. Balmain,A. ,Gray, J. W. ,and Ponder,B. A. (2003). The genetics and genomics ofcancer. Nat Genet 33 Suppl，238-244.4. Bejerano，G.，Haussler, D.，and Blanchette，M. (2004a). Into the heart of darkness :large_scale clustering of human non-coding DNA. Bioinformatics 20， 140-148.
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权利要求
区分人癌症的方法，其包括使用一个或多个转录的超保守区域(T-UCR)的表达特征谱，其中UCR的基因组定位与分析的癌症相关基因组元件之间的相关性在统计学上是高度显著的并且与对于miRNA所报导的相关性相当。
2.权利要求1的方法，其中一个或多个在人癌症中差异表达的T-UCR位于与该类型的 癌症特异性相关的癌症相关基因组区域(CAGR)。
3.权利要求1的方法，其中7个UCR(uc.347至uc. 353)的簇位于CAGR内。
4.权利要求3的方法，其中两个UCR:uc.349A(P)和uc. 352 (N)在正常与恶性B-CLL ⑶5阳性细胞之间差异表达的T-UCR之中。
5.权利要求4的方法，其中一个或多个UCR位于在恶变过程中改变的基因组区域中。
6.权利要求1的方法，其中一个或多个T-UCR是癌症易感性的候选基因。
7.权利要求1 的方法，其中 5 个 UCR，uc. 269A (N)、uc. 160 (N)、uc. 215 (N)、uc. 346A (P) 和uc.348(N)的特征用于区分两个CLL预后组群。
8.权利要求1的方法，其中5个UCR中的3个与来自所述特征的13个miRNA中 的5个具有显著的反义互补性，从而产生6个可能的相互作用对uc. 160::miR-24、 uc. 160::miR-155、uc. 160::miR-223、uc. 160::miR-146a、uc.346A::miR-155 禾P uc. -348::miR-29b。
9.权利要求8的方法，其中所述UCR位于在恶变过程中被靶向的基因组区域中并且预 示着可能参与人肿瘤发生。
10.相应于uc. 246 (E)的 cDNA。
11.通过标准方法克隆和表达的权利要求10的cDNA。
12.相应于uc. 269A (N)的 cDNA。
13.通过标准方法克隆和表达的权利要求12的cDNA。
14.权利要求1的方法，其中所述T-UCR在结肠癌中具有uc.73 (P)的致癌功能，其中其 过表达的减少诱导细胞凋亡并且在异常表达所述T-UCR的结肠癌细胞中具有抗增殖作用。
15.用于评估其中两个或多个类型的ncRNA相互作用且影响表型的功能调控途径的方 法，其包括确定癌症患者中UCR与miRNA的表达之间的相关性。
16.权利要求15的方法，其中所述癌症是CLL。
17.权利要求16的方法，其中所述相关性包括miRNA: T-UCR相互作用的存在。
18.权利要求15的方法，其中一个或多个nc-UCG在癌症患者中在基因组水平上发生改变。
19.权利要求18的方法，其中所述癌症患者患有白血病。
20.其中编码和非编码基因都参与人肿瘤发生且在其中协同作用的模型，其包括一个 或多个UCR。
21.诊断受试者是否患有与癌症相关染色体特征相关的癌症或处于发生所述癌症的风 险中的方法，其包括通过下述方法评估受试者中至少一个紧邻癌症相关染色体特征的UCR 基因的状态(i)测量来自所述受试者的受试样品中至少一个来自受试样品中UCR基因的UCR基因 产物的水平，其中相对于对照样品中相应的UCR基因产物的水平，受试样品中UCR基因产物 的水平的改变表示受试者患有所述癌症或正处于发生所述癌症的风险中；(ii)就缺失、突变或扩增分析受试样品中所述至少一个UCR基因，其中与对照样品中 相应的UCR基因相比，UCR基因中缺失、突变和/或扩增的检测表示受试者患有所述癌症或 正处于发生所述癌症的风险中；和/或(iii)测量受试样品中所述至少一个UCR基因的拷贝数，其中对于常染色体或雌性性 染色体上的UCR基因，除两个拷贝外的拷贝数，或对于雄性性染色体上的UCR基因，除一个 拷贝外的拷贝数表示受试者患有所述癌症或正处于发生所述癌症的风险中。
22.权利要求21的方法，其中所述癌症相关染色体特征选自癌症相关基因组区域；染 色体脆性位点；人乳头状瘤病毒整合位点；和同源异型框基因或基因簇。
23.权利要求1的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、食管癌、肺癌、胃癌症、肾癌症、子 宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、尤文肉瘤、血液肿瘤、实体瘤、胃癌、结肠直肠癌、脑癌、上 皮癌、鼻咽癌、子宫癌、肝癌、头颈癌、肾癌、雄性生殖细胞肿瘤、恶性间皮瘤、骨髓增生异常 综合征、胰腺或胆管癌、前列腺癌、甲状腺癌、尿路上皮癌、肾癌、Wilm' s肿瘤、小细胞肺 癌、黑色素瘤、皮肤癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、白血病(急性淋巴细胞性白血病、急性髓性 白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤 和横纹肌肉瘤。
24.权利要求1的方法，其中所述癌症相关染色体特征是染色体脆性位点。
25.权利要求10的方法，其中所述UCR基因选自7个UCR(uc.347至uc. 353)的簇；和其组合。
26.权利要求17的方法，其中所述癌症是白血病。
27.诊断受试者是否患有癌症或处于发生癌症的风险中的方法，其包括(1)逆转录 来自从受试者获得的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；(2)将靶寡脱氧核苷酸 与含有一个或多个UCR特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交特征 谱；和(3)将受试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中信号的改 变表示受试者患有癌症或正处于发生癌症的风险中。
28.权利要求27的方法，其中所述癌症是与癌症相关染色体特征相关的癌症。
29.权利要求27的方法，其中所述癌症是B细胞慢性淋巴细胞性白血病。
30.诊断受试者是否患有与受试者中一个或多个不利预后标志物相关的癌症或处于发 生所述癌症的风险中的方法，其包括(1)逆转录来自从受试者获得的受试样品的RNA以提 供一组靶寡脱氧核苷酸；(2)将靶寡脱氧核苷酸与含有一个或多个UCR特异性探针寡核苷 酸的微阵列杂交，从而提供所述受试样品的杂交特征谱；和(3)将受试样品杂交特征谱与 从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中信号的改变表示受试者患有所述癌症或正处于 发生所述癌症的风险中。
31.权利要求30的方法，其中所述癌症是B细胞慢性淋巴细胞性白血病。
32.诊断受试者是否患有癌症或处于发生癌症的风险中的方法，其包括分析来自所述 受试者的受试样品中至少一个与癌症相关的UCR基因或基因产物，其中与对照样品中相应 的UCR基因或基因产物相比较，UCR基因或基因产物中突变的检测表示受试者患有癌症或 正处于发生癌症的风险中。
33.权利要求46的方法，其中至少一个miR基因或基因产物选自其中所述UCR基因选 自7个UCR(uc. 347至uc. 353)的簇；和其组合。
34.权利要求33的方法，其中所述癌症是B细胞慢性淋巴细胞性白血病。
35.包含UCR基因产物和药学上可接受的载体的药物组合物，其中分离的UCR基因产物 来自紧邻癌症相关染色体特征的UCR基因。
36.权利要求35的药物组合物，其中所述癌症相关染色体特征选自癌症相关基因组区 域和染色体脆性位点。
37.包含核酸和药学上可接受的载体的药物组合物，所述核酸编码分离的来自紧邻癌 症相关染色体特征的UC基因的UCR基因产物。
38.权利要求37的药物组合物，其中所述癌症相关染色体特征选自癌症相关基因组区 域、染色体脆性位点、人乳头状瘤病毒整合位点和同源异型框基因或基因簇。
39.治疗受试者的癌症的方法，其包括(1)提供患有与癌症相关染色体特征相关的癌症的受试者，其中与对照细胞相比较，至 少一个分离的来自紧邻癌症相关染色体特征的UCR基因的UCR基因产物在受试者的癌细胞 中被下调或上调；和(2)(a)当所述至少一个分离的miR基因产物在癌细胞中被下调时，对受试者施用有效 量的至少一种分离的来自所述至少一个UCR基因的miR基因产物，以使受试者中癌细胞的 增殖被抑制；或(b)当所述至少一个分离的UCR基因产物在癌细胞中被上调时，对受试者施 用有效量的至少一种抑制所述至少一个UCR基因的表达的化合物，以使受试者中癌细胞的 增殖被抑制。
40.权利要求39的方法，其中癌症相关染色体特征选自癌症相关基因组区域和染色体 脆性位点。
41.治疗与癌症相关染色体特征相关的癌症的方法，其包括(1)确定相对于对照细胞，来自受试者的癌细胞中从至少一个紧邻癌症相关染色体特 征的UCR基因表达的UC基因产物的量；和(2)通过下列方法改变癌细胞中表达的UC基因产物的量(i)如果癌细胞中表达的UCR基因产物的量低于对照细胞中表达的miR基因产物的量， 则对受试者施用有效量的至少一种分离的来自所述UCR基因的miR基因产物；或(ii)如果癌细胞中表达的UCR基因产物的量高于对照细胞中表达的UCR基因产物的 量，则对受试者施用有效量的至少一种抑制所述至少一个UCR基因的表达的化合物，以使 受试者中癌细胞的增殖被抑制。
42.权利要求41的方法，其中所述癌症相关染色体特征选自癌症相关基因组区域和染 色体脆性位点。
43.权利要求42的方法，其中所述癌症相关染色体特征是染色体脆性位点。
44.权利要求43的方法，其中所述癌症相关染色体特征是癌症相关基因组区域。
45.前述权利要求的任一项的方法，其中所述癌症选自白血病、肺癌、食管癌、胃癌、 结肠直肠癌、脑癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、上皮癌、鼻咽癌、淋巴瘤、子宫癌、肝癌、头颈 癌、肾癌、雄性生殖细胞肿瘤、恶性间皮瘤、骨髓增生异常综合征、卵巢癌、胰腺或胆管癌、前 列腺癌、甲状腺癌和尿路上皮癌。
46.用于评估一个或多个代谢途径的标志物，所述代谢途径促成至少一种肺癌相关疾 病的起始、进展、严重性、病状、攻击性、分级、活性、失能、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在的致病或病理特征中的至少一个，其中所述标志物包括一个或多个UCR基因产物。
47.包含一种或多种前述权利要求的标志物的组合物。
48.鉴定受试者中至少一种癌症相关疾病的起始或发生的可能性的方法，所述方法测 量一种或多种前述权利要求的任一项的标志物。
49.权利要求48的方法，其中一种或多种标志物存在于分离的样品中并且在体外进行 所有方法步骤。
50.用于检测癌症相关疾病的试剂，其中所述试剂包含含有至少一种前述权利要求的 任一项的标志物的核苷酸序列或与所述标志物的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸。
51.用于检测癌症相关疾病的试剂，其中所述试剂包含识别由至少一种前述权利要求 的任一项的标志物编码的蛋白质的抗体。
52.用于检测癌症相关疾病的DNA芯片，在所述芯片上已固定探针以测定至少一种前 述权利要求的任一项的标志物。
53.评估疗法预防、诊断和/或治疗至少一种肺癌相关疾病的有效性的方法，其包括(1)将动物经历其有效性待评估的疗法，和(2)通过评估至少一种前述权利要求的任一项的标志物来测定被测试的疗法在治疗或 预防肺癌相关疾病中的有效性水平。
54.权利要求53的方法，其中所述候选治疗剂包含药物组合物、营养食品组合物和顺 势疗法组合物中的一种或多种。
55.权利要求54的方法，其中所述待评估的疗法用于人受试者。
56.权利要求55的方法，其中所述方法不是通过手术或疗法治疗人或动物体的方法。
57.在动物模型中就起始癌症相关疾病应答的能力估量至少一种材料的潜能的方法， 所述方法包括(1)在将所述动物暴露于一种或多种在量上足以在所述动物中起始癌症相关疾病应答 的材料后，测量一种或多种被上调或下调的前述权利要求的任一项的标志物；和(2)确定至少一种被上调或下调的标志物是否具有起始癌症相关疾病应答的能力。
58.用于治疗癌症相关疾病的药物组合物，其包含至少一种选自7个UCR(uc. 347至uc. 353)的簇和其组合的UCR基因产物；和 药学上可接受的载体。
59.权利要求59的药物组合物，其中所述至少一种miR基因产物相应于与适当的对照 细胞相比，在癌细胞中被上调或下调的UCR基因产物。
60.权利要求59的药物组合物，其中所述肺癌相关疾病是腺癌。
61.用于治疗肺癌的药物组合物，其包含 至少一种UCR表达抑制化合物，和药学上可接受的载体，其中所述至少一种UCR表达抑制化合物对于选自7个UCR(uc. 347至uc. 353)的簇和 其组合的miR基因产物是特异性的。
62.权利要求61的药物组合物，其中所述至少一种UCR表达抑制化合物对于与适当的对照细胞相比，在癌细胞中被上调或下调的UCR基因产物是特异性的。
63.一种制品，其包含至少一种结合癌症相关疾病的标志物的捕获试剂，所述标志物 选自至少一种前述权利要求的任一项的标志物。
64.用于筛选治疗癌症相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种前述权利要求的任一项的标志物的一种或多种试剂，和表达至少一种标志物的细胞。
65.权利要求64的试剂盒，其中使用含有特异性结合至少一种标志物的抗体或抗体片 段的试剂检测所述标志物的存在。
66.权利要求65的试剂盒，其中所述试剂是标记的、放射性标记的或生物素标记的，和 /或其中所述抗体或抗体片段是放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的。
67.权利要求66的试剂盒，其还包括装有至少一种标志物的容器。
68.权利要求67的试剂盒，其中所述试剂包含抗体、所述试剂连接或可连接至其的探 针和固定化的金属螯合物中的一种或多种。
69.肺癌相关疾病的筛选试验，其包括将一种或多种前述权利要求的任一项的标志物与此类标志物的底物以及与测试试剂 接触，和确定所述测试试剂是否调节所述标志物的活性。
70.权利要求69的筛选试验，其中在体外进行所有方法步骤。
71.用于预测受试者中癌症相关疾病的存在的微阵列，其包含抗至少一种前述权利要 求的任一项的标志物的抗体。
72.权利要求71的方法，其中通过检测转录的多核苷酸或其部分的存在来估量所述标 志物的表达水平，其中所述转录的多核苷酸包含所述标志物的编码区。
73.权利要求72的方法，其中所述样品是癌症相关体液或组织。
74.权利要求73的方法，其中所述样品包含获自所述患者的细胞。
75.用于在有此需要的个体中治疗、预防、逆转或限制癌症相关疾病并发症的严重性的 方法，包括对所述个体施用干扰至少一种癌症相关疾病应答的信号转导途径的试剂，以足以干扰 此类信号转导的量，其中所述试剂包含至少一种UCR基因产物。
76.干扰至少一种肺癌相关疾病应答的信号转导途径的试剂用于制造药物的用途，所 述药物用于在个体中治疗、预防、逆转或限制癌症相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种UCR基因产物。
77.用于在有此需要的个体中治疗、预防、逆转或限制癌症相关疾病并发症的严重性的 方法，包括对所述个体施用干扰至少一种癌症相关疾病应答的级联的试剂，其中所述试剂包含至少一种UCR基因产物。
78.干扰至少一种癌症相关疾病应答的级联的试剂用于制造药物的用途，所述药物用 于在个体中治疗、预防、逆转或限制癌症相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种UCR基因产物。
79.包含具有多个数字编码的参照特征谱的数据库的计算机可读介质，其中至少第一 参照特征谱代表了来自一个或多个展示癌症相关疾病应答的指标的受试者的一个或多个 样品中至少第一标志物的水平，其中所述标志物包括一种或多种UCR基因产物。
80.权利要求79的计算机可读介质，其包含至少第二参照特征谱，所述第二参照特征 谱代表了来自一个或多个展示癌症相关疾病应答的指标的受试者或患有癌症相关疾病的 受试者的一个或多个样品中至少第二标志物的水平。
81.用于确定受试者是否患有癌症相关疾病、是否易于患有所述疾病或是否具有对于 所述疾病的不良存活预后的计算机系统，其包括前述权利要求的任一项的数据库，和包含计算机可执行编码的服务器，所述编码使计算机接收受试者的特征谱，从数据库 鉴定在诊断上与受试者特征谱相关的匹配的参照特征谱，并且产生受试者是否患有或易于 患有癌症相关疾病的指示。
82.用于评估受试者中癌症相关疾病的存在、不存在、性质或程度的计算机辅助方法， 包括(1)提供包含用于对来自从所述受试者获得的样品的数据进行分类的模型或算法的计 算机，其中所述分类包括分析关于至少一种标志物的存在、不存在或量的数据，和其中所述标志物包括一种或多种miR基因产物；(2)输入来自从所述受试者获得的生物样品的数据；和(3)对所述生物样品进行分类以表明癌症相关疾病的存在、不存在、性质或程度。
83.权利要求82的方法，其中所述至少一种UCR基因产物和其组合包括其分离的变体 或生物活性片段或功能等同物，或与其结合的抗体。
84.权利要求83的方法，其中所述UCR基因产物选自7个UCR(uc.347至uc. 353)的 簇；和其组合。
85.癌症的动物模型，其中存在一种或多种UCR基因产物的至少一种改变的表达。
86.权利要求85的动物模型，其中所述动物模型是非人脊椎动物。
87.权利要求86的动物模型，其中所述动物模型是小鼠、大鼠、兔或灵长类动物。
全文摘要
本文中描述了用于区分人癌症的方法，包括使用一个或多个转录的超保守区域(T-UCR)的表达特征谱，其中UCR的基因组定位与分析的癌症相关基因组元件之间的相关性(association)在统计学上高度显著，并且与对于miRNA所报导的相关性相当。
文档编号A61P35/00GK101835902SQ200880108689
公开日2010年9月15日 申请日期2008年8月4日 优先权日2007年8月3日
发明者C·M·克罗斯 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会