用于microRNA-146a基因及前区内单核苷酸多态性检测的扩增和测序引物及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于聚合酶链反应（PCR)和DNA测序技术的分子生物学方法，尤其涉 及一种用于microRNA(miR) 146a基因及其基因前区内5个单核苷酸多态性（SNP)检测的扩 增和测序引物及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 微小RNA(microRNA，miR)是内源性的长度约19-21核苷酸的单链非编码RNA，能够 调节编码基因的表达。这些RNA分子以错综复杂的方式调节蛋白的水平而不是完全抑制靶 基因的表达。尽管这些作用可能很轻微，但有大量的基因受miR调控，表明它们是很重要的 调节分子。目前大家都认同miR在许多复杂的生物学活动中发挥着重要作用，比如胚胎发 育、组织识别、增殖、分化、凋亡、信号通路、新陈代谢、肿瘤和病毒感染等。近来还发现miR 与自身免疫性疾病有关。在众多miR中，miR-146a是研宄热点。
[0003] 此miRNA的生物合成过程主要包括miRNA基因转录、核内前体RNA合成、核输 出、胞楽加工和装配等。MiR_146a rs2910164G/C等位基因位于pre-miR_146a的第60 个核苷酸，即在miR-146a上。等位基因 C会引起pre-miR-146a发卡结构的错配，使Λ G 从-43. lkcal/mol 降为-40. 3kcal/mol，从而降低 pri-miR 的稳定性、pri-miR 形成 pre-miR 的效率或者 pre-miR 形成 miR-146a 的效率。而 rs2431697、rs57095329、rs6864584、 rs2277920位于miR-146a基因的之前的基因间隔区，可能影响miR-146a的表达效率。目前， 这些单核苷酸多态性研宄较多的是与疾病相关性研宄，包括肿瘤、银肩性关节炎、多发性硬 化、结核、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有分子诊断技术中检测miR-146a所要包含的SNP类型多、 检测不全面的缺陷，提供一套优化引物用于PCR扩增和测序，能在相同条件下一次性进行4 个PCR，顺利对包含miR-146a的基因片段进行扩增和测序。
[0005] 本发明第二个目的是提供一种配套此引物进行miR-146a基因及前区序列内5个 SNP检测的特定的PCR反应程序，达到快速扩增的目的。
[0006] 本发明第三个目的是提供一种对临床标本进行miR-146a基因及其前区序列内 SNP进行序列分析的荧光PCR扩增试剂盒。
[0007] 本发明的技术方案概述如下：
[0008] 用于microRNA-146a基因及前区内单核苷酸多态性检测的扩增和测序引物，包括 含rs2431697核酸片段的扩增和测序引物为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,含rs57095329 和rs6864584核酸片段的扩增和测序引物为SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4,含rs2277920核 酸片段的扩增和测序引物为SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6,含rs2910164核酸片段的扩增和 测序引物为 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8。
[0009]配套扩增包括 rs2431697、rs57095329、rs6864584、rs2277920、rs2910164 核酸片 段的PCR反应，为95°C预变性3min后，94°C变性15s，56°C退火15s，72°C延伸35s，进行35 个循环，然后保存在25°C ;及时取出进行测序。
[0010] 一种用于micr〇RNA-146a基因及前区内单核苷酸多态性检测的扩增和测序试剂 盒：
[0011] 试剂A :由2mL缓冲液组成，包含2 X SYBR? Green I染料，0. 2mM dNTPs (包括dATP、 dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2S04、6mM MgS04、100U Taq DNA 聚 合酶；
[0012] 试剂SI :由针对含rs2431697核酸片段的测序引物30 μ L水溶液，包含4 μ MSEQ ID NO. 2 ；
[0013] 试剂S2 :由针对含rs57095329和rs6864584核酸片段的测序引物30 μ L水溶液， 包含 4 μ M SEQ ID NO. 4 ;
[0014] 试剂S3:由针对含rs2277920 核酸片段的测序引物30μL水溶液，包含4μMSEQ ID NO. 6 ；
[0015] 试剂S4:由针对含rs2910164 核酸片段的测序引物30μL水溶液，包含4μMSEQ ID NO. 8 ；
[0016] 包被引物的PCR反应管：
[0017] -号反应管：含有针对含rs2431697核酸片段的扩增引物混合组成，包含 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 1 和 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 2 ;
[0018] 二号反应管：含有针对含rs57095329和rs6864584核酸片段的扩增引物混合组 成，包含 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 3 和 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 4 ;
[0019] 三号反应管：含有针对含rs2277920核酸片段的扩增引物混合组成，包含 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 5 和 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 6 ;
[0020] 四号反应管：含有针对A含rs2910164核酸片段的扩增引物混合组成，包含 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 7 和 I. 5X l(T2nmol SEQ ID NO. 8 ;
[0021] 五号反应管：同一号管；
[0022] 六号反应管：同二号管；
[0023] 七号反应管：同三号管；
[0024] 八号反应管：同四号管。
[0025] 本发明优点：
[0026] 1)提供了一套可进行快速PCR的引物和优化的测序引物，一次性扩增所有 miR-146a所有5个SNP的序列用于后续测序；2)反应体系中带荧光染料，可以直接通过荧 光定量PCR观察扩增结果，避免电泳带来的不便和污染；3)引物直接包被在反应管中，避免 引物配置困难。通过优化实验反应体系和反应条件，组成简单、快速、灵敏、特异的检测试剂 盒，可用于对临床标本的检测，可减少人力和物力，提供更多的实验信息。
【附图说明】
[0027] 图1为miR-146a基因及前区内的SNP分布。
[0028] 图2为人miR-146a基因及前区内SNP的测序结果。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0030] 本发明的扩增和测序引物核苷酸序列为：
[0031] SEQ ID NO. 1 5' -attatgattggcaaatggaagg-3'
[0032] SEQ ID NO. 2 5' -tttggctggatggaggat-3'
[0033] SEQ ID NO. 3 5' -attgggcagccgataaag-3'
[0034] SEQ ID NO. 4 5' -ctcctcgttgtgctactgtctc-3'
[0035] SEQ ID NO. 5 5' -ggagacagtagcacaacgag-3'
[0036] SEQ ID NO. 6 5' -tagccatagtcttccaaccc-3'
[0037] SEQ ID NO. 7 5' -cccacatcagccttccag-3'
[0038] SEQ ID NO. 8 5' -ccaggtcctcaagcccac-3'
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