一种抑制i型登革病毒复制的重组慢病毒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抑制I型登革病毒复制的重组慢病毒，该慢病毒含有基于I型登革病毒prM基因保守区序列设计合成的表达shRNA，该shRNA在宿主细胞中经Dicer酶等加工转变成针对prM基因的siRNA，干扰prM蛋白的表达，以达到抑制登革病毒复制、保护宿主不被登革病毒感染的功能。
【专利说明】—种抑制I型登革病毒复制的重组慢病毒
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组慢病毒，具体涉及一种能抑制I型登革病毒复制的重组慢病毒。【背景技术】
[0002](I)登革病毒
[0003]登革病毒(dengue virus, DENV)是登革热、登革出血热和登革休克综合征的病原体.登革病毒归于黄病毒科(flaviviridae)中的黄病毒属.根据包膜蛋白的抗原特异性差异，登革病毒分为4个血清型，即I型、II型、III型、IV型登革病毒.[0004]病毒结构与基因组
[0005]成熟的登革病毒颗粒呈球形，直径45~55纳米，由包膜、衣壳和核酸组成.核衣壳含单股正链RNA (核糖核酸)，大小约为1.1万对碱基，含有I个开放阅读框，编码3种结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白。
[0006]prM蛋白是一种糖蛋白，为M蛋白的前体，在病毒成熟过程中prM糖蛋白经特异性酶酶切后形成M蛋白，它能导致病毒感染增强，并形成毒粒的表面结构.包膜蛋白E存在有诱导中和抗体和血凝抑制抗体，并且可能会引起抗体依赖的感染增强作用.非结构蛋白中NSl和NS3在病毒免疫反应中起重要作用，可诱导产生针对同型登革病毒的保护作用的抗体.[0007]疫苗 研究
[0008]登革热疫苗主要可分为传统的灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、嵌合疫苗以及以质粒、腺病毒、慢病毒为载体的基因疫苗等.理想的登革疫苗应该是四价疫苗，对四种血清型登革病毒感染均有保护作用.长期以来，困扰登革疫苗发展的一个主要因素就是缺乏合适的动物模型.虽然登革病毒能够感染小鼠、猴子等动物，但这些动物感染后不出现或仅出现轻微发热等症状，而不出现登革出血热和登革休克综合征等典型症状.登革疫苗开发面临的另一个主要的问题是抗体依赖的感染增强作用.通常初次感染后，可对同型登革病毒的再次感染产生终生免疫，但对异型登革病毒的感染不但没有保护作用，往往会通过抗体依赖的感染增强作用机制促进病毒的感染.登革疫苗的研究已有50多年的历史，但至今仍无安全有效的疫苗用于临床.虽然传统的灭活疫苗、减活疫苗已取得一定的进展，但其安全性、有效性及稳定性等问题仍有待进一步的研究.以RNA干扰为基础的基因疫苗作为一种新型疫苗，具有传统灭活/减毒活疫苗无法比拟的优势，分子生物学技术的发展，为登革基因疫苗的研制提供了广阔的舞台.随着动物模型和多价疫苗定量系统的成熟和完善，以及登革热致病机制研究的不断深入，势必会加快登革疫苗的研究进程.[0009](2) RNA 干扰
[0010]RNA干扰(RNA interference, RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制.将与靶基因的转录产物信使RNA(mRNA)存在同源互补序列的双链RNA (double strandRNA, dsRNA)导人细胞后，能特异性地降解该mRNA(信使RNA)，从而产生相应的功能表型缺失.这一过程属于转录后基因沉默机制范畴.RNA干扰广泛存在于生物界.从低等原核生物到植物、真菌、无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制更为复杂.[0011]RNA干扰作用机制
[0012]现已初步总结出RNA干扰的作用机制:细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，形成22bp 大小的小干扰 RNA(small interfering RNA, siRNA), siRNA(小干扰 RNA)可进一步惨入多部分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNA(小干扰RNA)序列互补的mRNA(信使RNA)，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.除此机制外，在果蝇及线虫的研究中发现，RNA干扰还可以通过影响染色质结构来调控基因的表达.因此从目前的研究结果来看，RNA干扰现象并不仅仅发生在转录后水平，而是在多水平影响着基因的表达.RNA干扰的基本过程分为三个步骤(文献:Nature, 2004，431:343-349 ；Genes Dev, 2005，19:517-529):
[0013]siRNA(小干扰RNA)的形成:包括由外源导入或由转基因、转座子、病毒感染等各种方式导入dsRNA (双链RNA)，dsRNA (双链RNA)在细胞内被Dicer酶切割成21~23碱基长的小分子双链干扰RNA片断:siRNA(小干扰RNA)，其结构特点为在3’末端有两个碱基凸出和5’末端为磷酸的双链RNA.[0014]RNA诱导的沉默复合物的形成:经Dicer加工过的siRNA (小干扰RNA)是解旋的，在ATP(三磷酸腺苷)存在的情况下，双链siRNA(小干扰RNA)打开.其中一条链被整合到RNP(核糖核蛋白)的复合体中.形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-1nduce silencingcomplex, RISC).这个复合物由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种成分组成.[0015]目的mRNA(信使RNA)的降解:活化的RISC(RNA诱导的沉默复合物)定位到与siRNA(小干扰RNA)中的反义链互补的靶mRNA(信使RNA)转录本上，并在距离siRNA(小干扰RNA) 3 ’端12个碱基的位置切割目的mRNA (信使RNA).被激活的RISC (RNA诱导的沉默复合物)以其中的一条单链siRNA (小干扰RNA)作为向导链，结合与之互补的目标mRNA (信使RNA).然后内切核酸酶在siRNA (小干扰RNA)附近开始切割mRNA (信使RNA)，切割位点多为尿嘧啶，切割下来 的RNA被核酸外切酶完全降解.[0016]RNA干扰的应用领域
[0017]RNA干扰在真核生物中具有序列特异性的基因沉默功能，现普遍认为RNA干扰是真核生物原有的抵御病毒和外源转座子入侵的有效机制.自从RNA干扰发现以来，它已经发展成为一种重要的基因敲除工具，并广泛应用于反向遗传学的基因功能研究之中.另外,在哺乳动物细胞中外源注入siRNA (小干扰RNA)能够诱导RNA干扰的发生，这一发现使RNA干扰成为抵御病毒入侵的潜在治疗手段.其中包括一些重要的人类病原体，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革病毒(DENV)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、流感病毒(influenza virus)等(文献:BiomedSci, 2003，10(6):607-16 ；Handb Exp Pharmacol, 2006，173:117-50.).自从 1998 年首次报导以来，RNA干扰研究迅猛发展，在美国《科学》杂志评出的2002年十大科技进展的排行榜中名列榜首，同时《自然》杂志亦将其评为2002年度重大科技成就之一.并且认为RNA干扰研究的突破性进展是生物学领域近20年来可与人类基因组计划相提并论的最重大成果之一.[0018]利用RNA干扰抑制登革病毒复制的研究在国外尚处于起步阶段，在国内则未见文献报道.国外Adelman等(J Virol.2002 ；76:12925)利用与II型登革病毒PrM基因同源的290bp的dsRNA(双链RNA)转入C6/36蚊细胞，发现可以抑制登革病毒的复制；而将与登革病毒C、PrM及NS5基因同源的240~290bp长度的dsRNA (双链RNA)注入成蚊，可以保护成蚊免受登革病毒感染.Travanty等将连接有登革病毒RNA片段的重组病毒感染蚊子后，能够减少同型病毒的复制和传播(Insect Biochem Mol Biol, 2004, 34(7):607-13)。随后，他们应用埃及伊蚊中肠某蛋白启动子构建的载体，使埃及伊蚊完全失去了作为II型登革病毒载体的能力，成功构建了抗病毒的转基因埃及伊蚊(PANS，2006, 103:4198-4203)。但是，目前该技术存在以下缺陷:
[0019](a)真正发挥RNA干扰作用的不是dsRNA (双链RNA)，而是dsRNA (双链RNA)的裂解产物:21~25nt长度的siRNA (小干扰RNA)混合物，该技术利用dsRNA (双链RNA)作为药物，但真正发挥作用的siRNA (小干扰RNA)序列未知；
[0020](b)长度超过30个碱基对的双链RNA导入哺乳动物细胞会诱导干扰素的合成，表现出广泛的非特异性阻抑效应，导致细胞凋亡，该技术利用dsRNA(双链RNA)作为药物，无法在实验研究和临床中应用于哺乳动物；
[0021](c)利用登革病毒作为载体合成难度大，成本高，病毒本身具有毒副作用，难以进一步推广；
[0022](d)该技术针对的是II型登革病毒，对I型登革病毒的作用未知，但中国国内自1995年以来造成流行的为I型登革病毒，因此该技术对国内的登革热防治工作影响有限.[0023](3)慢病毒载体
[0024]南佛罗里达大学的Zhang等人利用腺病毒载体转染siRNA(小干扰RNA)的方法也达到了启动RNA干扰途经的效果(Genet Vaccines and Ther, 2004, 2 (I): 8)。在这项研究中，从非洲绿猴肾细胞和人树突状细胞(DCs)中观察到，通过辅助性腺病毒(adeno-associated virus, AAV)编码siRNA(小干扰RNA)的方法有效减少了登革病毒感染。其实，在体外研究中，最为理想的病毒载体是慢病毒载体.一方面，相对于逆转录病毒和腺病毒，慢病毒不仅能够感染分裂期细胞，而且能够感染非分裂期细胞.另一方面，慢病毒能够将基因整合到宿主细胞的基因组之中，使携带的siRNA基因稳定表达，长期抑制同源基因mRNA (信使RNA)的翻译过程.虽然，病毒载体能够高效的将外源基因整合到宿主基因组之中，但是由于病毒载体本身所具有的毒副作用，严重限制了它们的临床应用.目前，利用慢病毒做为短发夹结构RNA(short hairpin RNA, shRNA)载体的体内研究正在进行之中.解决问题的方法之一就是改造病毒载体，减少病毒的毒副作用.另一种方法就是寻找一种非病毒的载体转运siRNA (小干扰RNA)，这也成为了现在研究的热点.[0025]综上，本发明中拟构建慢病毒载体,利用宿主细胞本身的RNA干扰系统表达出成熟的siRNA(小干扰RNA)，在避免干扰素反应的同时，能够高效特异性的抑制I型登革病毒的复制，在预防与治疗I型登革病毒方面发挥重要作用。
【发明内容】
[0026]本发明的目的在于，基于I型登革病毒prM基因保守区序列，设计合成可表达shRNA (短发夹结构RNA)的慢病毒，shRNA (短发夹结构RNA)在宿主细胞中经Dicer酶等加工转变成针对PrM基因的siRNA (小干扰RNA)，干扰prM蛋白的表达，以达到抑制登革病毒复制、保护宿主不被登革病毒感染的功能。
[0027]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0028]一种shRNA (短发夹结构RNA)序列，其结构如下所示:
[0029]
【权利要求】
1.一种ShRNA序列，其结构如下所示:
2.—种siRNA序列，由权利要求1所述的shRNA序列在酶的作用下，去掉尾部和环状序列形成。
3.—种慢病毒,含有权利要求1所述的shRNA序列，且所述shRNA序列能在宿主细胞中通过酶的作用去掉尾部和环状序列转变成针对I型登革病毒PrM基因的siRNA。
4.如权利要求2所述的siRNA序列，其中所述酶为Dicer酶。
【文档编号】C12N15/113GK103993014SQ201410201475
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】吴新伟, 李磊, 蒋力云, 伍业健, 杨智聪 申请人:广州市疾病预防控制中心