链球菌性乳房炎致病菌可视化lamp检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒，发明人采用环介导等温扩增技术，并根据链球菌属乳房炎致病菌共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物，由此获得了本发明。应用本发明的LAMP检测试剂盒建立的链球菌性乳房炎致病菌检测方法，无需昂贵的PCR仪、只需普通水浴锅，操作方法简单且成本低，却比PCR检测有更高的灵敏度；检测结果可视化，肉眼判定即可，不必通过凝胶电泳紫外线分析显像观察结果。本发明解决了现有检测技术所需时间长、工作量大、易交叉污染、操作复杂等不足，具有比常规检测方法更特异、敏感的特点，适合在基层兽医站和奶牛养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。
【专利说明】链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于链球菌性乳房炎致病菌检测领域，尤其涉及一种链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]乳房炎是奶牛场中最普遍也是造成经济损失最严重的疾病之一，制约奶牛养殖业、乳品加工业的健康发展，危害公共卫生安全及人类健康，如何有效预防和控制该病已成为国内外关注的焦点。金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌，这三种病原菌所引起的发病率占奶牛乳房炎总发病率的90%以上。奶牛乳房炎的常见链球菌属致病菌(Streptococcus)主要包括无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(streptococcusdysgalactiae)和乳房链球菌(Streptococcus uberis)等,其中无乳链球菌具有高度传染性，其余链球菌多为环境致病菌，均可引起不同类型、程度的乳房炎，造成的经济损失难以估量。致病菌诊断检测是乳房炎治疗和控制方案的基础，及时、准确地鉴别致病菌对治疗有直接影响。如链球菌性乳房炎致病菌主要对青霉素、氨苄青霉素和红霉素敏感，国外报道使用羟氨苄青霉素治疗效果最好。因此，迫切需要建立一种快速敏感的链球菌性乳房炎致病菌检测方法，以实现早期诊断，从而有助于及时采取合理有效的治疗方案，为控制链球菌性乳房炎争取宝贵的时间，提高乳房炎的治愈率，避免因诊断耗时而造成的进一步经济损失。
[0003]然而在临床实践中，链球菌属致病菌培养要求条件高、分离鉴定难度大，耗时长，传统病原微生物检查结果易出现误判。以分子生物学PCR为基础的多项检测技术如普通PCR、实时定量PCR、多重PCR，及以抗原检测为主的免疫学检测法，方法快捷、灵敏，准确度较高。但是，这些现代检测方法均需要复杂的仪器设备和技术要求，成本高，不适合基层和现场检测，难以推广普及。
[0004]近年来，环介导恒温扩增(loopmediated isothermal amplification, LAMP)方法在微生物检测中的作用日益受到关注。该方法是由日本学者Notomi等在2000年建立的一种新型核酸扩增技术，因具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、无需昂贵仪器等优势，已在诸多领域广泛应用。目前建立的多数LAMP反应方法多采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像、或反应完成后再加入荧光染料来判定结果，只能分析LAMP反应的最终结果，且存在气溶胶污染实验室的危险，由于缺乏对反应的实时监控，很难排除这些干扰因素，因此不能对检测结果做出准确的判定。
[0005]目前，国内外均未见有建立链球菌性乳房炎致病菌LAMP可视化检测方法的相关报道。本发明建立的LAMP方法不仅敏感度高，特异性强，而且反应完成后无需开盖，直接肉眼观察反应结果即可。避免气溶胶污染，快速得出检测结果，操作简便，只需按建立的体系加样即可，为简便、快捷、准确地检测链球菌属菌带来便利。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测链球菌性乳房炎致病菌的需要。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒，包括反应液A，反应液A含有IOXBst buffer (等温反应缓存液)、8U/μ IBst DNA聚合酶、IOmM dNTPsUOOniM MgS04、40 μ M的内引物1、40 μ M的内引物2、5 μ M的外弓丨物 1、5μΜ的外引物2、5Μ甜菜碱Betaine、625yM钙黄绿素、12.5mM MnCl2 ；10XBst buffer含有 pH8.8200mM Tris-HClUOOmM KCl、IOOmM(NH4) 2S04、20mM MgS04U%Triton X-100 ；
[0008]内引物I 序列为 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA，
[0009]内引物2 序列为 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG，
[0010]外引物I 序列为 CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA，
[0011]外引物2 序列为 ACCATTTCTGTTCCTGCTG。
[0012]反应液A 每管 23 μ 1，其组成为:2.5 μ IlOXBst buffer、L O μ 18U/μ I Bst DNA聚合酶，3.0 μ IlOmM dNTPs、2y IlOOmM MgS04、0.75 μ 140 μ M 的内引物 1、0.75 μ 140 μ M 的内引物2、1μ 15μΜ的外引物1、1μ 15μΜ的外引物2、4μ 15Μ甜菜碱Betaine、ly 1625μΜ钙黄绿素、I μ 112.5mM MnCl2和5 μ I超纯水。
[0013]链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒的引物组，包括内引物1、内引物
2、外引物I和外引物2 ;
[0014]内引物I 序列为 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA，
[0015]内引物2 序 列为 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG，
[0016]外引物I 序列为 CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA,
[0017]外引物2 序列为 ACCATTTCTGTTCCTGCTG。
[0018]本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据链球菌属乳房炎致病菌共有的基因保守区(序列表SEQ.1D.N0.1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物，由此发明了用于快速检测链球菌性乳房炎致病菌的可视化LAMP检测试剂盒。应用本发明的LAMP检测试剂盒建立的链球菌性乳房炎致病菌检测方法，仅需通过对样本肉汤增菌后水煮法提取DNA，并进行环介导等温扩增，即可检测出链球菌性乳房炎致病菌。该法无需昂贵的PCR仪、只需普通水浴锅，操作方法简单且成本低，却比PCR检测有更高的灵敏度；检测结果可视化，肉眼判定即可，不必通过凝胶电泳紫外线分析显像观察结果。
[0019]另外,常规的LAMP方法,需在反应结束后进行开盖操作,加入SYBR Green I等突光染料来显色，容易出现假阳性结果，原因有二 =LAMP扩增产物极易形成气溶胶污染实验环境，从而造成假阳性；SYBR Green I等染料同样会与引物二聚体结合显色，造成结果误判。而本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰来替代外加的SYBR Green I等染料，即在配制LAMP反应液时就加入钙黄绿素和氯化锰，无需在LAMP反应完成后再开盖加入；并且，钙黄绿素+氯化锰仅仅在发生LAMP扩增反应时才会出现绿色，故避免了 SYBR Green I等染料所带来的假阳性干扰，具有更好的特异性，实验操作简便。
[0020]本发明解决了现有检测技术所需时间长、工作量大、易交叉污染、操作复杂等不足，具有比常规检测方法更特异、敏感的特点，适合在基层兽医站和奶牛养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是应用本发明链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图，图中:I无乳链球菌，2停乳链球菌，3乳房链球菌，4金黄色葡萄球菌，5大肠埃希氏菌，6蜡样芽胞杆菌，7枯草芽孢杆菌，8沙门氏菌，9白色念珠菌，N阴性对照(水)。
[0022]图2是应用本发明链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验(以无乳链球菌DNA为模板)的结果图，图中:1-10分别为不同浓度的无乳链球菌 DNA,依次为 526ng/ μ 1、52.6ng/ μ 1、5.26ng/ μ l、526pg/ μ 1、52.6pg/ μ 1、5.26pg/ μ 1、526fg/y 1,52.6fg/y 1,5.26fg/y I 和 0.526fg/μ 1，N 为阴性对照(水)。
[0023]图3是PCR方法检测链球菌性乳房炎致病菌敏感性试验(以无乳链球菌DNA为模板)结果图，图中:M为IOObp DNA Marker, 2-10别为不同浓度的无乳链球菌DNA，依次为 52.6ng/μ 1、5.26ng/μ l、526pg/μ 1、52.6pg/μ 1、5.26pg/μ l、526fg/μ 1、52.6fg/μ 1、
5.26fg/ μ I 和 0.526fg/ μ I, N 为阴性对照(水)。
【具体实施方式】
[0024]下述实施例中所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]Bst DNA聚合酶(大片段)购自New England Biolabs公司；PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司。
[0026]一、链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒的配制
[0027]反应液A 每管 23 μ 1，其组成为:2.5 μ IlOXBst bufferU.0μ I Bst DNA 聚合酶(8U/y 1),3.0μ IlOmM dNTPs、2y IlOOmM MgS04、0.75 μ 140 μ M 的内引物 1、0.75 μ 140 μ M的内引物2、I μ 15 μ M的外引物1、I μ 15 μ M的外引物2、4μ 15Μ甜菜碱Betaine、I μ 1625 μ M 钙黄绿素、I μ 112.5mM MnCl2 和 5μ I 超纯水。
[0028]其中，IOXBstbuffer 含有 200mM Tris_HCl(pH8.8)、IOOmM KClUOOmM (NH4)2SO4,20mM MgS04、l%Triton X-100 ；
[0029]内引物I 序列为 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA (序列表 SEQ.1D.N0.2),
[0030]内引物2 序列为 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG (序列表SEQ.1D.N0.3),
[0031]外引物I 序列为 CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA (序列表 SEQ.1D.N0.4),
[0032]外引物2 序列为 ACCATTTCTGTTCCTGCTG (序列表 SEQ.1D.N0.5)。
[0033]二、应用本发明LAMP检测试剂盒检测链球菌性乳房炎致病菌的方法(简称LAMP检测法)
[0034]1.核酸的提取
[0035]A.取0.1ml奶样加入2ml肉汤培养基中，37°C摇床恒温培养5_8h ；
[0036]B.取Iml增菌液，10000转离心lOmin，弃上清，将残余液滴吸取干净；
[0037]C.加入 ΙΟΟμΙ TE 溶液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，ρΗ8.0)重悬菌块，沸水浴20min, 10000r/min离心IOmin,取上清液即可，_20°C保存以备用。
[0038]2.链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP反应[0039]以水煮法提取的链球菌DNA为模板，在装有23 μ I反应液A的管中加入2 μ I DNA模板，构成25 μ I反应体系；LAMP反应程序如下:63°C反应60min，80°C作用5min灭活。直接用肉眼观察反应管颜色变化，若颜色变为绿色(翠绿色)，则说明样品中含有链球菌性乳房炎致病菌；如果颜色不变，仍呈桔红色，说明样品中不含有链球菌性乳房炎致病菌。
[0040]三、LAMP检测法的特异性和敏感性试验
[0041]1.特异性试验
[0042]分别以无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和白色念珠菌的核酸为模板，以超纯水为阴性对照，按照前述链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP反应体系和条件进行反应。
[0043]结果见图1，对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌的检测结果为阳性(显示翠绿色)，而对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和白色念珠菌的检测结果均为阴性(显示桔红色)。
[0044]2.敏感性试验
[0045]以无乳链球菌为例，将无乳链球菌DNA按10倍倍比稀释为526ng/μ 1、52.6ng/μ 1、5.26ng/μ l、526pg/μ 1、52.6pg/μ 1、5.26pg/μ l、526fg/μ 1、52.6fg/μ 1、5.26fg/μ l 和 0.526fg/y l。
[0046]链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测方法反应体系和条件按前述进行。
[0047]链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测方法检出限与PCR方法对比，链球菌PCR反应组成如下:25μ I反应体系中，PCR Mixl2.5μ 1，上游引物 5-ATGGTAGTTAAAGTTGGTATTAACG-3 (序列表 SEQ.1D.N0.6)和下游引物5-TTATTTAGCGATTTTTGCAAAGTAC-3 (序列表 SEQ.1D.N0.7)各 2 μ I (引物浓度为 5 μ Μ)，无乳链球菌DNA模板2 μ 1，超纯水6.5 μ I。扩增程序为95°C预变性5min，94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，共进行35个循环，最后再经72°C延伸lOmin。
[0048]链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测方法通过肉眼直接观察结果，结果见图
2。将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，结果见图3。链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测方法的检测限为52.6fg/ μ 1，常规PCR的检测限为526fg/ μ I。LAMP方法敏感性比常规PCR高10倍。
【权利要求】
1.一种链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒，其特征在于包括反应液A，所述反应液 A 含有 IOXBst buffer、8U/yl Bst DNA 聚合酶、IOmM dNTPs UOOmM MgS04、40yM的内引物1、40μΜ的内引物2、5μΜ的外引物1、5μΜ的外引物2、5M甜菜碱Betaine、625yM钙黄绿素、12.5mM MnCl2 ;所述 IOXBst buffer 含有 pH8.8200mM Tris-HClUOOmM KCl,IOOmM(NH4) 2S04、20mM MgS04U%Triton X-100 ； 所述内引物 I 序列为 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA， 所述内引物 2 序列为 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG， 所述外引物I序列为CGTGGTCAAGTTCTTGCTAA， 所述外引物2序列为ACCATTTCTGTTCCTGCTG。
2.根据权利要求1所述的链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述反应液 A 每管 23 μ 1，其组成为:2.5μ IlOXBst buffer、1.0 μ 18U/μ I Bst DNA 聚合酶，3.0 μ IlOmM dNTPs、2y IlOOmM MgS04、0.75 μ 140 μ M 的内引物 1、0.75 μ 140 μ M 的内引物2、1μ 15μΜ的外引物1、1μ 15μΜ的外引物2、4μ 15Μ甜菜碱Betaine、ly 1625μΜ钙黄绿素、I μ 112.5mM MnCl2和5 μ I超纯水。
3.链球菌性乳房炎致病菌可视化LAMP检测试剂盒的引物组，其特征在于包括内引物`1、内引物2、外引物I和外引物2 ； 所述内引物 I 序列为 CCACCTTCTTCTTTAGAAAGGATGTCCAGGTTCAATCAACCCA， 所述内引物 2 序列为 CGTCATACTCCATTCTTCAACAACTAGTTCGATTGAACCTGTTACG， 所述外引物I序列为CGTGG`TCAAGTTCTTGCTAA， 所述外引物2序列为ACCATTTCTGTTCCTGCTG。
【文档编号】C12Q1/68GK103789410SQ201310673974
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】杜玉兰, 贺婷, 何宝祥 申请人:广西大学