专利名称：针对癌相关的nfkbib变体的表位的抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的抗体和抗原以及治疗和检测癌症的方法和组合物。
背景技术：
在2000年，估计全世界有2200万人患癌症并且有620万死于这类疾病。每年有超 过1000万新的病例出现并且预期在未来15年该估计值以50%的的速率增长(WHO，World Cancer Report. Bernard W. Stewart 禾口 Paul Kleihues, eds. IARCPress, Lyon, 2003)。目前 的癌症治疗措施局限于创伤性的手术、放射治疗和化学治疗，所有这些治疗导致潜在的严 重副作用、非特定的毒害和/或损伤人们的体像和/或生活质量。癌症能够耐化学治疗，这 减少了进一步的治疗的选择性和成功的可能性。一些癌症的预后比其它的症状更加严重， 一些几乎总是致命性的。另外，一些具有相对高治愈成功率的癌症仍然是主要的杀手，因为 它们的发病率高。目前癌症治疗缺陷的一个原因是它们缺乏对患病组织和细胞的选择性。手术切除 总是涉及作为“安全边缘”(safety margin)的明显正常的组织的去除，这会增加发病率和 并发症的危险。也总是除去散布有肿瘤细胞并可能潜在维持或恢复患病器官或功能的一些 健康组织。放射治疗和化学治疗会由于其非特异性的作用方式而杀死或伤害许多正常细 胞。这会产生严重的副作用如严重恶心、体重减少和体力较小、头发减少等，以及增加在生 命晚期发展继发癌症(secondary cancer)的危险。对癌细胞具有更大选择性的疗法会使 正常细胞不受伤害由此改善治疗结果、副作用概况和生命质量。癌症治疗的选择性可以通过对癌细胞特异但是没有发现对正常细胞特异的靶向 分子改善。这些分子接着被用作基于抗体的诊断剂或治疗剂的靶或用作能够改变它们功能 的药物。IkB蛋白是一族结构相关的胞内蛋白，其结合NF-kB并通过位点和酶特异性的磷 酸化、反馈基因调节和细胞质与核区室(nuclear compartments)之间的转运来调节其活 性。该家族的几个成员已经被鉴定，其包括IkBa、β、ε、γ和BCL-3 (见Hayden & Ghosh， Genes Dev 18 :2195_2224，2004，NF_kB途径的综述)。IkB蛋白之间的序列差异导致功能 的重大不同。IkB β 最初被鉴定为 TRIP-9，也称为 NF_k_B 抑制剂 β、NF-k-BIB、I-k-B- β、 IkB^、IkB-β、IkB-B、甲状腺受体相互作用蛋白9和TR相互作用蛋白9。已经报道了两 个主要的剪接变体，即IkB β 1和IkB β 2。这些同种型它们的C端不同，导致对它们的降解 产生了显著的影响以及对NF-kB产生了影响。结果，β 2同种型似乎局限于细胞质中并且 比 β 1 同种型降解的慢(Hirano 等人，MolCell Biol 18(5) =2596-2607,1998) 据报道在 来自ΗΤ-29人结肠癌细胞系的胞质提取物中β 2同种型是主要的IkBii形式(Inan等人， Mol Carcinogenesis 29 :25_36，2000)。已经提出用人IkB β 1蛋白治疗炎症和自身免疫疾 病(US 5，952，483)并且，与人IkB β 1类似的兔IkB β蛋白用于治序与NF_kB诱导的基因 活化相关的失调的治疗(US 5，597，898)。
NF-kB-IkB β复合物通常保留在静息细胞的细胞质中，由此阻止了 NF_kB的转录 活性。在IkB β的位点特异性和信号诱导的磷酸化后，所述复合体解离并且标记IkB β以观 察其通过泛素-蛋白酶体途径的分解。游离的NF-kB转运到核中，在核中其结合到DNA并调 节各种基因的表达(Malek等人，JBC276 (48) =45225-235, 2001) 在细胞质中，IkB^维持 NF-kB的能力似乎部分与C端PEST结构域的磷酸化和另外的分子与所述复合体的结合相 关(Chen，Wu 和 Ghosh，JBC 278(25) :23101_106，2003 ;Chu 等人，Mol Cell Biol 16(11) 5974-84，1996)，因此在β 1与β 2同种型之间存在差异。新合成的或处于磷酸化的IkB β 可能转移到核中并保留结合NF-kB的能力，但是不能阻止或中断其基因转录活性(Tran等 人，Mol Cell Biol 17(9) :5386_99，1998)。相反，当与 IkB α 结合时，NF_kB 不是绝对地 保留在细胞质中，而是通过复合体进出机制在核和细胞质之间来回运动，平衡时有利于其 定位在静息细胞的细胞质中。IkBa与IkBii在控制NF-kB的定位和活性的能力上的差异 被认为部分是因为IkBii分子上存在插入蛋白而α形式上没有(Chen，Wu和Ghosh，JBC 278(25) 23101-106,2003)。IkB蛋白的作用和具体调控远远未被完全理解，但是被普遍认 可的是，这些蛋白是细胞质蛋白，其中的一些能够在核与胞质之间转移，并且所有的蛋白在 对细胞生长、凋亡、炎症反应和可能的癌症的调节中具有重要的作用。已经报道了在癌细胞中IkB α基因的突变(Cabannes等人，Oncogene 18 3063-70，1999)，但是到目前为止，没有报道IkB β同种型突变。IkBa和IkB β的欠表达和 过表达也已经牵涉癌细胞中NF-kB途径的去调节(JBC274(26) 18827-835，1999).
发明内容
本发明人已经鉴定了新的抗体和抗原。具体地说，本发明人已经鉴定了新的癌特 异的抗体，其结合几种类型的癌细胞，包括但不限于结肠癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、皮 肤癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌和肺癌细胞。重要的是，抗体不显著结合到正常的组织上， 使得其为癌症治疗和诊断的合适候选物。本发明人也已经鉴定了新抗体特异性合的抗原。另外，本发明人鉴定了新的癌症相关的抗原。具体地说，本发明人已经鉴定了在癌 细胞表面表达的IkBii变体。在具体的实施方案中，新癌症相关的抗原是在癌细胞表面上 表达的IkB β同种型2 (IkB β 2)变体。本发明人已经克隆并测序了所述抗体并确定了抗体轻链和重链可变区和互补决 定区1、2和3的序列。因此，本发明公开了包含氨基酸序列SGDKLGDKYAC(SEQ ID NO 8)的分离的轻链互 补决定区I(CDRl)；包含氨基酸序列QDSKRPS (SEQ ID NO :9)的轻链互补决定区2 (CDR2)；和 包含氨基酸序列QAWDSSTVV(SEQ ID NO 10)的分离的轻链互补决定区3 (⑶R3)；包含氨基 酸序列SYAMH (SEQ ID NO 5)的分离的重链CDRl ；包含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO 6)的分离的重链CDR2 ；和包含氨基酸序列AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ IDNO 7)的分 离的重链⑶R3。本发明也提供了编码包含氨基酸序列S⑶KLGDKYAC(SEQ ID NO 8)的轻链⑶Rl的 分离的核酸序列；编码包含氨基酸序列QDSKRPS (SEQ ID NO 9)的轻链CDR2的分离的核酸 序列；和编码包含氨基酸序列QAWDS STVV(SEQID NO 10)的轻链⑶R3的分离的核酸序列； 编码包含氨基酸序列SYAMH(SEQID NO 5)的重链CDRl的分离的核酸序列；编码包含氨基酸
6序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO 6)的重链⑶R2的核酸序列；和编码包含氨基酸序列 AHSRLLffFGELLPSAFDY (SEQ ID NO 7)的重链 CDR3 的分离的核酸序列。本发明公开的另外的方面是包含本发明的轻链⑶R1、⑶R2和/或⑶R3(SEQ ID NOS 8-10)的分离的轻链可变区与包含本发明的重链CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ ID NOS 5-7)的分离的重链可变区。在一个实施方案中，轻链可变区包含图IB中所示的氨基酸序 列(SEQ ID NO :4)。在另一个实施方案中，重链可变区包含图IA中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。本发明也包括编码本文公开的轻链可变区的分离的核酸序列和编码本文公开的 重链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方案中，编码轻链可变区的核酸序列包括图IB 中所示的核酸序列(SEQ ID NO :3)。在另一个实施方案中，编码重链可变区的核酸序列包 括图IA中所示的核酸序列(SEQ ID NO :1)。本发明的另一个方面是结合蛋白，优选地抗体或抗体片段，其包含本发明公开的 至少一个轻链互补决定区(即，SEQ ID NOS 8-10中的一个或以上)和/或本发明的至少 一个重链互补决定区(即SEQ ID N0S:5-7中的一个或以上)。本发明也提供了结合蛋白， 优选地抗体和抗体片段，其包含本文公开的轻链可变区和/或本文公开的重链可变区。如上所述，本发明也鉴定了本发明的结合蛋白结合的抗原。因此，本发明提供了 结合到IkBP蛋白的结合蛋白，所述IkB β包括IkB β同种型1 (IkB β 1)、IkB β同种型 2 (IkB β 2)和癌相关的IkBii变体。在一个实施方案中，癌相关的变体是IkBii 2变体。另外，本发明提供了包含本发明的结合蛋白如抗体和抗体片段和药学上可接受的 赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂的组合物。另外，本发明提供了编码本发明的结合蛋白的分离的核酸序列。本发明的另外方面是免疫偶联物，其包含(1)本发明的结合蛋白，优选地结合癌 细胞上抗原或分子的抗体或抗体片段，所述结合蛋白附着到(2)效应分子上。本发明的另 外方面是免疫偶联物，其包含(1)本发明的结合蛋白，优选地结合被癌细胞内化的抗原或 分子的抗体或抗体片段，所述结合蛋白附着到(2)效应分子上。在一个优选的实施方案中， 所述效应分子是(i)可直接或间接产生可检测信号的标记，或(ii)癌症治疗剂，其或者是 细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式妨碍或降低癌细胞分裂和/或转移的能力。 优选地，癌症治疗剂是毒素或细胞毒素。在一个实施方案中，免疫偶联物包含SEQ ID NO 67所定义的氨基酸序列。本申请还提供编码本文的免疫偶联物的分离的核酸序列。在一个实施方案中，分 离的核酸序列编码包含SEQ ID NO :67所定义的氨基酸序列的蛋白。在另一实施方案中，分 离的核酸序列包含SEQ ID NO :66ο本申请还提供包含本申请的免疫偶联物的组合物和免疫偶联物在制造用于治疗 或预防癌症的药物中的用途和用于诊断目的用途。此外，本申请提供使用本申请的免疫偶 联物治疗或预防癌症的方法和相关的试剂盒。本申请的进一步方面是检测或监测受试者中癌症的方法，包括步骤(1)将从所述受试者取得的测试样品与本申请的且特异性结合癌细胞上抗原的结 合蛋白或免疫偶联物接触，以产生结合蛋白_抗原复合物；(2)测量测试样品中结合蛋白_抗原复合物的量；和
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(3)比较测试样品中与对照中结合蛋白_抗原复合物的量。本申请的另一方面是包含本申请的免疫偶联物的诊断试剂，其中效应分子是可以 直接或间接产生可检测信号的标记。本申请还包括可以特异性结合本申请的结合蛋白之一的分离的蛋白质，及其核酸 序列和用途。如上所述，发明人已经鉴定了本申请的结合蛋白结合的抗原。因此，本发明包含包 括癌相关的IkBii变体的分离的蛋白。本发明也包括编码癌相关的IkBii变体的分离的核 酸序列。本发明也包含结合癌相关的IkBii变体的结合蛋白。
本发明也包含本发明的抗原在治疗和诊断癌中的用途。因此，本发明包括检测或监控受试者中癌症的方法，其包括检测样品的细胞中的 本发明的抗原，其中如果在细胞上检测到所述抗原，则表明患有癌症。本发明也包括检测或 监测受试者癌症的方法，所述方法包含检测样品中细胞的本发明的癌症相关的IkBii变体 的RNA表达，其中如果检测到癌相关的IkB β变体的RNA表达，那么表明患有癌症。本发明也包括药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的抗原、编码本 发明的抗原的分离的核酸序列或包含编码本发明的抗原的核酸序列的重组表达载体以及 药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂。本申请的进一步方面是本申请所公开抗原、编码本申请的抗原的分离的核酸序列 或者包含编码本申请所公开抗原的核酸序列的重组表达载体在引起受试者中免疫反应中 的用途。本申请的进一步的方面是本申请的抗原、编码本申请的抗原的分离的核酸序列或 者包含编码本申请抗原的核酸序列的重细表达载体在治疗或预防癌症中的用途。此外，本申请包括用于治疗或预防受试者中癌症的方法，包括向受试者或者来自 受试者的细胞施用有效量的本申请的抗原、编码本申请的抗原的分离的核酸序列或者包含 编码本申请的抗原的核酸序列的重组表达载体。本申请还包括用于诱导受试者对本申请的抗原产生免疫反应的方法，包括向受试 者或者来自受试者的细胞施用有效量的本申请的抗原、编码本申请的抗原的分离的核酸序 列或者包含编码本申请的抗原的核酸序列的重组表达载体。根据下面的详细描述，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理 解，本发明的详细描述和具体实施例尽管指出本发明的优选实施方案，但仅以例证的方式 给出，因为根据该详细描述，在本发明精神和范围内的许多改变和修改对本领域技术人员 而言将变得显而易见。
本发明现将参照附图加以描述，其中图 1 显示 VB1-204 的(A) μ、VH3 (分别为 SEQ ID NOS :1 禾口 2)禾口 (B) λ、VL3 (分 别为SEQ ID NOS 3和4)的链的核苷酸和氨基酸序列。 图2显示VB1-204的肿瘤谱。将黑素瘤(Α-375)、肺(Α-549)、胰腺(CFPac-I 和 Panc-I)、肝 0fep-G2)、乳腺(MB-231、MB-435S 和 SK-BR-3)、前列腺(DU-145)和卵巢(SK-0V-3)的肿瘤细胞系与100 μ g/mL的VB 1-204温育，并通过流式细胞术用偶联到FITC 的羊抗人H&L抗体检测结合的材料。显示了两个独立实验的相对于对照抗体的中位荧光 (MF)的平均值。图3显示通过共焦显微镜评价VB1-204的内化A-375细胞与VBl-204(100y g/mL) 于4°C孵育，洗涤并加温至37°C维持60分钟。细胞被固定、透化并用抗人的IgM生物素化 的抗体标记，接着与偶联有FITC的链霉亲和素温育。A)，与VB1-204于4°C孵育60分钟之 后的A-375细胞的荧光标记，显示标记的周缘表面分布，通过白色箭头指示，(60X χ 3)放 大率。B)，在抗体结合的细胞于37°C孵育60分钟之后，细胞显示细胞内被内化抗体染色， (60X χ 3)放大率。图4A显示VB1-204饱和曲线，其通过经流式细胞术测量增加浓度的VB1-204对 A-375癌细胞的反应性来确定；B =Lineweaver-Burk法，结合常数通过Lineweaver-Burk法确定。图5显示用VB1-204免疫沉淀和探针检测的从膜组分纯化的蛋白的Western印迹 分析。图6显示对在用VB1-204免疫共沉淀后的来自阳性细胞系CFPAC-I的膜提取物以 及阴性细胞系PANC-I的MS分析对比。图7显示来自肿瘤细胞系A =CFPAC-U B :A_375和C :MB_231的MS分析的肽的鉴 定。从每个细胞类型回收的定位到IkBii 2的肽用下划线和黑体表示。图8显示了经从头测序收集并且其定位对应于IkBii 2的肽。收集的序列为黑体。 收集的肽的变异氨基酸用下划线表示。图9A显示使用8个最强峰的中性肽Mr(calc)的单一同位素质量1986. 9720， 固定的修饰脲甲基(C)离子得分47期望值le+002匹配(粗体红色)3/176碎片离 子。图9B显示使用25个最强峰的中性肽Mr(calc)的单一同位素质量1070. 5542，固定 的修饰脲甲基(C)可变修饰M1 氧化(M)离子得分52期望值7. 7e+002匹配(粗体红 色)10/80碎片离子。图9C显示使用6个最强峰的中性肽MHcalc)的单一同位素质量 1203. 5811，离子得分98期望值7. 2e-06匹配(粗体红色)4/68碎片离子。图10是VB1-204免疫沉淀的蛋白的Western印迹，所述蛋白来自整个细胞的裂解 物或来自纯化的CFPAC-I膜组分。将所述印迹用VB 1-204或商业获得的抗IkB β抗体探 针检测。图11显示VB6-204核苷酸序列(SEQ ID NO 66)和氨基酸序列(SEQ IDNO 67)。图12显示了 CFPAC-I细胞中VB6-204的细胞毒性。图13显示C33A细胞的流式细胞术结果，结果显示了存在抑制剂DEAB (图13Α和 图13C)或不存在抑制剂DEAB(图13B和图13D)时aldefluor的反应性分布以及VB1-204 特异性地结合到这些细胞上(图13C和图13D)。图14显示DU-145细胞的流式细胞术结果，结果显示了存在抑制剂DEAB (图A和 图C)或不存在抑制剂DEAB (图B和图D)时aldefluor的反应性分布以及VB1-204特异性 地结合到这些细胞上(图C和图D)。
具体实施例方式(A)定义术语“细胞”包括单个细胞以及多个或者一群细胞。向细胞施用试剂包括体外和 体内施用。术语“全身施用”，如本文所使用，意思是指免疫偶联物和/或其它癌症治疗剂可 以以方便的方式全身性施用，例如通过注射(皮下、静脉内、肌内等)、口服施用、吸入施用、 经皮施用或局部应用(例如局部乳膏剂或软膏剂等)、栓剂应用或植入方法。植入物可以是 多孔、非多孔或者凝胶材料，包括膜，例如sialastic膜或纤维。栓剂通常包含0. 5重量％ 至10重量％范围的活性成分。术语“氨基酸”包括所有天然存在氨基酸以及修饰氨基酸。术语“抗体”，如本文所使用，旨在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。抗体可 以是重组来源和/或在转基因动物中产生。术语“抗体片段”，如本文所使用，旨在包括但不 限于Fab、Fab'、F(ab' )2、sCFV、dSFV、dS-SCFV、二聚体微型抗体双抗体、及其多聚体，多特异 性抗体片段和域抗体。抗体可以使用常规技术片段化。例如，F(ab' )2片段可以通过以胃蛋 白酶处理抗体产生。可以处理所得到的F(ab' )2片段以还原二硫键来产生Fab'片段。木 瓜蛋白酶消化可以导致形成Fab片段。Fab、Fab'和F(ab' )2、scFV、dsFV、ds-scFV、二聚体、 微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其它片段也可以通过重组技术合成。本文所用术语“本申请的抗体或抗体片段”包含至少一个本申请的轻链互补决定 区(即SEQ ID NO 8-10中的一个或一个以上)和/或至少一个本申请的重链互补决定区 (即SEQ ID NO 5-7中的一个或一个以上)。在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含轻链 CDR序列(SEQ ID NO :8_10的全部)和/或重链CDR序列(SEQ ID NO :5_7中的全部)。在 另一实施方案中，抗体或抗体片段包含SEQID NO :4的氨基酸(轻链可变区)和/或SEQ ID N0:2的氨基酸(重链可变区)。该术语还包括结合本申请的抗原的抗体或抗体片段。本申 请的抗体或抗体片段还包括序列的功能变体，使得抗体或抗体片段可以结合癌细胞，而基 本上不结合正常细胞。本文所用术语“本申请的抗原”指本申请的结合蛋白能够结合的结合蛋白，并且包 括IkB β蛋白，IkB β蛋白包括IkB β同种型l(IkB β 1)、IkB β同种型2 (IkB β 2)和/或癌 症相关的IkBii变体和其片段或部分(例如，癌症相关的IkBii变体的胞外结构域)。本文 所用术语“IkBi3同种型1或IkB β 1”指SEQ ID Ν0:28限定的蛋白。本文所用术语“ΙΙ Ββ 同种型2或IkB β 2”指SEQ ID NO ,21限定的蛋白。本文所用术语“癌症相关的IkB β变体” 或“IkBi3变体”指在癌细胞表面表达且不显著在非癌细胞表面表达的新IkBii变体。在本 发明的一个实施方案中，癌相关的IkBii变体具有与IkBii相同的功能，IkB^作为NFk-B 的抑制性调节因子，但是它们在细胞中的位置却不同(即位于细胞膜上)。在另一个实施方 案中，癌相关的IkBii变体包括SEQ ID NO :32和/或36定义的氨基酸序列。在进一步的 实施方案中，癌相关的IkBii变体包括SEQ ID NO :30定义的氨基酸序列。在附加的实施方 案中，癌相关的IkB β变体由SEQ ID NO :30定义的氨基酸序列组成。在另外的实施方案 中，癌相关的IkB^变体包括SEQ ID NO :27的序列，其中选自26、27、31、34、39、106和111 和112位的一个或多个氨基酸用另一个氨基酸取代或化学修饰。在另一个实施方案中，取 代或化学修饰导致相对于未修饰的蛋白(即SEQ ID NO 27)而改变的区域的疏水性增加。
10在另外的实施方案中，所述取代为以下的一种或多种P026V、D027L、P031V、P034V、E039W、 E106V、E111V和/或K112A。在本发明的另一个实施方案中，癌相关的IkB β变体包括含有 通常不存在于IkB β的一个或多个跨膜结构域的IkBii。在一个实施方案中，跨膜结构域包 含氨基酸序列SEQ ID Ν0:53或54。在一个实施方案中，癌相关的IkB β变体是IkBi32的变体。“至少中等严格杂交条件”意思是指所选择的促进两个互补补核酸分子在溶液中 选择性杂交的条件。杂交可发生在核酸序列分子的全部或部分。杂交部分长度有代表性 地至少15个(例如20、25、30、40或50个)核苷酸。本领域技术人员将认识到，核酸双 链体或杂合体的稳定性由Tm决定，其在含钠缓冲液中是钠离子浓度和温度的函数(Tm = 81. 50C -16. 6 (LoglO [Na+] )+0. 41(% (G+C)-600/1)，或相似方程)。因此，在洗涤条件中的 决定杂交稳定性的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子相似、但不相同的 分子，可以假定的错配会导致Tm降低大约1°C，例如，如果寻找具有> 95%同一性的核 酸分子，则最后的洗涤温度降低大约5°C。基于这些考虑，本领域技术人员将能够容易地选 择适宜的杂交条件。在优选的实施方案中，选择严格杂交条件。通过实例的方式，可以采用 下列条件以实现严格杂交基于上述方程，在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt' s 溶液/1.0% SDS中于Tm-5°C下杂交，然后以60°C的0. 2xSSC/0. SDS洗涤。中等严格 杂交条件包括在3x SSC中于42°C洗涤的步骤。然而，应当理解，等效的严格性可以使用替 代的缓冲液，盐和温度实现。关于杂交条件的另外的指导可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,N. Y. , 2002 禾口 Sambrook 等，Molecular Cloning aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 中 戈至Ij0术语“结合蛋白”，如本文所使用，指特异性结合另一物质，如本申请的癌相关抗 原，的蛋白质。在一个实施方案中，结合蛋白是抗体或抗体片段。“适宜体内施用的生物学相容形式”意思是指待施用物质的治疗效应胜过任何毒 性效应的形式。术语“癌症”，如本文所使用，包括可以被本申请的结合蛋白、优选本申请的抗体或 抗体片段结合的任何癌症。术语“癌细胞”包括癌症或肿瘤形成细胞、转化细胞或易于变成癌症或肿瘤形成细 胞的细胞。术语“互补”指核酸序列能够根据标准Watson-Crick互补规则进行碱基配对，或 者能够在严格条件下与特定核酸片段杂交。“保守氨基酸取代”，如本文所使用，是一种其中一种氨基酸残基被另一种氨基酸 残基置换，而没有破坏蛋白质的预期特性的取代。术语“对照”，如本文所使用，指来自受试者或者一组受试者的样品，其已知患有癌 症或未患有癌症。术语“控释系统”，如所使用，意思是指本申请的免疫偶联物和/或其它癌症治 疗剂可以以受控的方式施用。例如，微泵可以向肿瘤区域直接递送受控剂量，由此精细 调节药物组合物的施用时间和浓度(见，例如Goodson，1984，Medical Applications of Controlled Release，第 2 卷，第 115-138 页)。术语“肽衍生物”指具有一个或更多个通过功能性侧基反应所化学衍生残基的肽。
11此类衍生分子包括例如，其中游离氨基已经被衍生以形成胺氢氯化物、对甲苯磺酰基、苄氧 羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以被衍生形成盐、甲酯和乙 酯或者其他类型酯或酰胼。游离羟基可以被衍生形成0-酰基或0-烷基衍生物。组氨酸的 咪唑氮可以被衍生形成N-im-苄基组氨酸。作为衍生物还包括那些包含一个或一个以上 的二十种标准氨基酸的天然存在氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟脯氨酸可以替代脯氨酸； 5_羟赖氨酸可以替代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替代组氨酸；高丝氨酸可以替代丝氨酸； 和鸟氨酸可以替代赖氨酸。短语“检测或监测癌症”指确定受试者是否具有或不具有癌症、癌症程度、癌症严 重性和/或癌症分级的方法或过程。术语“直接施用”，如本文所使用，意思是指癌症治疗剂可以施用，但不限于瘤内、 血管内和肿瘤旁施用。例如，癌症治疗剂可以通过一次或一次以上直接向肿瘤内注射、通过 连续或间断向肿瘤内灌注、通过引入肿瘤治疗剂储存器、通过向肿瘤内引入缓慢释放装置、 通过向肿瘤内引入缓慢释放制剂和/或通过向肿瘤上直接应用来施用。“向肿瘤内”施用的 模式包括向肿瘤区域或者向基本上直接流入肿瘤区域的血管或淋巴管中引入癌症治疗剂。如本文所使用，短语“有效量”意思是指在此剂量时并且在达到预期结果所必需的 时间阶段内有效的量。治疗有效量可以根据因素改变，例如动物的疾病状态、年龄、性别、体 重。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，每天可以施用数个分剂量，或者剂量可 以按比例减少，如通过治疗状态的紧急情况所指示。术语“引起免疫反应”或者“诱导免疫反应”，如本文所使用，意思是指启动、触发、 引起、增强、提高或者增进免疫系统的任何反应，例如体液免疫或者细胞介导的免疫。免疫 反应的启动或增强可以使用本领域技术人员已知的测定法评价，包括但不限于，抗体则定 法(例如ELISA测定法)、抗原特异性细胞毒性测定法和细胞因子的产生(例如ELISP0T测 定法)。优选地，本申请的分离的蛋白质、核酸序列或重组表达载体和本申请的方法触发或 增强细胞免疫反应，更加优选T细胞反应。术语“重链互补决定区”，如本文所用，指的是，抗体分子的重链可变区内的高变 区。所述重链可变区具有三个互补决定区，从氨端到羧端分别称为重链互补决定区1、重链 互补决定区2和重链互补决定区3。术语“重链可变区”，如本文所使用，指重链的可变区。本文所用的术语“本申请的免疫偶联物”包含(1)本申请的结合蛋白，优选抗体或 抗体片段，其附着至(2)效应分子。效应分子可以是人们希望递送至癌细胞的任何分子，包 括但不限于(i)可以直接或间接产生可检测信号的标记，或(ii)癌症治疗剂，例如毒素，其 或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌细胞分裂和/或转移的 能力。术语“本申请的免疫毒素”指免疫偶联物，其中效应分子是癌症治疗剂，例如毒素，其 或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌细胞分裂和/或转移的 能力。术语“分离的核酸序列”，如本文所使用，指当通过重组DNA技术产生时基本上没 有细胞物质或培养基或者当化学合成时基本上没有化学前体或其它化学品的核酸。分离的 核酸还基本上没有天然位于核酸侧翼的序列(即位于核酸5'和3端的序列)，核酸是从这 些序列获得。术语“核酸”旨在包括DNA和RNA，并且可以是双链的或者单链的，并且代表有义链或反义链。此外，术语“核酸”包括互补核酸序列。术语“分离的蛋白”指当通过重组DNA技术产生时基本上没有细胞物质或者培养 基，或者来自培养的细胞或组织样品，或者当化学合成时基本上没有化学前体或其它化学 物质的蛋白质。术语“轻链互补决定区”，如本文所使用，指抗体分子的轻链可变区内的高变区。轻 链可变区具有三个互补决定区，从氨基末端至羧基末端称作轻链互补决定区1、轻链互补补 决定区2和轻链互补决定区3。 术语“轻链可变区”，如本文所使用，指轻链的可变区。术语“修饰的bouganin”，如本文所使用，意思是指如在PCT/CA2005/000410和以 US2005-0238642A1公布的美国专利申请号11/084，080中所描述的具有降低的激活免疫反 应倾向的修饰的bouganin。在一个实例中，修饰的bouganin具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRFVLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPTVATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFSIEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFKPNFKVLNLENNWGDISDAIHKS SPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNKVSQISPDMGILKFKSSK0术语“核酸序列”，如本文所使用，指由天然存在碱基、糖和糖间(主链)键组成的 核苷或核苷酸单体的序列。术语还包括包含其非天然存在单体或其部分的修饰的或取代的 序列。本申请的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以 包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列还可以包含修 饰的碱基。此类修饰碱基的实例包括氮杂和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧 啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。术语“样品”，如本文所使用，指来自可以被测定是否有癌症的受试者的任何流体、 细胞或组织样品。术语“序列同一性”，如本文所使用，指两个多肽序列之间序列同一性的百分数。 为了确定两个多肽序列之间的同一性百分数，将这两个序列的氨基酸序列比对，优选使用 Clustal W算法(Thompson，JD，Higgins DG, Gibson TJ，1994，Nucleic Acids Res. 22(22) 4673-4680)连同 BLOSUM 62 打分矩阵(Henikoff S.和 Henikoff J. G.，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919)和空位开放罚分10以及空位扩展罚分0. 1，以便获得两 个序列之间的最高级配对，其中所述序列之一的总长度的至少50%参与比对。可以用于比 对的其它方法是由 Smith 和 Waterman 改良(Adv. Appl. Math.，1981,2 482)的 Needleman 和Wunsch(J. Mol. Biol.，1970，48 443)的比对方法，由此获得两个序列之间最高级配对 并确定两个序列之间相同氨基酸的个数。其它计算两个氨基酸序列之间同一性同一性百 分率的方法是本领域公知的，并且包括Carillo和Lipton(SIAM J. Applied Math.，1988， 48 1073)所述以及在 Computational Molecular Biology, Lesk, e. d. OxfordUniversity Press,New York, 1988,Biocomputing Informatics and GenomicsProjects所述的那些方 法。通常，用于这方面的计算机程序包括但不限于GCG(DeVereuX等人Nucleic Acids Res.,1984，12 :387) BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul 等人，J. Molec. Biol.，1990 215 403)。术语“受试者”，如本文所使用，指动物界的任何成员，优选哺乳动物，更优选人。在 优选的实施方案中，受试者被怀疑具有或者具有癌症。如本文所使用，短语“治疗或预防癌症”指抑制癌细胞复制、防止细胞向癌症形成 细胞的转化、抑制癌症扩散(转移)、抑制肿瘤生长、降低癌细胞数量或者肿瘤生长、降低癌 症的恶性等级(例如增强的分化)或者改善癌相关症状。术语“变体”，如本文所使用，包括以与本申请的蛋白或核酸分子基本上相同的方 式执行基本相同功能的、本申请的氨基酸和核酸序列的修饰物或化学等效物。例如，本申请 的蛋白变体包括但不限于保守氨基酸取代。本申请的蛋白变体还包括对本申请的蛋白的添 加和缺失。此外，变体肽和变体核苷酸序列包括其类似物和衍生物。本申请的癌相关抗原 的变体意思是指在癌细胞上但不在正常细胞上表达的蛋白质序列。(B)互补决定区和结合蛋白(i)轻链和重链互补决定区和轻链和重链可变区本申请公开提供了包含氨基酸序列S⑶KLGDKYAC (SEQ ID NO 8)的分离的 轻链互补决定区I(OTRl)；包含氨基酸序列QDSKRPS(SEQ ID NO 9)的分离的轻链互 补决定区2 (CDR2)；和包含氨基酸序列QAffDSSTVV (SEQ ID NO 10)的分离的轻链互补 决定区3(⑶R3)；包含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO 5)的分离的重链⑶Rl ；包含氨 基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO 6)的分离的重链CDR2 ；和包含氨基酸序列 AHSRLLffFGELLPSAFDY (SEQ IDNO 7)的分离的重链 CDR3。本申请还包括⑶R序列变体，其可以结合至与由上面所公开⑶R序列所识别的相 同抗原。本申请的另外方面是包含本申请的轻链CDR1、CDR2和/或CDR3(SEQ IDNO 8-10) 的分离的轻链可变区，和包含本申请的重链⑶R1、⑶R2和/或⑶R3(SEQ ID NO 5-7)的分离 的重链可变区。在一个实施方案中，轻链可变区包含图IB中所示氨基酸序列(SEQ ID NO 4)。在另一实施方案中，重链可变区包含图IA中所示氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。本申请还公开了分离的轻链可变区和重链可变区的变体，其可以结合至与由上面 所公开分离的轻链可变区和分离的重链可变区所识别的相同抗原。本领域技术人员将意识到，本申请包括SEQ ID N0:5-10、2和4的氨基酸序列的变 体，包括本申请公开的序列的化学等效物。此类等效物包括以基本相同的方式执行与本申 请的特定蛋白质基本上相同功能的蛋白质。例如，CDR序列的功能变体将能够结合至天然 CDR序列所识别的抗原。例如，等效物包含但不限于保守的氨基酸的取代。在一个实施方案中，轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3和重链⑶R1、⑶R2和⑶R3的变体氨 基酸序列与SEQ ID NO 5-10分别具有至少50%、优选至少60%、更加优选至少70%、最优 选至少80 %、甚至更加优选至少90 %、并且甚至最优选95 %的序列同一性。在另一实施方案中，轻链可变区和重链可变区的变体氨基酸序列与SEQ IDNO 2 和4分别具有至少50%、优选至少60%、更加优选至少70%、最优选至少80%、甚至更加优 选至少90 %并且甚至最优选95 %的序列同一性。本申请还公开了编码本申请的轻链可变区的分离的核酸序列和编码本申请的重 链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方案中，分离的核酸序列编码包含图IB中所示氨基酸序列(SEQ ID NO 4)的轻链可变区。在另一实施方案中，分离的核酸序列编码包含图 IA中所示氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的重链可变区。在进一步的实施方案中，编码轻链可 变区的核酸序列包含图IB中所示的核酸序列(SEQ ID NO :3)。在又一个实施方案中，编码 重链可变区的核酸序列包含图IA中所示核酸序列(SEQ ID NO :1)。本申请还包括编码本 申请的轻链可变区和重链可变区的核酸序列的变体。例如，变体包括在至少中等严格杂交 条件下与编码本申请的轻链可变区和重链可变区的核酸序列杂交的核苷酸序列。本申请还公开了编码如下序列的分离的核酸包含氨基酸序列S⑶KLGDKYAC(SEQ ID NO 8)的轻链CDRl、包含氢基酸序列QDSKRPS (SEQ ID NO 9)的轻链CDR2 ；包含氨基酸 序列QAWDSSTVV(SEQ ID NO 10)的轻链CDR3 ；包含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO 5)的重 链⑶Rl ；包含氨基酸序列VISYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO :6)的重链⑶R2 ；和包含氨基酸 序列 AHSRLLWFGELLPSAFDY(SEQ ID NO 7)的重链 CDR3。本申请还提供了编码上面所讨论的CDR序列和可变区序列的变体的分离的核酸 序列。变体核酸序列包括至少在中等严格杂交条件下与编码SEQ ID NO :5_10、2和4中 所示氨基酸序列的核酸序列及其变体杂交的核酸序列。(ii)结合蛋白本申请的另一个方面是包含至少一个本申请的轻链互补决定区(即SEQ IDNO 8-10中的一个或一个以上)和/或至少一个本申请的重链互补决定区(即SEQID NO :5_7 中的一个或一个以上)的结合蛋白，这样的结合蛋白一般在本文中被称为“本申请的结合 蛋白，，或优选地“本申请的抗体或抗片段”。在一个实施方案中，结合蛋白包含分别含有氨基酸序列S⑶KLGDKYAC(SEQ ID NO 8)、QDSKRPS (SEQ ID NO 9)和 QAWDSSTVV (SEQ ID NO :10)的轻链互补决定区 1、2 和 3 ；和分别含有氨基酸序列 SYAMH(SEQ ID NO:5) ；VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO:6)；和 AHSRLLffFGELLPSAFDY(SEQ ID NO 7)的重链互补决定区1、2和3。本申请还公开了包含图 IB中所示轻链可变区(SEQ ID NO 4)和/或图IA中所示重链可变区(SEQ ID NO 2)的结 合蛋白，优选抗体或抗体片段。本领域技术人员会意识到，本申请包括以与上面所公开结合蛋白基本上相同的 方式执行基本相同功能的上面所公开特定结合蛋白的变体，包括上面所公开序列的化学 等效物。结合蛋白的功能变体将能够结合至与上面所公开结合蛋白相同的抗原。在一个 实施方案中，结合蛋白结合到IkBii蛋白上，包括IkBii同种型1 (IkB β 1)、IkB β同种型 2 (IkB β 2)和/或癌相关的IkB β变体。发明人已经鉴定了本发明的结合蛋白结合的抗原。因此，本发明提供了结合到 IkB β蛋白包括IkB β同种型l(IkB β 1)、IkB β同种型2 (IkB β 2)和/或癌相关的IkB β 变体的结合蛋白。如上所述，本申请的结合蛋白结合到癌细胞的表面上，但不显著地结合到非癌细 胞的表面。因此，本申请包括结合到癌相关的IkBii变体的胞外结构域的结合蛋白。癌相关 的IkBii变体的结构能够被本领域技术人员使用计算机建模来预测。例如，可以使用商业 获得的软件或服务(见Martz，Erie在2000年11月30日提交的Protein Explorer，最后 IfiTT 2003 ^f-4 J3i 30 H, http://molvis.sdsc.edu/visres/molvisfV/titles.jsp)。 $
15一个实施方案中，对SEQ IDNO 30限定的蛋白进行计算机建模。在一个实施方案中，所述胞外结构域包含在或包含SEQ ID NO 27或30的氨基酸 52-97。在另一个实施方案中，胞外结构域包含在或包含序列GYVTED⑶TALHLAVIHQHEPFLF LLGFSAGTEYMDLQNDLGQTA(SEQ IDNO 68)。在另一个实施方案中，胞外结构域包含SEQ ID NO 27或30的氨基酸38_98 AELGPGLSWAPLVFGYVTED⑶TALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTAL(SEQ ID NO. 69)或AWLGPGLSWAPLVFGYVTED⑶TALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTAL(SEQIDN 0. 70)。在另一个实施方案中，本申请的结合蛋白结合到包含SEQ ID N0:27或30的氨基 酸38-102的肽AELGPGLSWAPLVFGYVTED⑶TALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTALHLAA(SEQ ID NO 71)或 AWLGPGLSWAPLVFGYVTED⑶TALHLAVIQHEPFLDFLLGFSAGTEYMDLQNDLGQTALHLAA (SEQ ID NO 72)。在某些实施方案中，抗体或抗体片段包含全部或者部分的得链恒定区，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgE、IgM或者IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgM重链 恒定区。另外抗体或抗体片段可以包含全部的或部分的κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。 优选地，轻链恒定区是λ轻链恒定区。为了产生人单克隆抗体，抗体产生细胞(淋巴细胞)可以从患有癌症的人中取 得，并且通过标准体细胞融合过程与骨髓瘤细胞融合，因此使这些细胞永生并且得到杂交 瘤细胞。此类技术是本领域众所周知的(例如最初由Kohler和Milstein(Nature 256 495-497(1975))开发的杂交瘤技术以及其他技术例如人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等， Immunol. Today 4 :72 (1983))、产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Roder等，Methods Enzymol, 121 140-67 (1986))和组合抗体文库的筛选(Huse 等，Science 246 1275 (1989)) 也是本领域众所周知的。可免疫化学筛选产生与癌细胞特异性反应的抗体的杂交瘤细胞， 并且可以分离单克隆抗体。对特定抗原或分子(例如癌细胞上的抗原或分子)具有反应性的特异性抗体 或抗体片段，也可以通过筛选与细胞表面成分一起表达于细菌中的编码免疫球蛋白基因 或其部分的表达文库产生。例如，完整的Fab片段、VH区和FV区可以使用噬菌体表达文 库在细菌中表达(见例如 Ward 等，Nature 341 :544_546 (1989) ；Huse 等，Science 246 1275-1281(1989)；和 McCafferty 等，Nature 348:552-554(1990))。本申请包括结合至与本申请的抗体或抗体片段相同的抗原的所有抗体和抗体片 段。本领域技术人员会意识到，结合测定可以用于找出与本申请的抗体和抗体片段具有相 同结合特异性的其它抗体和抗体片段。如下面所例证，竞争结合测定可以用于找出此类的 其它抗体。在使用流式细胞术开展竞争测定之前，确定对固定数量癌细胞给出最大结合的本 申请的抗体(Abl)的最低浓度。从指数生长培养物中收获总计106个细胞并且与多种抗体浓度于4°C孵育1小时。洗涤细胞并且与适宜检测抗体在4°C下再孵育1小时。在洗涤之 后，通过流式细胞术分析细胞。对于每一测试抗体，通过中位荧光对抗体浓度作图从数据产 生饱和曲线。对于竞争测定，如上制备癌细胞并且用固定浓度的抗体(Abl) —式两份处理。固 定浓度是如上所确定的对固定数量的癌细胞产生最大结合的最低抗体浓度。在加入Abl之 后即刻向每一管中加入不同浓度的潜在抑制性抗体(Ab2)，并且将混合物在4°C下孵育1小 时。通过从对于每一测试样品(Abl+Ab2)读取到的中位荧光减去背景荧光(PBS-5%FCS)， 计算出抑制百分数和相对于最大中位荧光的变化。然后将结果除以单独Abl的中位荧光 (最大结合)减去背景(见下)。通过乘以100得到抑制百分数结果。两次重复试验的平 均值连同它们各自的标准误对抗体浓度作图。下列公式用于计算抑制百分数PI = [ (MF (Abl+Ab2) -MFBgd) / (MFAbl_MFBgd) ] X 100其中PI =抑制百分数；MF(Abl+Ab2)=对于Abl+Ab2混合物测量的中位荧光；MFBgd = 具有PBS-5% FCS的背景中位荧光。因此，本申请提供能够结合癌细胞上抗原的结合蛋白，其中结合蛋白可以通过包 括下列步骤的方法鉴定(1)将固定数量的癌细胞与对于固定数量癌细胞产生最大结合的最低浓度的本文 所公开结合蛋白、优选抗体或抗体片段(Abl)孵育，并且测量Abl的中位荧光(MFam)；(2)通过向Abl和癌细胞加入Ab2测试两种或两种以上浓度的测试结合蛋白 (Ab2)，并且测定中位荧光(MF(Abl+Ab2))；(3)测定背景中位荧光(MFbgd)；(4)计算PI，其中PI = [ (MF (Abl+Ab2) "MFBgd) / (MFAbl_MFBgd) ] X 100 ；和(5)比较PI与对照PI值;其中，与对照PI具有统计学显著性差异的PI表明测试结合蛋白能够结合癌细胞 上本申请的抗原。本领域技术人员会意识到，亲和性成熟技术通过增加对抗原的亲和性，可用于改 良本申请的结合蛋白或免疫偶联物。通常使用两个策略增强抗体的结合亲和性。一个方法是利用对Ab-Ag复合 物晶体结构的解析来鉴定参与抗原结合的关键残基(Davies D. R. , Cohen G. H. 1996. Interactions of protein antigens with antibodies. Proc Natl. Acad. Sci. U. S A. 93, 7-12)。之后，这些残基可以被突变以增强相互作用。另外的方法模拟体内抗原刺激，该刺 激驱动由B细胞产生的免疫球蛋白的亲和性成熟。在免疫反应的成熟过程中，免疫球蛋 白可变区经受体细胞突变(Mc Heyzer-Williams M. 2003. B-cell signaling mechanism and activation. Fundamental Immunology,第五版，195-225)。该方法对免疫系统具有 高特异性，其特征在于以极高的比率引入点突变。它仅存在于编码可变区的DNA片段中， 并且排除保守结构域。然后，表达体细胞突变变体抗体的B细胞经受抗原介导的选择，导 致选择出更高亲和性的免疫球蛋白。为了体外复制该现象，已经使用数种方法，或通过随 机或通过定向过程来引入突变。随机突变可以使用错配PCR、链改组或增变株大肠杆菌引 Λ (Clackson Τ. Hoogenboom N. R. , Griffiths A. D.禾口 Winter G. 1991Makingantibodyfragments using phage display libraries. Nature 352，624—628，HawkinsR. E.，Russell S. J.禾口Winter G. 1992. Selection of phage antibodies by bindingaffinity. Mimicking affinity maturation. J. Mol. Biol. 226，889-896，Low N.，HolligerP.和 Winter G. 1996. Mimicking somatic hypermutation :affinity maturation ofantibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain. J Mol.Biol.260，359-368)。 该策略导致产生大文库，其中反应性克隆使用展示技术，如核糖体、噬菌体或酵母加以选 择(Min L. (2000). Applications of display technology inprotein analysis. Nat. Biotechnol. 18，1251-1256)。已经显示，⑶R(特别是轻链和重链⑶R3)的定向突变是用于增强抗体亲和性的有 效技术。⑶R3的3至4个氨基酸的区段或者称作“热点”的特异性区域被定向诱变。Yang 等报道，通过突变四个CDR残基，抗HIV gpl20Fab片段提高420倍(Yang ff. P. , Green K.， Pinz-Sweeney S. , Briones A. T. , Burton D. R.禾口 Barbas C. F. III. 1995. CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of apotent human anti—HIV—lantibody into picomolar range. J. Mol. Biol.，254，392-403)。在 C6. 5scFv 的 VL CDR3 中的一个 突变与VH⑶R3中三个突变的组合使亲和性提高1230倍(Schier R.，McCall A.，Adams G. P.，Marshall K. ff.，Merrit H.，Yin M.，Crawford R. S. ffeiner L. M.，Marks C.和 Marks J. D. 1996. Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2single-chain Fv by molecular evolutionof the complementary determining regions in the center of the antibody binding site. J. Mol. Biol. ,263,551-567)。“热点”是在体内发生体细胞高变的序列(Neuberger M. S和Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7，248-254)。热点序列可以定义为某些密 码子的共有核苷酸序列。共有序列是四核苷酸RGYW，其中R可以是A或G，Y可以是C或T 并且 W 可以是 A 或 T(Neuberger M. S 禾口 Milstein C. 1995. Somatic hypermutation. Curr. Opin. Immunol. 7，248-254)。此外，相对于对应于潜在热点序列的TCN编码的那些，由核 苷酸AGY编码的丝氨酸残基大部分存在于可变结构域的⑶R区(Wagner S. D.，Milstein C.禾口 Neuberger M. S. 1995. Codon bias targets mutation. Nature, 376, 732)。结构分析 显示CDR环对抗原结合贡献最大，特别是CDR3环(Giudicelli V.，Chaume D.和Lefranc M. P.2004. IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cellreceptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res. 32, 435-440)。因此，扫描每一抗体的重链和轻链⑶R的核苷酸序列，确定是否存在热点序列 和 AGY 密码子。使用 International ImMunoGen Tics 数据库(IMGT，http//imgt. cines. fr/textes/vquest/)将所鉴定的轻链和重链⑶R区的热点与种系的重链和轻链序列比较 (Davies D. R. , Padlan E. A.禾口 Sheriff S. 1990. Antibody-antigencomplexes. Annu. Rev. Biochem. 59，439-473)。序列与种系相同，表明没有发生体细胞突变；因此，模拟体内发生的 体细胞事件的随机突变被引入。与之相反，不同的序列表明已经发生了一些体细胞突变。这 将仍需确定体内体细胞突变是否是最佳的。编码埋入CDR内的氨基酸或者CDR中的保守氨 基酸的热点没有被诱变。这些残基对于总体结构通常是至关重要的，并且由于她们被埋藏， 所以不大可能与抗原相互作用。此外，序列可以与种系序列中、体细胞突变主要发生于此的 预期位置比较(Tomlinson I. M.，Cox J. P. L.，Gherardi E.，LeskA. M.和 Chotia C. 1995.
18The structural repertoire of the human V. 1domain. EMBO J. 14，4628—4638，Tomlinson I. M.，Walter G.，Jones P. T.，Dear P. H.，Sonnhammer E. L L 禾口 Winter G. 1996. The imprint of somatic hypermutation on therepertoire of human germline V genes. J. Mol. Biol. 256,813-817) o相似的策略应用于BL22scFv的亲和性成熟中。将点突变引 入到重链⑶R3中导致对多种⑶22阳性细胞系的结合活性提高5至10倍(Salvatore G.， Beers R.，MarguliesI.，Kreitman R. J.禾口Pastan I. 2002. Improved cytotoxic activity toward cell lines andfresh leukemia cells of a mutant anti-CD22immunotoxin obtained by antibody phagedisplay. Clinical Cancer research，8，995一1002)0 同#， 在⑶R1和⑶R2环中的多个氨基酸的突变也产生了亲和性增加3倍至7倍的突变体(Ho M. , KreitmanJ. , On da M.禾口 Pastan I. 2005. In vitro antibody evolution targeting germline hotspots to increase activity of an anti-CD22 immunotoxin. J.Biol. Chem. ，280，607-617)。在通过随机过程或者定向过程引入突变之后，表达抗体并评估其功能。例如，可以 基于结合进行功能筛选。一旦评估了功能，则使用已知方法对所选择抗休开展DNA测序。在另一实施方案中，Harvey，B等(PNAS 2004 June 22 ；101 (25) :9193_8)描述的 锚定周质表达(APEx)方法用于本申请的结合蛋白或免疫偶联物的亲和性成熟。因此，本申请包括已经被亲和性成熟的本申请的结合蛋白，以增加结合蛋白对 IkB3蛋白包括IkBP同种型l(IkB3 1)、IkBP同种型2(IkB3 2)和/或癌相关的IkB3 变体的亲和性。本申请还提供了包含本申请结合蛋白、优选抗体和抗体片段与可药用赋形剂、载 体、缓冲液或稳定剂的组合物。此外，本申请提供了编码本申请的结合蛋白的分离的核酸序列。本申请还包括这 些核酸序列的变体。例如，变体包括在至少中等严格杂交条件下与编码本申请的结合蛋白 的核酸序列杂交的核酸序列。(C)癌相关抗原发明人已经鉴定了本申请的结合蛋白结合的抗原(包括IkBP蛋白，诸如IkB3 同种型1 (IkB 0 1)、IkB 0同种型2 (IkB 0 2)和/或癌相关的IkB 0变体)。癌相关的抗原 表达于癌细胞表面上并且在正常细胞表面上没有明显的表达。因此，本申请包括可特异性 结合本申请的结合蛋白之一的分离的蛋白及其核酸序列和用途。本申请包括新的癌相关抗原，即癌相关的IkB 0变体。在一个实施方案中，癌相关 的IkB0变体表达于癌细胞表面上并且在正常细胞表面上没有明显的表达。在进一步的实 施方案中，癌相关的IkB0变体具有与IkB0相同的功能(IkB0是NFk-B的抑制性调节因 子)，但在细胞中的位置不同(即位于细胞膜上)。在另一个实施方案中，癌相关的IkB3变 体包含SEQ ID NO :32和/或36限定的氨基酸序列。在另一个实施方案中，癌相关的IkB3 变体包含SEQ IDN0:30限定的氨基酸序列。在另一个实施方案中，癌相关的IkB0变体由 SEQ IDN0:30限定的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，癌相关的IkB0变体包含 SEQ ID NO :27的序列，其中选自26、27、31、34、39、106、111和112位的一个或多个氨基酸 被另一个氨基酸取代或化学修饰。在进一步的实施方案中，取代或化学修饰导致相对于未 修饰的蛋白(即SEQ ID 27)发生改变的区域疏水性增加。在另外的实施方案中，取代是以
19下的一个或多个P026V、D027L、P031V、P034V、E039W、E106V、E111V 和 / 或 K112A。在进一 步的实施方案中，癌相关的IkB0变体包含具有通常不存在于IkB0中的一个或多个跨膜 结构域的IkB0。在一个实施方案中，所述跨膜结构域包含氨基酸序列SEQID NO :53或54。 在一个实施方案中，癌相关的IkB0变体是IkB0 2的变体。本领域技术人员会意识到，本申请包括上述的氨基酸序列的变体，包括本申请公 开的序列的化学等效物。此类等效物包括与本申请的特异性蛋白质以基本相同的方式执行 基本相同功能的蛋白质。例如等效物包括但不限于保守氨基酸取代物。在一个实施方案中，本申请的变体氨基酸序列与SEQ ID NO :30、32、36、53或54具 有至少50%、优选至少60%、更加优选至少70%、最优选至少80%、甚至更加优至少90%、 并且甚至最优选至少95%的序列同一性。本申请包括本申请的新的癌症相关抗原的用途。例如，本申请的新的癌症相关抗 原用于产生可以用于治疗或预防癌症的结合蛋白和免疫偶联物的用途，或者可以用于检测 或监测受试者中癌症的用途或者用于制造治疗或预防癌症的药物的用途。此外，本申请提供了编码本申请的新癌症相关抗原的分离的核酸序列。本申请还 包括这些核酸序列的变体。例如，变体包括在至少中等严格杂交条件下与编码本申请的新 癌症相关抗原的核酸序列杂交的核苷酸序列。(D)免疫偶联物本申请还包括免疫偶联物，包含(1)本申请的结合蛋白，优选抗体或抗体片段，其 已经附着至(2)效应分子。在一个实施方案中，结合蛋白结合至癌细胞上的抗原或分子。在 一个实施方案中，所述抗原或分子包含IkB0蛋白，IkB0同种型l(IkB0 l)、IkB0同种型 2 (IkB 3 2)和/或癌相关的IkB 3变体。在一个优选的实施方案中，效应分子是⑴可以直接或间接产生可检测信号的标 记，或(ii)癌症治疗剂，其或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降 低癌细胞分裂和/或转移的能力。这样的免疫偶联物在本文中一般可以被称为“本申请的 免疫偶联物”。在本申请的一个实施方案中，效应分子是癌症治序剂。癌症治疗剂优选地是毒素， 其或者是细胞毒性的、细胞抑制性的或者以另外的方式阻止或降低癌细胞分裂和/或转移 能力。因此，本申请的一个方面是免疫偶联物，其包含(1)本申请的结合蛋白，优选抗体或 抗体片段，其附着至(2)癌症治疗剂，例如细胞毒素。在另一实施方案中，免疫偶联物被内化，并且癌症治疗剂是阻断细胞的蛋白质合 成、由此导致细胞死亡的细胞毒素。重要的是，由于大多数正常细胞没有广泛表达在癌细胞 上存在的抗原，它们不能结合并内化免疫偶联物，并且被保护免予毒素或其他癌症治疗剂 的杀伤作用。多种效应分子可以用于本申请的免疫偶联物上，并且大量的此类效应分子是胞内 活性分子。因此，在一个实施方案中，免疫偶联物被癌细胞内化。在优选的实施方案中，效应分子是癌症治疗剂，更加优选包含具有核糖体失活活 性的多肽的细胞毒素，包括但不限于白树毒蛋白、bouganin、肥皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖 麻毒蛋白A链、异株泻根毒蛋白、白喉毒素、局限曲菌素、假单胞属(Pseudomonas)外毒素A 及其变体。当蛋白质是核糖体失活性蛋白质时，免疫偶联物结合至癌细胞后必须被内化，以便于蛋白质对于细胞是细胞毒性的。因此，在一个实施方案中，效应分子是细胞毒素并且免 疫偶联物被癌细胞内化。在一个实施方案中，毒素是bouganin或假单胞菌属外毒素A，及其变体。在另一 实施方案中，毒素是修饰的bouganin或者缺乏细胞结合结构域的截短形式的假单胞菌属 外毒素A。在进一步的实施方案中，毒素是基本上无T细胞表位的bouganin，或者由氨基酸 252-608组成的截短形式的假单胞菌属外毒素A。在其他非限定性实施方案中，癌症治疗剂包括起作用以断裂DNA的试剂。因此，癌 症治疗剂可以选自，但不限于，烯二炔(例如加利车霉素和埃斯波霉素)和非烯二炔小分子 试剂(例如博来霉素、甲锭丙基-EDTA-Fe (II))。根据本发明的有用的其他癌症治疗剂包括 但不限于柔红霉素、多柔比星、偏端霉素A、顺钼、丝裂霉素C、海鞘素、倍癌霉素/CC-1065、 和博来霉素/匹来霉素。在其他非限定性实施方案中，癌症治疗剂包括起作用以打断微管蛋白的试剂。 此类试剂可以包括，但不限于，根霉素/美登素、泰素、长春新碱和长春碱、秋水仙碱、 auristatin、多拉司他汀 10MMAE、禾口 peloruside A。在其他非限定性实施方案中，本申请的免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含 烧化剂，包括但不限于 Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNUNSC 409962、白消安 NSC 750、羧基邻苯二甲酸钼 NSC 271674、CBDCA NSC241240、CCNU NSC 79037、CHIP NSC 256927、苯丁酸氮芥NSC 3088、氯脲霉素NSC 178248、顺钼NSC 119875、克罗米松NSC 338947、氰基吗啉代多柔比星NSC 357704、环戊二烯NSC 348948、二脱水半乳糖醇NSC 132313、氟多潘 NSC 73754、h印sulfam NSC 329680、海恩酮 NSC 142982、美法仓 NSC8806、 甲基 CCNU NSC 95441、丝裂霉素 C NSC 26980、米托唑酰胺 NSC353451、氮芥 NSC 762、PCNU NSC 95466、哌嗪NSC 344007、哌嗪双酮NSC135758、哌泊溴烧NSC 25154、泊非霉素NSC 56410、螺妙斯定 NSC 172112、替罗昔隆 NSC 296934、四钼 NSC 363812、噻替派 NSC 6396、曲 他胺 NSC9706、尿嘧啶氮芥 NSC 34462 和 Yoshi-864 NSC 102627。在其他非限定性实施方案中，本申请的免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含抗 有丝分裂剂，包括但不限于异秋水仙碱NSC 406042、大田软海绵素BNSC 609395、秋水仙碱 NSC 757、秋水仙碱衍生物NSC 33410、多拉司他汀10NSC 376128 (NG-auristatin衍生的)、 美登素NSC 153858、根霉素NSC332598、紫杉醇NSC 125973、紫杉醇衍生物NSC 608832、硫 代秋水仙碱NSC 361792、三苯甲基半胱氨酸NSC 83265、硫酸长春碱NSC 49842和硫酸长春 新碱 NSC 67574。在其他非限定性实施方案中，本申请的免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含 拓扑异构酶I抑制剂，包括但不限于喜树素NSC 94600、喜树素钠盐NSC100880、氨基喜树 素NSC 603071、喜树素衍生物NSC 95382、喜树素衍生物NSC 107124、喜树素衍生物NSC 643833、喜树素衍生物NSC 629971、喜树素衍生物NSC 295500、喜树素衍生物NSC 249910、 喜树素衍生物NSC 606985、喜树素衍生物NSC 374028、喜树素衍生物NSC 176323、喜树 素衍生物NSC295501、喜树素衍生物NSC 606172、喜树素衍生物NSC 606173、喜树素衍生 物NSC 610458、喜树素衍生物NSC 618939、喜树素衍生物NSC 610457、喜树素衍生物NSC 610459、喜树素衍生物NSC 606499、喜树素衍生物NSC610456、喜树素衍生物NSC 364830、 喜树素衍生物NSC 606497和吗啉代多柔比星NSC 354646。
在其他非限定性实施方案中，免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含拓扑异构酶 II抑制剂，包括但不限于多柔比星NSC 123127、氨萘非特NSC308847、m-AMSA NSC 249992、 蒽吡唑衍生物NSC 355644、吡唑啉吖啶NSC366140、比桑郡HCL NSC 337766、柔红霉素NSC 82151、脱氧多柔比星NSC267469、米托蒽醌NSC 301739、美诺立尔NSC 269148、N，N-二节 基道诺霉素 NSC 268242、比散特隆 NSC 349174、佐柔比星 NSC 164011、VM-26NSC122819 和 VP-16NSC 141540。在其他非限定性实施方案中，本申请的免疫偶联物的癌症治疗剂部分可以包含 RNA或DNA抗代谢物，包括但不限于L-丙氨菌素NSC 153353、5_氮胞苷NSC 102816、5_氟 尿嘧啶NSC 19893、阿西维辛NSC 163501、氨基蝶呤衍生物NSC 132483、氨基蝶呤衍生物 NSC 184692、氨基蝶呤衍生物NSC 134033、抗叶酸剂NSC 633713、抗叶酸剂NSC 623017、 Baker ‘ s可溶性抗叶酸剂NSC139105、二氯烯内基指甲花醌NSC 126771、布喹那NSC 368390、替加氟(前药)NSC 148958、5，6-二氢-5-氮胞苷 NSC 264880、甲氨蝶呤 NSC 740、 甲氨蝶呤衍生物NSC 174121、N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)NSC 224131、吡唑霉 素 NSC 143095、三甲曲沙 NSC 352122、3_HP NSC 95678,2'-脱氧 _5_ 氟尿苷 NSC 27640、 5-HP NSC 107392、a -TGDR NSC 71851、艾菲地可宁甘氨酸酯 NSC 303812、阿糖胞苷 NSC 63878、5_ 氮杂-2'-脱氧胞苷 NSC 127716、3-TGDR NSC 71261、环胞苷 NSC 145668、胍唑 NSC 1895、羟基脲NSC32065、肌苷乙醇二酸NSC 118994、麦克菌素II NSC 330500、吡唑咪 唑NSC51143、硫鸟嘌呤NSC 752和硫嘌呤NSC 755。在另一非限定性实施方案中，免疫偶联物的治疗部分可以是核酸。可以使用的核 酸包括但不限于反义RNA、基因或其他多核苷酸、核酸类似物，例如硫鸟嘌呤和硫嘌呤。本申请进一步提供了免疫偶联物，包含(i)本申请的结合蛋白，优选抗体或抗体 片段，其附着至(2)效应分子，其中效应分子是可以间接或直接产生可检测信号的标记。这 些免疫偶联物可以用于研究应用或者诊断应用，如癌症的体内检测。标记优选地能够直接 或间接产生可检测信号。例如，标记可以是不透射线的或者放射性同位素，例如3H、14C、32P、 35S、123I、125I、131I ；荧光(荧光团)或化学发光(生色团)化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗 丹明或萤光素；酶，例如碱性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；显像剂；或金属离 子。在另一实施方案中，免疫偶联物是间接可检测性的。例如，对免疫偶联物具有特异 性并且包含可检测标记的二级抗体可以用于检测免疫偶联物。本申请的结合蛋白，优选抗体或抗体片段，可以通过结合蛋白可以结合或连接至 效应分子的任何方式“附着至”效应分子。例如，结合蛋白可以通过化学或重组方式附着至 效应分子。用于制备融合物或者连接物的化学方法在本领域是众所周知的，并且可以用于 制备免疫偶联物。用于将结合蛋白和效应分子连接的方法必须能够将结合蛋白与效应分子 接合，而不干扰结合蛋白结合至癌细胞上抗原的能力。本申请的结合蛋白可以间接连接至效应分子。例如，结合蛋白可以直接连接至包 含几种类型之一的效应分子的脂质体。一种或多种效应分子和/或结合蛋白还可以结合至 固体表面。在一个实施方案中，结合蛋白(优选抗体或抗体片段)和效应分子均是蛋白质，并 且可以使用本领域众所周知的技术连接。有数百种能将两种蛋白质连接的交联剂可利用
22(见例如"Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking，， 1991, Shans Wong, CRC Press,Ann Arbor)。交联剂通常基于结合蛋白(优选抗体或抗体片段)和/或效应分 子上可利用的或者插入的活性官能基进行选择。此外，如果不存在反应基，可以使用光活化 交联剂。在某些情况下，希望在结合蛋白(优选抗体或抗体片段)与效应分子之间包含间 隔子。本领域已知的交联剂包括同双功能试剂戊二醛、二甲基己二亚酰胺和双(重氮联苯 胺)和异双功能试剂(m maleimidobenzoyl)顺丁烯酰胺苯甲酸_N_羟基琥珀酰亚胺和硫 代顺丁烯酰胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺。在某些情况下，本申请的结合蛋白可以用用于效应分子化学附着的特定残基进行 工程改造。本领域已知的用于分子化学附着的特定残基包括赖氨酸和半胱氨酸。交联剂基 于结合蛋白上插入的活性官能基和效应分子上可利用的活性官能基来选择。结合蛋白-效应分子蛋白质融合也可以使用重组DNA技术制备。在此种情况下， 编码结合蛋白的DNA序列融合至编码效应分子的DNA序列，产生嵌合DNA分子。嵌合DNA 序列被转染进入宿主细胞，宿主细胞表达融合蛋白。可以从细胞培养物中回收融合蛋白并 且使用本领域已知的技术纯化。将作为标记的效应分子附着至结合蛋白的实例包括描述于Hunter，等，Nature 144:945(1962) ；David，等，Biochemistry 13:1014(1974) ；Pain，等，J. Immunol. Meth. 40 219(1981) ；Nygren, J.Histochem. and Cytochem. 30 407(1982) ；ffensel 禾口 Meares， Radioimmunoimaging AndRadioimmunotherapy, Elsevier, N. Y. (1983)； 和 Colcher 等，"Use OfMonoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of HumanCarcinoma Xenografts In Athymic Mice" , Meth. Enzymol. , 121 :802_16(1986) 中的方法。在一个实施方案中，免疫偶联物包含由SEQ ID NO :67定义的氨基酸序列。本申请 还包括该序列的变体。本申请还提供了编码本申请的免疫偶联物的分离的核酸序列。在一个实施方案 中，分离的核酸序列编码包含SEQ ID NO :67限定的氨基酸序列的蛋白。在另一实施方案 中，分离的核酸序列包含SEQ ID NO :660本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包括在至少中等严格杂交条件下 与编码本申请的免疫偶联物的核酸序列杂交的核酸序列。(E)蛋白质的制备本领域技术人员会意识到，本申请的蛋白质，例如本申请的轻链和重链互补决定 区、轻链和重链可变区、抗体和抗体片段、免疫偶联物、新癌相关抗原可以以数种方法任一 种制备，但是最优选使用重组方法制备。因此，本申请的核酸分子可以以已知方式整合入保证本申请的蛋白蛋白质良好表 达的适宜表达载体中。可能的表达载体包括，但不限于，粘粒、质粒、或改造的病毒(例如复 制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，只要载体与所使用的宿主细胞相容即可。表 达载体“对于转化宿主细胞是适宜的”，这意味着表达载体包含本申请的核酸分子和在待用 于表达的宿主细胞基础上选择的、有效连接至核酸分子的调节序列。有效连接旨在指以允 许核酸表达的方式将核酸连接至调节序列。因此，本申请包括包含本申请的核酸分子或其片段和对于所插入蛋白质序列转录和翻译所必需的调节序列的重组表达载体。适宜调节序列可以来源于多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物、或昆虫基因 (例如，见 Goeddel, Gene Expression Technology :Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)中描述的调节序列)。适宜调节序列的选择如下面所讨论依 赖于所选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地实现。此类调节序列的实 例包括转录启动子和增强子或者RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信 号。此外，取决于所选择的宿主细胞和所采用的载体，其它序列，例如复制起点、额外的DNA 限制位点、增强子、和赋予转录可诱导性的序列可以整合入表达载体中。本申请的重组表达载体还可以包含选择标记基因，其利于选择转化或转染有本申 请的重组分子的宿主细胞。选择标记基因的实例是编码下列蛋白质的基因，例如赋予对某 些药物抗性的G418和潮霉素、0 -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫萤光素酶或者免 疫球蛋白或其部分，例如免疫球蛋白、优选IgG的Fc部分。选择标记基因的转录通过选择 标记蛋白例如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶浓度的变化来监测。 如果选择标记基因编码赋予抗生素抗性如新酶素抗性的蛋白质，则转化体细胞可以用G418 筛选。已经整合有选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡。这使得可以显现和测定 本申请的重组表达载体的表达，并且具体而言可以确定突变对表达和表型的效应。应当意 识到，选择标记可以引入到与目的核酸分开的载体上。重组表达载体还可以包含编码融合部分的基因，所述融合部分提供了增强的重组 蛋白表达；增强的重组蛋白溶解度；和通过充当亲和纯化中的配体来帮助靶重组蛋白的纯 化。例如，蛋白酶水解位点可以加入至靶重组蛋白中以允许在融合蛋白纯化之后将重组蛋 白与融合部分分离。代表性的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp. , Melbourne，澳大利 亚)、pMal(New England Biolabs,Beverly, MA)禾口 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, NJ),它 们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A与重组蛋白融合。重组表达载体可以引入至宿主细胞中，以产生转化的宿主细胞。术语“转化有”、 “转染有”、“转化”和“转染”旨在包括通过本领域已知的多种可能技术之一将核酸(例如载 体)引入细胞内。术语“转化的宿主细胞”，如本文所使用，旨在还包括已经以本申请的重 组表达载体转化了的、能够糖基化的细胞。原核细胞可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的 转化以核酸转化。例如，核酸可以通过常规技术，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚 糖介导的转染、lipofectin (脂转染试剂)、电穿孔或微注射引入至哺乳动物细胞中。用于 转化和转染宿主细胞的适宜方法可以在Sambrook等(Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)和其它实验室教科书中找 到。适宜的宿主细胞包括广泛多种的真核宿主细胞和原核细胞。例如，本申请的 蛋白质可以在酵母细胞或者哺乳动物细胞中表达。其它适宜宿主细胞可以在Goeddel， Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego, CA(1991)中找到。此外，本申请的蛋白质可以在原核细胞，例如大肠酐菌中表达(Zhang
Science 303(5656) :371_3 (2004))。此外，可以使用基于假单胞菌属的表达系统，例 如荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)(美国专利申请公布号US 2005/0186666， Schneider, Jane C 等)。
适宜开展本申请酵母和真菌宿主细胞包括，但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和曲霉属 (Aspergillus)的多个种。用于在酿酒酵母中表达的载体实例包括pY印Seel (Baldari. 等，Embo J. 6 :229-234(1987))、pMFa (Kur jan 和 Herskowitz，Cell 30 :933_943 (1982))、 pJRY88(Schultz 等，Gene 54 113-123(1987))和 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。用于酵母和真菌转化的方法是本领域普通技术人员众所周知的(见Hirmen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929(1978) ；Ito 等，J. Bacteriology 153:163(1983)， 和 Cullen 等.(Nat BiolTech 5:369(1987))。除了其它，适宜实施本发明的哺乳动物细胞包括C0S (例如ATCC号CRL1650或 1651)、BHK (例如 ATCC 号 CRL 6281)、CH0 (ATCC 号 CCL 61)、HeLa (例如 ATCC 号 CCL 2)、 293 (ATCC号1573)和NS-1细胞。用于指引在哺乳动物细胞中表达的适宜表达载体通常包 括启动子(例如衍生自病毒物质，例如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40)以 及其它转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B. , Nature 329 840(1987))和 pMT2PC (Kaufman 等，EMBO J. 6 187-195 (1987))。按照本文提供的教导，启动子、终止子和用于将适宜类型表达载体引入植物、禽类 和昆虫细胞内的方法也可以容易实现。例如，在一个实施方案中，本申请的蛋白质可以从 植物细胞表达(见Sinkar等，J. Biosci (Bangalore) 11 :47_58 (1987)，其综述了毛根农杆 菌(Agrobacterium rhizogenes)载体的应用；还见 Zambryski 等，Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender 和 Setlow(编者)，第 VI 卷，第 253-278 页，Plenum Press, New York (1984)，其描述了表达载体用于植物细胞的用途，包括PAPS2022、PAPS2023 和 PAPS2034 等)。适宜实施本发明的昆虫细胞包括来自蚕(Bombyx)、粉纹夜蛾(Trichoplusia) 或斜纹夜蛾(Spodotera)物种的细胞和细胞系。可利用的用于在培养的昆虫细胞(SF 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，Mol.CellBiol.3 2156-2165(1983))禾口 pVL 系列(Luckow, VA.，禾口 Summers, M. D.，Virology 170 31-39(1989)。可选地，本申请的蛋白质还可以在非人转基因动物中表达，例如大鼠、兔、绵羊和 猪(Hammer 等.Nature 315 :680_683(1985) ；Palmiter 等 Science222 :809_814(1983)； Brinster 等.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442(1985) ；Palmiter 和 Brinster Cell 41 343-345 (1985)和美国专利号 4，736，866)。本申请的蛋白质还可以通过使用蛋白质化学领域众所周知的技术，例如固相合 成(Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85 2149-2154 (1964) ；Frische 等，J. Pept. Sci. 2(4) 212-22(1996)) $ 同 夕夜内(Houbenweyl, Methods ofOrganic Chemistry, H # E. Wansch，第 151 和 II 卷，Thieme, Stuttgart (1987))的化学合成来制备。包含与其它分子例如蛋白质连接的本申请的蛋白质的N末端或C末端融合蛋白 质，可以通过重组技术经融合加以制备。所得到的融合蛋白质包含融合至如本文所述的所 选择蛋白质或标记蛋白质的本申请的蛋白质。本申请的重组蛋白质还可以通过已知技术连 接至其它蛋白质。例如，可以使用如W0 90/10457中所述的异双功能含巯基连接体N-琥珀 酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代丙酸酯)或N-琥珀酰亚胺基5硫代乙酸酯将蛋白质偶联。可以用于制备融合蛋白质或连接物的蛋白质的实例包括细胞结合蛋白，例如免疫球蛋白、激 素、生长因子、凝集素、胰岛素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、内啡肽类、转铁蛋白、铃蟾肽、脱 唾液酸糖蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血凝素(HA)和截短的myc。因此，本申请提供了包含编码本申请的蛋白质的核酸序列的重组表达载体，本申 请的蛋白质为例如本申请的轻链和重链互补决定区、轻链和重链可变区、结合蛋白例如抗 体和抗体片段、免疫偶联物以及新的本申请的分离蛋白质。此外，本申请提供了包含本申请 的核酸序列或重组表达载体的宿主细胞。(f) ^^ma^m&^^mmmmm^^发明人已经证明了本申请的结合蛋白显示对IkB0蛋白-包括IkB0 l、IkB0 2和 癌相关的IkB0变体具有特异性。IkB0通常是胞内的。然而，发明人已经证实癌细胞可在 癌细胞表面表达可检测的IkB0变体。因此，本发明人已经证实本申请的结合蛋白显示对 癌细胞的特异性。此外，发明人还证明了本申请的结合蛋白被癌细胞内化。因此，本申请的 结合蛋白可以用于靶向递送生物活性或者医学相关试剂，例如成像剂、放射活性剂或细胞 毒性剂。一个实施方案是治疗或预防癌症的方法，包括向患有或者怀疑患有癌症的受试者 施用有效量的本申请的免疫偶联物。另一实施方案是有效量的本申请的免疫偶联物在制造 用于治疗或预防癌症的药物中的用途。此外，本申请提供了有效量的本申请的免疫偶联物 的用途，还包括附加的癌症治疗剂在制造用于同时、单独或者依次治疗或预防癌症的药物 中的用途。本申请还提供了有效量的本申请的免疫偶联物用于治疗或预防癌症的用途。此 外，本申请提供了有效量的本申请的免疫偶联物的用途，还包括额外的癌症治疗剂用于同 时、单独或依次治疗或预防癌症的用途。在一个实施方案中，癌症包括，但不限于，胃癌、结肠癌、前列腺癌，以及宫颈癌、子 宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳腺癌(例如导管癌、小叶 癌和乳头癌)、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴细胞性白血 病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、和慢性髓性白血病)、脑癌、神经母细胞瘤、肉 瘤、直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在另一实施方案中， 癌症是结肠癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫癌、头颈癌、前列腺癌或肺癌。在又 一个实施方案中，癌症是结肠癌、胰腺癌或肾癌。本申请的免疫偶联物选择性抑制或破坏癌性细胞的能力可以使用癌细胞系在体 外容易地试验。本申请的免疫偶联物的选择性抑制作用可以通过例如证明癌细胞的细胞增 殖被选择性地抑制来确定。毒性也可以基于细胞生存力测量，例如可以比较暴露于免疫偶联物的癌细胞和正 常细胞培养物的生存力。细胞生存力可以通过已知技术，例如台盼兰排斥试验评价。在另一实例中，可以使用许多模型以测试本申请的免疫偶联物的有效性。 Thompson, E. ff.等(Breast Cancer Res. Treatment 31:357—370(1994))已经描述了用 于通过测量肿瘤细胞介导的对细胞外基质的蛋白酶解和肿瘤细胞对重建基膜(胶原、层 粘连蛋白、纤连蛋白、Matrigel或明胶)的侵袭来确定人乳腺癌细胞体外侵袭的模型。其 它可应用的癌细胞模型包括培养的卵。巢腺瘤细胞(Young，T.N.等.Gynecol. Oncol. 62 89-99(1996) ；Moore, D. H.等.Gynecol. Oncol. 65 :78_82 (1997))、人滤泡性甲状腺癌细胞
26(Demeure, M.J.等，World J. Surg. 16 :770_776 (1992))、人黑素瘤(A-2058)和纤维肉瘤 (HT-1080)细胞系(Mackay，A. R.等 Lab. Invest. 70 781 783(1994))和肺鳞状(HS-24)和 腺癌(SB-3)细胞系(Spiess，E.等.J. Histochem. Cytochem. 42 :917_929 (1994))。也已经 描述了涉及在无胸腺裸鼠中肿瘤植入和测定肿瘤生长和转移的体内试验系统(Thompson， E. ff.等,Breast Cancer Res. Treatment 31 :357_370(1994) ；Shi,Y. E.等，Cancer Res. 53 1409-1415(1993))。本申请的免疫偶联物可以配制成用于向受试者施用的、适宜体内施用的生物相容 形式的药物组合物。物质可以施用至活有机体，包括人和动物。本发明的治疗有效量的药 物组合物的施用定义为，在此剂量下和达到预期结果所必需的时间阶段内有效的量。例如， 物质的治疗有效量可以根据多种因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及 本申请的重组蛋白在个体内引起所希望的反应的能力。可以调整剂量方案以提供最佳的治 疗反应。例如，可以每日施用数个分次剂量，或者如治疗状况的急迫性所指示，剂量可以按 比例减少。因此，本申请提供用于治疗或预防癌症的药物组合物，包含本申请的免疫偶联物 和可药用载体、稀释剂或赋形剂。在优选的实施方案中，药物组合物中免疫偶联物的效应分 子是癌症治疗剂，更加优选毒素。包含免疫偶联物的药物制剂可以全身施用。药物制剂可以直接向癌症部位施用。 取决于施用途径，免疫偶联物可以包裹在材料中以保护化合物不受酶、酸和可能使化合物 失活的其它天然条件作用。根据本申请的一个方面，免疫偶联物通过直接施用递送至患者。本申请考虑了药 物组合物以至少足以达到终点的量施用，并且必要时包含可药用载体。本申请还提供用于降低术后并发症危险的方法，包括在手术治疗癌症之前、之中 或之后施用有效量的免疫偶联物。本文所述的组合物可以通过用于制备可向受试者施用的可药用组合物的实质上 已知的方法来制备，以致于有效量的活性物质与可药用赋形剂组合在混合物中。适宜赋形 剂描述于，例如 Remington' s PharmaceuticalSciences (Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 20 版，Mack PublishingCompany, Easton, Pa.，USA，2000)。在此基础上，组合 物包括，然而非排他性地包括，物质与一种或一种以上可药用赋形剂或稀释剂结合的溶液， 并且包含在具有适宜PH和与生理流体等渗的缓冲溶液中。药物组合物包括但不限于，冻干粉末或者水性或非水性无菌注射溶液或混悬液， 其还可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得组合物基本上与预期接收者的组织或血液 相容的溶质。可以存在于此类组合物中的其它成分包括例如水、表面活性剂(例如Tween)、 醇类、多元醇类、甘油和植物油类。临时配制的注射溶液和混悬液可以从无菌粉末、颗粒、片 剂、或浓溶液或混悬液制备。免疫偶联物可以作为在向患者施用之前用无菌水或盐水重构 的冻干粉末加以提供，但不限于此方式。药物组合物可以包含可药用载体。适宜可药用载体包括基本上化学惰性的和无 毒的不干扰药物组合物生物活性有效性的组分。适宜药物载体的实例包括但不限于水、 盐溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2，3-二油酰基(oleyloxy))丙基)N，N, N_三甲基氯化铵 (D0TMA)、二油酰基磷脂酰(phosphotidyl)乙醇胺(DOPE)和脂质体。此类组合物应包含治
27疗有效量的化合物以及适宜量的载体以便提供用于向患者直接施用的形式。组合物可以是可药用盐的形式，其包括但不限于与游离氨基形成的那些，例如从 盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的那些，和与游离羧基形成的那些，例如从氢氧化钠、 氢氧化钾、氢氧化胺、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡 因等衍生的那些。在多个实施方案中，药物组合物直接全身施用，或者直接向一个或多个肿瘤区施用。药物组合物可以用于治疗患有癌症的动物(包括哺乳动物，优选人)的方法中。待 施用的免疫偶联物的剂量和类型将取决于多种因素，其可以在人受试者中容易地监测。此 类因素包括癌症的病原学和严重性(级别和阶段)。使用本申请的免疫偶联物治疗癌症的临床结果可由相关领域的技术人员，如医生 容易地辨别。例如，测量癌症的临床标志的标准医学试验可以是治疗有效性的强指示剂。此 类试验可包括，但不限于，身体检查、性能尺度、疾病标志物、12导联心电图、肿瘤测量、组织 活检、细胞检查、细胞学、肿瘤的最长直径计算、放射摄影术、肿瘤的数字成像、生命体征、体 重、不良事件记录、感染发作的评估、伴行用药的评估、疼痛评估、血液或血清化学、尿液分 析、CT扫描、和药物代谢动力学分析。此外，包括免疫偶联物和另一癌症治疗剂的联合治疗 的协同效应可通过与经受单一疗法的患者进行比较研究来确定。在大多数许可的癌症治疗法中，癌症治疗法用于与其它癌症治疗法联合。因此， 本申请提供使用本申请的免疫偶联物与至少一种另外癌症治疗法联合预防或治疗癌症的 方法。其它癌症治疗法可以在免疫偶联物施用之前施用、交叉重叠施用、并行施用和/或 之后施用。当并行施用时，免疫偶联物和其它癌症治疗剂可以在单一制剂中施用或者在 分开的制剂中施用，并且，如果分开施用，则任选通过不同施用模式施用。一种或一种以 上免疫偶联物和一种或一种以上其它癌症治疗法的组合将协同作用以对抗肿瘤或癌症。 其它癌症治疗法包括但不限于其它癌症治疗剂，包括但不限于2，2，2三氯三乙胺盐酸盐 4,4' -(1,2-乙二基(Ethanediyl))双(1_异丁氧基羰基氧基甲基_2，6-哌嗪二酮、5， 6- 二氢-5-氮胞苷、5-羟基-2-甲酰基吡啶硫代缩氨基脲、6-氮杂尿苷、6-重氮-5-氧 代-L-正亮氨酸、相思豆毒蛋白、阿西维辛、阿柔比星、阿地流津、阿仑单抗、异秋水仙碱、甲 胎蛋白、a-硫脱氧鸟苷、六甲蜜胺、氨基喜树素、氨基格鲁米特、氨基蝶呤衍生物、氨萘非 特二盐酸盐、氨萘非特L-苹果酸盐、安吖啶、阿那曲唑、盐酸安西他滨、血管生成素、反义寡 核苷酸、血管抑制素、蒽霉素、蒽吡唑、艾菲地可宁甘氨酸酯、门冬酰胺酶auristatin E、自 体细胞或组织、阿扎胞苷、偶氮丝氨酸、氮丙啶、卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)、卡介 苗活疫苗、苯替派(benzot印a)、^倍他米松、0硫鸟嘌呤脱氧核糖核苷、贝伐单抗、金霉 素、比卡鲁胺、比桑郡、博来霉素、勃地酮、布喹那、布舍瑞林、白消安、放线菌素c、加利车霉 素、卡普睾酮、卡培他滨、卡钼、碳钼、羧基邻苯二甲酸钼、癌胚抗原肽1、癌胚抗原肽1-6D、 卡氮芥、卡柔比星、嗜癌菌素A、CC-1065、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、醋酸氯地孕酮、氯脲霉 素、色霉素、顺钼、克拉屈滨、克罗米松、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、皮质醇、可的松、氰基吗 啉代多柔比星、环戊二烯、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、达卡巴嗪更生霉素、达沙替 尼、柔红霉素、地西他滨(decitabine)、秋水仙胺、地尼白介素(denileukin diftitox)、 脱氧多柔比星、地塞米松、二脱水半乳糖醇、地吖醌、二氯烯丙基指甲花醌、白喉毒素、偏
28端霉素A、多西他塞、多拉司他汀10、去氧氟尿苷、多柔比星、屈洛昔芬、屈他雄酮丙酸酯 (dromostanolone propionate)、柔红霉素酉享(duborimycin)、倍癌霉素 A、倍癌霉素 SA、依 达曲沙、依洛尼塞、依利醋铵、依米丁、乙嘧替氟、内皮抑制素、依诺他滨、表柔比星、环硫雄 醇、盐酸埃罗替尼、埃斯波霉素、雌莫司汀磷酸钠、溴化乙锭、依托格鲁、依托泊苷、法倔唑、 芬维A胺(fenretinide)、氟脲苷、氟达拉滨、氟多潘、氟他胺、福美坦、磷雌酚、福莫司汀、硝 酸镓、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星、糖皮质激素、戈舍瑞林、短杆菌肽D、 胍唑、大田软海绵素B、h印sulfam、己烷雌酚、人绒毛膜促性腺激素、海蒽酮、羟基脲、伊达 比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、英丙舒凡、肌苷乙醇二醛(inosineglycodialdehyde)、 干扰素、干扰素-a、干扰素、干扰素-Y、白细胞介素-12、白细胞介素-15、白细胞介 素-18、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-2、白细胞介素_6、白细胞介素类、伊 立替康、异丙钼、L"门冬酰胺酶、拉帕替尼二苯甲磺酸酯、盐酸伊立替康、香菇多糖、来曲 唑、甲酰四氢叶酸钙、醋酸亮丙瑞林(抑那通)、左旋咪唑、利多卡因、罗莫司丁、氯尼达 明(lonidamine)、lucorteum、淋巴因子、淋巴毒素、麦克菌素II、巨噬细胞炎性蛋白、甘 露醇氮芥、美登素、盐酸氮芥、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、 美雄烷、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤衍生物、美乌替派、单甲基auristatin E、 miltefosine、二溴甘露醇、丙米腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇、丝裂霉素C、曼托坦、米托 蒽醌、米托唑酰胺、蒙匹胺醇、吗啉代多柔比星、突变的肿瘤特异性抗原、霉酚酸、N-(膦乙 酰基)-L_天冬氨酸、N、N- 二苄基柔红霉素、神经生长因子、尼罗替尼、尼鲁米特、尼莫司 汀、二胺硝吖啶(nitracine)、诺加拉霉素、非自体细胞或组织、奥利默森(oblimersen)、雌 激素、0GX-011、橄榄霉素类、骨黏连蛋白0NYX-015、草酸钼、泰素、泰素衍生物、1-(2_氯乙 基)-3-(2，6_ 二氧-3-哌啶基)-1_亚硝基脲、培门冬酶、喷司他丁(pentostatin)、派来霉 素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、苯芥胆留醇、普卡霉素、哌嗪衍生物、哌嗪双 酮、哌泊溴烷、哌泊舒凡、吡柔比星、卩比曲克辛、piroxantrone、血小板衍生生长因子、纤维蛋 白溶酶原kringle 5、普卡霉素、鬼白毒素、聚磷酸雌二醇、聚谷氨酸毒树碱卟吩姆钠、紫菜 霉素、松龙苯芥、泼尼松、丙卡巴胼、普鲁卡因、丙帕锗(propagermanium)、普萘洛尔、假单 胞菌属外毒素、多糖-K，蝶罗呤(pteropterin)、嘌呤霉素、吡唑霉素、吡唑啉吖啶、吡唑咪 唑、雷替曲塞(raltitrexed)、雷诺氮芥(ranimustine)、雷佐生(razoxane)、重组人细胞单 细胞集落刺激因子、类视黄醇、根霉素、蓖麻毒蛋白A、利妥昔单抗罗喹美克、丝氢酸蛋白酶 抑制剂、甲苯磺酸索拉非尼、锗螺胺(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、链黑菌 素、链脲霉素、苹果酸舒尼替尼、柠檬酸他莫昔芬、替加氟脲、替莫唑胺(temozolomide)、替 尼泊苷、细交链孢菌酮酸(enuazonicacid)、台罗西隆(teroxirone)、睾内脂、丁卡因、四氯 己钼胺(tetraplatin)、沙立度胺、硫代秋水仙碱、硫鸟嘌呤、硫嘌呤、噻替派、trabectedin、 血小板反应蛋白I衍生的肽、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、拓扑替康、托瑞米芬、曲妥珠单 抗、维甲酸、三嗪苯酰胺、三亚胺醌、三亚乙基三聚氰胺、曲洛司坦、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲 普瑞林、S-三苯甲基-L-半胱氨酸、trofosfamide、杀结核菌素、肿瘤坏死因子样细胞因子、 重组肿瘤坏死因子家族蛋白、乌苯美司、尿嘧啶芥子、尿嘧啶、乌瑞替哌、聚氨酯、凡德他尼、 VEGF反义寡核苷酸、长春碱、硫酸长春碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、吉 雄-864(yoshi-864)、净司他丁、佐柔比星。 在另一实施方案中，一种或一种以上的本申请的免疫偶联物可以与一种或一种以上的下列癌症治疗法或者下列类别治疗剂组合施用，包括但不限于放射治疗、手术治疗、基 因治疗、控制副作用的试剂(例如抗组胺剂、抗恶心剂)、癌症疫苗、血管发生抑制剂、免疫 调节剂、抗炎剂、免疫抑制剂、提高抗原表达的试剂、与癌症治疗相关的其它试剂、化学治疗 剂、免疫治疗剂、光敏剂、tk抑制剂、抗生素、抗代谢物剂、用于断裂DNA的试剂、用于断裂微 管蛋白的试剂、烷化剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、细胞因子、生长因子、 激素治疗、长春花生物碱、植物生物碱和/或抗有丝分裂剂。的确，向需要此类治疗的患者施用有效量的免疫偶联物将导致具有显著临床功效 的另一癌症治疗剂的剂量减少。降低其它癌症治疗剂剂量的此种功效在不施用免疫偶联物 时观察不到。因此，本申请提供了治疗肿瘤或癌症的方法，包括施用减少剂量的一种或一种 以上其它癌症治疗剂。此外，向需要此种治疗的患者进行包含免疫偶联物的联合治疗与标准治疗方案的 持续期间和周期数相比治疗时间相对缩短。因此，本申请提供治疗肿瘤或癌症的方法，包括 在相对短的持续时间内和/或在较少的治疗周期中施用一种或一种以上其它癌症治疗剂。因此，根据本申请，包含免疫偶联物和另一癌症治疗剂的联合治疗可以降低总体 癌症治疗的毒性(即副作用)。例如，与单一治疗或者另种联合治疗相比，当递送减少剂量 的免疫偶联物和/或其它癌症治疗剂和/或当减少周期的持续时间(即单一施用的周期或 一系列此类施用的周期)和/或当减少周期数时，可以观察到毒性降低。因此，本申请提供药物组合物，其包含免疫偶联物和一种或一种以上另外的抗癌 治疗剂，任选地在可药用载体中。本申请还提供试剂盒，包含有效量的免疫偶联物，任选地与一种或一种以上其它 癌症治疗剂组合，以及其用于治疗癌症的使用说明书。试剂盒还可以包括辅助试剂。例如， 试剂盒可以包括用于将免疫偶联物注射入受试者的器械，如注射器；储藏或运输免疫偶联 物的容器；和/或可药用赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂。如上所述，使用免疫偶联物的联合治疗可以使癌症或肿瘤对另一癌症治疗剂的施 用敏感。因此，本申请考虑了用于预防、治疗癌症和/或防止癌症复发的联合治疗，包括在 施用减少剂量的癌症治疗剂之前、之后或者同时施用有效量的免疫偶联物。例如，使用免疫 偶联物的最初治疗将增加癌症或肿瘤对随后的癌治疗剂剂量治疗的敏感性。该剂量接近或 低于当癌症治疗剂单独施用时或者在缺乏免疫偶联物的情况下施用时标准剂量的低值。当 并行施用时，免疫偶联物可以与癌症治疗剂分开施用，并且任选地通过不同的施用模式施 用。在可选实施方案中，另一癌症治疗剂的施用将使癌症或肿瘤对免疫偶联物或结合 蛋白敏感。在此种实施方案中，另一癌症治疗剂可以在免疫偶联物或结合蛋白施用之前给 与。在一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括顺钼，例如PLATIN0L或 PLATINOL-AQ (Bristol Myers)，剂量为约 5-10、11-20、21_40 或 41_75mg/m2/周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括卡钼，例如PARAPLATIN(Bristol Myers)，剂量为约 2-3、4_8、9_16、17-35/ 或 36_75mg/m2/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括环磷酰胺，例如CYTOXAN (Bristol Myers Squibb)，剂量为约 0. 25-0. 5,0. 6-0. 9、1_2、3-5、6_10、11—20 或 21_40mg/kg/ 周期。
在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括阿糖胞苷，例如 CYTOSAR-υ(Pharmacia & Upjohn)，剂量为约 0. 5_1、2-4、5_10、11_25、26_50 或 51-IOOmg/ m2/周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括阿糖胞苷脂质体，例如 DEPOCYT(Chiron Corp.)，剂量为约 5_50mg/m2/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括达卡巴嗪，例如DTIC或 DTICDOME(Bayer Corp.)，剂量为约 15_250mg/m2/ 周期、约 0. 2_2mg/kg/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括拓扑替康，例如， HYCAMTIN(SmithKline Beecham)，剂量为约 0. 1 到 0. 2,0. 3 到 0. 4,0. 5 到 0. 8 或 0. 9 到 1. 5mg/m2/周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括拓扑替康，例如， CAMPTOSAR(Pharmacia&Upjohn)，剂量为约 5 到 9、10 到 25 或 26 到 50mg/m2/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括氟达拉宾，例如，FLUDARA(Berlex Laboratories)，剂量为约 2. 5 到 5、6 到 10、11 到 15 或 16 到 25mg/m2/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括阿糖胞苷(Ara-C)，剂量为约200到 2000mg/m2/ 周期、300 到 1000mg/m2/ 周期、400 到 800mg/m2/ 周期或 500 到 700mg/m2/ 周 期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括多西他赛，例如，TAX0TERE(Rhone Poulenc Rorer)，剂量为约 6 到 10、11 到 30 或 31 到 60mg/m2/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括泰素，例如，TAXOL(BristolMyers Squibb)，剂量为约 10 到 20,21 到 40,41 到 70 或 71 到 135mg/kg/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括5-氟尿嘧啶，剂量为约0. 5到5mg/ kg/周期、1到4mg/kg/周期或2-3mg/kg/周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括多柔比星，例如， ADRIAMYCIN(Pharmacia & Upjohn)、D0XIL(Alza)、RUBEX(Bristol MyersSquibb)，剂量为约 2 到 4、5 到 8、9 到 15、16 到 30 或 31 到 60mg/kg/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括依托泊苷，例如， VEPESID (Pharmacia & Upjohn)，剂量为约 3. 5 到 7、8 到 15、16 到 25 或 26 到 50mg/m2/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括长春碱，例如，VELBAN(EliLilly), 剂量为约0. 3到0. 5、0. 6到0. 9、1到2或3到3. 6mg/m2/周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括长春新碱，例如，ONCOVIN(Eli Lilly)，剂量为约 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6 或 0. 7mg/m2/ 周期。在另一种实施方案中，另外的癌症治疗剂包括甲氨喋呤，剂量为约0.2到0.9、1到 5、6 到 10 或 11 到 20mg/m2/ 周期。因此，联合治疗可以增加癌症或肿瘤对所施用免疫偶联物和/或另一癌症治疗剂 的敏感性。以该种方式，更短的治疗周期是可能的，由此减少了毒性事件。周期持续时间 可以根据使用的特定癌症治疗剂而变化。本申请还考虑了连续或者间断施用，或者日剂量 分成数个部分施用。对于特定癌症治疗剂的适宜周期持续时间将由本领域技术人员确定， 并且本申请考虑了对于每一癌症治疗剂的最佳治疗方案的连续评估。对于技术人员的具体指导在本领域是已知的。见例如Therasse等，2000，“New guidelines to evaluate the response to treatmentin solid tumors。 European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute ofCanada,"J N atl Cancer Inst. Feb 2 ；92 (3) :205_16o考虑了免疫偶联物可以通过任可适宜方法施用，例如注射、口服施用、吸入经皮或 者瘤内施用，而任何其它癌症治疗剂可以通过相同施用模式或者另一施用模式递送至患 者。此外，当打算将多重癌症治疗剂递送至患者时，免疫偶联物和一种或一种以上其它癌症 治疗剂可以通过一种方法递送，而其它癌症治疗剂可以通过另一种施用方式递送。(G) ■齢舶麵斿龍_關去禾口i·所公开的结合蛋白选择性地结合至癌细胞上或癌细胞内，但是没有明显地结合至 正常细胞。因此，结合蛋白可以用于癌症诊断。因此，本申请包括诊断方法、试剂和试剂盒，其本身可以使用，或者在治疗方法之 前、之中或者之后使用以确定是否存在癌细胞在一个实施方案中，本申请提供检测或监测受试者中癌症的方法，包括步骤(1)将来自所述受试者的测试样品与本申请的特异性结合至癌细上抗原的结合蛋 白或免疫偶联物接触，以产生结合蛋白_抗原复合物；(2)测量测试样品中结合蛋白_抗原复合物的量；和(3)比较测试样品和对照中结合蛋白_抗原复合物的量。在一个实施方案中，抗原是IkBP蛋白，如IkBP l、IkBi32和/或癌相关的IkBii 变体。本申请还包括用于诊断癌症的试剂盒，包含任何一种本申请的结合蛋白或免疫偶 联物和用于诊断癌症的使用说明书。试剂盒还可包括辅助试剂。例如，试剂盒可以包括额 外的试剂，例如直接或间接检测本申请的结合蛋白或免疫偶联物的试剂；用于储存或运输 结合蛋白或免疫偶联物的容器；阳性和/或阴性对照或参照标准；和/或其他缓冲液或稳 定剂。对于在诊断应用中的使用，结合蛋白、优选抗体或抗体片段可以以可检测标记来 标记，例如不透射线的或者放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I ；荧光化合物(荧 光团)或化学发光化合物(生色团)，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；酶，例如碱性 磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；显像剂；或金属离子。如上所述，将标记附着至 结合蛋白(例如抗体或抗体片段)的方法是本领域已知的。本申请的另一个方面是检测或监测受试者中癌症的方法，包括步骤(1)测量从所述受试者取得的测试样品中本申请的抗体的量；和(2)比较测试样品和对照中本申请的抗体的量。在一个实施方案中，通过例如ELISA测量测试样品中抗体的量来测量抗体的量。 在另一个实施方案中，通过例如RT-PCR测量测试样品中编码本申请的抗体的核酸的表达 水平来测量抗体的量。(H)药物组合物、方法和抗原的用途本申请已经鉴定了在癌细胞表面上递呈，但是在正常细胞上表面没有明显表达的 抗原。因此，该抗原可以用于治疗和预防癌症的治疗中。如上所述，IkB β蛋白，诸如IkB β 1和IkB β 2通常不含饿跨膜结构域，并且不在细胞表面上表达。因此，本发明的抗原抗可以 用做治疗靶来治疗和预防癌症。例如，癌相关的IkBii变体或其部分(诸如胞外结构域) 可以用于引发体内免疫反应。此外，本申请包括使用抗原以检测或监测癌症。⑴药物组合物一个实施方案是药物组合物，包含与适宜稀释剂或载体混合的、有效量的本申请 的抗原。另一个实施方案是药物组合物，包含与适宜稀释剂或载体混合的、有效量的分离的 核酸，所述分离的核酸编码本申请的抗原。本申请的进一步的方面是药物组合物，包含与适 宜稀释剂或载体混合的、有效量的重组表达载体，所述重组表达载体包含编码本申请的抗 原的核酸序列。在一个实施方案中，本申请的抗原是癌相关的IkBii变体。例如，本申请的药物组合物可以用于治疗或预防癌症。此外，药物组合物可以用于 引发受试者针对在细胞表面表达本申请的抗原的癌细胞的免疫反应。药物组合物可以如上制备和施用。药物组合物可以用于与如上所述的其它抗癌症 治疗剂联使用。如果免疫试剂(即本申请的抗原或其变体、和/或其编码核酸序列、和/或重组表 达载体的试剂)和/或组合物与佐剂共同免疫，而不管施用形式如何，可以显著改善免疫原 性。通常，佐剂作为0.05%至1.0%的磷酸缓冲盐水溶液使用。佐剂增强免疫原的免疫原 性，但是本身不必然是免疫原性的。佐剂可通过将免疫原保留在施用部位的局部附近而发 挥作用，以产生储存效应，利于免疫原向免疫系统的细胞缓慢持续释放。佐剂也可以将免疫 系统的细胞吸引至免疫原库，并且刺激此类细胞以引起免疫反应。由此，实施方案包括还包 含佐剂的药物组合物。多年来已经使用佐剂改善宿主对例如疫苗的免疫反应。内部佐剂(例如脂多糖 类)正常情况下是用作疫苗的灭活或减毒细菌的成分。外部佐剂是免疫调节剂，其有代表 性地非共价连接至抗原并且被配制为增强宿主免疫反应。因此，已经鉴定了增强对胃肠外 递送的抗原的免疫反应的佐剂。然而，这些佐剂中的一些是毒性的，并且会产生不良副作 用，使得它们不适宜在人和多种动物中使用。实际上，只有氢氧化铝和磷酸铝(通称明矾) 是常规用作人疫苗和兽疫苗中的佐剂。已经良好确立了明矾在增强对白喉毒素和破伤风毒 素的抗体反应中的有效性。尽管如此，它确实具有局限性。例如，明矾对于流感疫苗接种是 无效的，并且与其它免疫原引起的细胞介导的免疫反应不一致。由使用明矾作为佐剂的抗 原在小鼠中引出的抗体主要是IgGl同种型，其对于由一些疫苗试剂提供的保护而言不是 最佳的。广泛的外部佐剂可刺激针对免疫原的有效免疫反应。这些佐剂包括与膜蛋白抗原 复合的皂苷类(免疫刺激复合物)、带有矿物油的普卢兰尼克聚合物、灭活的分枝杆菌和矿 物油、弗氏完全佐剂、细菌产物如胞壁酰基二肽(MDP)和脂多糖(LPS)、以及脂质Α、和脂质 体。在本申请的一个方面中，在任何本文所述实施方案中可用的佐剂如下。对于肠 胃外免疫的佐剂包括铝化合物(例如氢氧化铝、磷酸铝和羟基磷酸铝(aluminum hydroxy phosphate))0根据标准方法，抗原可以与铝化合物沉淀或者被吸附至铝化合物上。其他佐 剂例如RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT)也可以在肠胃外施用中使用。对于黏膜免疫的佐剂包括细菌毒素(例如霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热肠毒
33素(LT)、艰难梭菌毒素A和百日咳毒素(PT)、或其组合、亚基、类毒素或突变体)。例如， 天然霍乱毒素亚基B(CTB)的纯化制剂是可以使用的。这些毒素中任何毒素的片段、同 系物、衍生物和融合物也是适宜的，只要它们保留了佐剂活性即可。优选地，使用具有降 低毒性的突变体。适宜突变体已经描述(例如在WO 95/17211 (Arg-7-Lys CT突变体)、 W09606627(Arg-192-Gly LT 突变体)、和 WO 95/34323 (Arg-9-Lys 和 Glu-129-Gly PT 突变 体)中)。可以在本申请的方法和组合物中使用的另外的LT突变体包括例如Ser-63-Lys、 Ala-69-Gly、Glu-l IO-Asp和Glu-112-Asp突变体。其它佐剂(例如多种来源(如大肠杆菌、 明尼苏达沙氏杆菌(Salmonella minnesota)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium) 或福氏志贺菌(Shigella fIexneri))的细菌单磷酰脂A(MPLA)、皂苷类、或聚交酯乙交酯 共聚物PLGA)微球)也可以用于粘膜施用中。对于黏膜免疫和肠胃外免疫两者有用的佐剂包括聚磷腈(例如W09502415)、 DC-chol (3b-(N-(N' , N' - 二甲氨基甲烷)_氨甲酰基)胆固醇)(例如美国专利号 5，283，185 和 W 96/14831)和 QS-21 (例如，W08809336)。可以通过本领域技术人员已知的任何常规途径用药物组合物免疫受试者，所述药 物组合物包含本申请的抗原、编码其的分离的核酸序列和/或重组表达载体。这可以包括， 例如经过黏膜(例如眼睛的、鼻内的、口腔的、胃的、肺的、肠的、直肠的、阴道的或泌尿道 的)表面的免疫、经过肠胃外(例如皮下、真皮内、肌内、静脉内或腹膜内)途径的免疫或者 结节内免疫。优选的途径依赖于所选择的免疫原，并且这对于本领域技述人员是显而易见 的。施用可以以单一剂量或者定期重复来实施。合适的剂量依赖于技术人员能理解的多种 参数，例如免疫原本身(即是肽还是核酸(并且更加具体而言是其类型))、施用途径和待免 疫的动物的状况(体重、年龄等等)。本申请还提供试剂盒，包含有效量的本申请的抗原，任选地一种或一种以上其它 癌症治疗剂组合，以及其使用说明书。试剂盒还可以包含辅助试剂。例如，试剂盒可以包括 用于向受试者注射本申请的抗原的器械，例如注射器；用于储存或运输本申请的抗原的容 器；佐剂；和/或可药用赋形剂、载体、缓冲液或稳定剂。在一个实施方案中，本申请的抗原 是癌相关的IkBii变体。(ii)治疗方法如上面所提到，本申请的抗原存在于癌细胞上，但是不明显存在于正常细胞上。因 此，本申请的抗原或其部分(诸如胞外结构域)可以用于预防或治疗癌症的治疗方法中。此 外，本申请的抗原或其部分(诸如胞外结构域)可以用于引起受试者例如疫苗免疫反应。—个实施方案是本申请的抗原在制造治疗或预防癌症的药物中的用途。另一个实 施方案是抗原在制造引起受试者中免疫反应的药物中的用途。本申请还包括编码本申请的抗原的分离的核酸序列在制造治疗或预防癌症的药 物中的用途。此外，本申请包括编码抗原的分离的核酸序列在制造引起受试者中免疫反应 的药物中的用途。进一步的实施方案是重组表达载体在制造治疗或预防癌症的药物中的用途，所述 重组表达载体包含编码本申请的抗原的分离的核酸序列。同样，本申请包括重组表达载体 在制造引起受试者中免疫反应的药物中的用途，所述重组表达载体包含编码本申请的抗原 的分离的核酸序列。
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另外的实施方案是治疗或预防患有或者怀疑患有癌症的受试者中癌症的方法，包 括向所述受试者施用有效量的本申请的抗原。此外，本申请包括治疗或预防患有或怀疑患 有癌症的受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的分离的核酸序列，所述分 离的核酸序列编码本申请的抗原。此外，本申请包括治疗或预防患有或者怀疑患有癌症的 受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用有效量的重组表达载体，所述重组表达载体 包含编码本申请的抗原的分离的核酸序列。另一个实施方案是诱导受试者中针对癌症的免疫反应的方法，包括向所述受试者 施用有效量的本申请的抗原。此外，本申请包括诱导受试者中针对癌症的免疫反应的方法， 包括向所述受试者施用有效量的分离的核酸序列，所述分离的核酸序列编码本申请的抗 原。此外，本申请包括诱导受试者中针对癌症的免疫反应的方法，包括向受试者施用有效量 的重组表达载体，所述重组表达载体包含编码本申请的抗原的分离的核酸序列。在一个实施方案中，本申请的抗原是癌相关的IkBii变体。(iii)诊断方法本申请的抗原表达癌细胞上，并且没有明显地表达于正常细胞上，因此对本申请 的细胞表面上抗原的检测可以用作癌症的诊断方法。另外，对癌相关的IkBii变体的RNA 的检测可以用作癌症的诊断方法。一个实施方案是检测或监测受试者中癌症的方法，包括检测样品中细胞上的本申 请的抗原，其中如果在细胞上检测到本申请的抗原，则表明具有癌症。多种技术可以用于检测细胞上的本申请的抗原。例如，本申请的结合蛋白可以用 于免疫测定中以检测本申请的抗原的细胞表面表达。本领域技术人员会意识到，多种技 术可以用于检测和/或定量抗原的细胞表面表达，包括Western印迹、免疫沉淀接着进行 SDS-PAGE、免疫细胞化学、FACS、蛋白质阵列等。本申请一个方面是检测或监测受试者中癌症的方法，包括检测样品中细胞的本申 请的癌相关的IkBii变体的表达，其中如果在细胞内检测到癌相关的IkBii变体的表达，则 表明具有癌症。在一个实例中，编码本申请的癌相关的IkBii变体的RNA表达产物用于检 测细胞内癌相关的IkBii变体的表达。本领域技术人员会意识到，可以通过检测编码癌相 关的IkB β变体的mRNA、或者特异性和/或选择性杂交至编码癌相关的IkB β变体的mRNA 的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR产物、合成DNA、合成RNA或者天然存在的或修饰的核苷酸 的其它组合来检测或定量RNA表达产物。多种方法可以用于检测和/或定量细胞内癌相关的IkBii变体的RNA表达，包括 RT-PCR、核酸酶保护试验如核糖核酸酶保护试验和Sl核酸酶试验、和Northern印迹等。在分离编码本申请的抗原的mRNA和/或癌相关的IkB β变体的mRNA后也可以使 用本领域已知的方法检测基因组突变。在一个实施方案中，癌相关的IkB β变体是IkB β 2变体。(I)其它方法IkB β是NFk-B的抑制调节剂。由此，IkB β在调节细胞生长、凋亡和炎性反应中 发挥重要的作用。通常在细胞表面不存在IkB β。通常非磷酸化的IkBii结合到细胞质中 的NFk-B中，并阻止NFk-B进入细胞核中。相反，癌相关的IkBii变体具有至少一个跨膜结 构域并且存在于癌细胞的表面上。因此，不限于理论，所述癌症相关的IkBii变体能够破坏
35癌细胞中IkBii中的正常作用。由此，本申请包括通过调节癌细胞中癌相关的IkBii变体 的活性或恢复或取代癌细胞中IkBii活性来治疗和预防受试者癌症的方法。在本申请的一个实施方案中，治疗或预防受试者中癌症的方法包括预防或降低癌 相关的IkBii变体的表达或功能或修复或代替癌细胞中IkBii的正常功能。可以使用标准技术来预防或降低细胞中癌相关的IkBii变体的表达，包括使用对 癌相关的IkBii基因变体的转录物反应的反义分子、三螺旋分子或核酶分子。例如，标准技术可以用于产生反义核酸分子，S卩，与编码目的多肽的有义核酸互补 的分子，例如与双链cDNA分子的编码链互补的分子，或与mRNA序列互补的分子。因此，反 义核酸分子能够氢键合到有义核酸。反义核酸能够互补于整个编码链或其部分，例如，全部 或部分的蛋白编码区(或开放阅读框)。反义核酸分子能够反义于编码目的多肽的核苷酸 序列的编码链的全部或部分非编码区。非编码区(“5’和3’非翻译区”)是编码区两侧的 5’和3’序列，并且不翻译为氨基酸。反义寡核苷酸可以是例如长约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸或以
上。本申请的反文核酸可以使用化学合成和酶连接反应通过本领域已知的过程构建军。例 如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学 合成，所述修饰的核苷酸设计为增加分子的生物稳定性或增加反义核酸分子与有义核酸分 子之间形成的双链的物理稳定性，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸可以使用。 能够用于产生反义核酸的修饰的核苷酸的实例包括5氟尿嘧啶、5溴尿嘧啶、5氯尿嘧啶、5 碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4乙酰基胞嘧啶、5(羧羟甲基)嘧啶、5羧甲基氨甲基2硫尿 苷、5羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β D乳糖基核苷、N6异戊烯基腺嘌呤、1甲基鸟嘌 呤、1甲基肌苷、2，2 二甲基鸟嘌呤、2甲基腺嘌呤、2甲基鸟嘌呤、3甲基胞嘧啶、5甲基胞嘧 啶、Ν6腺嘌呤、7甲基鸟嘌呤、5甲基氨甲基尿嘧啶、5甲氧基氨甲基2硫尿嘧啶、β D甘露糖 基核苷、5’甲氧羧甲基尿嘧啶、5甲氧基尿嘧啶、2甲基硫Ν6异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶5氧乙 酸(ν)、Wybut0X0Sine、假尿嘧啶、核苷、2硫胞嘧啶、5甲基2硫尿嘧啶、2硫尿嘧啶、4硫尿嘧 啶、5甲基尿嘧啶、尿嘧啶5氧乙酸甲酯、尿嘧啶5氧乙酸(ν)、5甲基2硫尿嘧啶、3 (3氨基 3N 2羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W和2，6 二氨基嘌呤。可替代的，反义核酸可以用表达载体生 物学产生，其中核酸已经以反义方向被亚克隆到表达载体中(即，从插入的核酸转录的RNA 与目的靶核酸反义取向)。施用至受试者的或原位产生的反义核酸分子以便它们杂交至或结合至编码目的 多肽的细胞mRNA，由此抑制例如通过抑制转录和/或翻译来抑制表达。杂交可以通过常规 的核苷酸互补形成稳定的双链体，或为例如在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下经 双链体大沟中的特异的相互作用。本申请的反义核酸分子的施用途径包括直接注射在组织 部位。替代地，反义核酸分子可以被修饰成靶向作用选择的细胞并接着全身施用。例如，对 于全身施用，反义核酸分子可以被修饰，以便它们例如通过将反义核酸分子连接到结合细 胞表面受体或抗原的肽或抗体，特异性地结合到在选择的细胞上例如T细胞或脑细胞上表 达的受体或抗原。如下所述，用载体例如基因治疗载体反义核酸分子也可以被递送到细胞 中。为了达到足够胞内浓度的反义分子，其中反义核酸分子位于强polll或polIII启动子 控制下的载体构建物是优选的。目的反义核酸分子可以是α端基异构核酸分子。α端基异构核酸分子与互补RNA形成双链杂合体，其中与通常的单元不同，所述双链走向互相平行(Gaultier等，1987， Nucleic Acids Res. 15 :66256641)。所述反义核酸分子也可以包含2，-ο-甲基核糖核苷 酸(Inoue 等，1987，Nucleic Acids Res. 15 61316148)或嵌合的 RNADNA 类似物(Inoue 等 1987，FEBS Lett. 215 327330)。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其能够裂解单链核酸，如mRNA，在 mRNA上他们具有互补区，并且也可以用标准技术生。由此，核酶(例如锤头核酶(描述 于 Haselhoff 和 Gerlach，1988，Nature 334:585591))也可以用于催化性裂解 mRNA 转录 物由此抑制mRNA编码的蛋白的翻译。对编码目的多肽的核酸分子特异性的核酶可以基 于编码癌相关的IkBii变体的cDNA核苷酸序列设计。例如，在Cech等人的U. S. Patent No. 4，987，071 和 Cech 等人 U. S. Patent No. 5，116，742 中，可以构建四膜虫 L 19IVS RNA 的 衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与被降解的核苷酸序列互补。可替代地，编码目的多肽 的mRNA可以用于从RNA分子库中选择具有特异性的核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如见 Bartel 和 Szostak，1993，Science 261:1411 1418。三螺旋结构也可以用公知的技术产生。例如，目的多肽的表达可以通过靶向作 用与编码多肽的基因调节区(例如，启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成阻 止靶细胞中基因转录的三螺旋结构加以抑制。一般见Helene，1991，Anticancer Drug Des.6 (6) 56984 ；Helene,1992，Ann.N. Y Acad. Sci. 66027 36 禾口 Maher，1992，Bioassays 14(12) 807 15。在许多实施方案中，核酸组分可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰以改 进例如分子的稳定性、杂交或分子的溶解性、例如，核酸的脱氧核糖磷酸骨架可以被修饰以 产生肽核酸(见 Hyrup 等，1996，Bioorganic & MedicinalChemistry 4(1) :523)。如本文 所用，术语“肽核酸’或“PNAs，，指核酸模拟物，例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被 假肽骨架取代并且只保留四种天然的核碱基。已经显示中性PNAs骨架在低离子强度下实 现与DNA和RNA的特异性杂交。可以用标准的固相肽合成方案，如如上述的Hyrup等1996、 PerryO' Keefe 等 1996，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 14670675 所述开展 PNA 寡聚体的合 成。PNAs可以例如被修饰，通过将亲脂基团或其他辅助基团结合到PNA、通过形成PNA DNA嵌合体或通过使用脂质体或其他的本领域已知的药物递送技术例如增强它们的稳定性 或细胞摄取。例如，可以产生可结合PNA和DNA优良特性的PNA DNA嵌合体。这样的嵌合 体使得DNA识别酶例如RNAse H和DNA聚合酶与DNA部分相互作用，而PNA部分将提供高 的结合亲合力和特异性。用基于碱基堆积、核碱基之间的键的个数和取向选择的适当长度 的接合体可以连接PNA DNA嵌合体(Hyrup，1996，见上)。PNA DNA嵌合体的合成可以在如 Hyrup，1996，如上和 Finn 等 1996，Nucleic Acids Res. 24(17) :335763 所述开展。例如， 可以在支持物上用标准的亚磷酰胺偶联化学和修饰的核苷类似物合成DNA链。化合物如 5’(4甲氧基三苯甲基)氨基5’脱氧胸苷亚磷酰胺可以用作PNA和DNA 5’端之间的接头 (Mag等，1989，Nucleic Acids Res. 17 5973 88)。接着以分步的方式偶联PNA单体以产 生含有 5，PNA 片段和 3，DNA 片段的嵌合分子(Finn 等 1996，Nucleic Acids Res. 24(17) 3357 63)。可替代地，嵌合分子可以用5，DNA片段和3，PNA片段合成(Peterser等1975， Bioorganic Med. Chem. Lett. 5 1119 11124)。
在其他的实施方案中，寡核苷酸可以包括其他附加的基团例如肽(例如用于体 内靶向作用宿主细胞受体)或促进通过细胞膜运输的试剂(见，例如Letsinger等1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553 6556 ；Lemaitre 等 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648 652 ;International Publication No. W088/09810)或促进通过血脑屏障运输的试 剂(见，例如International Publication No. W089/10134)。另外，寡核苷酸可以用杂交 引起的裂解剂修饰(见，例如Krol等人1988，Bio/Techniques 6 =958976)或插入剂修饰 (见，例如Zon, 1988, Pharm. Res. 5 539549)。为了达到该目的，寡核苷酸可以缀合到另一个 分子上，例如肽、杂交触发的交联剂、转运剂、杂交触发的裂解剂等。本申请的另一个方面是治疗或预防受试者中癌症的方法，其包括修复或代替 IkB^的表达或功能。在一个实施方案中，这与治疗或预防受试者中癌症的方法联合进行， 其包括阻止或减少癌相关的变体IkB β的表达或功能。本发明的另一个方面是鉴定能够调节癌相关的IkBii变体的表达或活性的化合 物的方法，其可以用于预防或治疗癌症。在本发明的一个实施方案中，用于鉴定化合物预防 或治癌症的能力的方法包括步骤(a)将表达癌相关的IkBii变体的细胞与测试化合物接触；和(b)测定癌相关的IkB β变体的表达或功能；和(c)比较癌相关的IkBii变体与对照的表达或功能，其中癌相关的IkBii变体与对 照相比表达或功能的减少指示了化合物可以用于预防或治疗癌症。本发明的另一个方面是重组表达形式的本申请的抗原和/或相似修饰的其它IkB 蛋白或其片段或相应的核酸序列的制备，用于检测跨膜形式的IkB蛋白和/或本申请的抗 原的存在。所述检测可以包括检测蛋白、编码本申请的修饰的IkB蛋白或基本申请的抗原 的基因和/或mRNA。所述重组形式可以用于制备抗体或检测患者或受试者循环中的存在的 抗体。上面的公开一般性地描述了本发明。通过参照下面的具体实施例可以得到更加完 全的理解。这些实施例仅以例证的目的描述并且不旨在限制本发明的范围。当环境暗示或 出现应急情况时考虑了形式改变和等效替代物。虽然在本文中已经采用了特定术语，但是 此类术语旨在是描述意义的，而不是限制的目的。下列非限定性实施例用于说明本发明。实施例实施例1 :VB1_204单克隆抗体的产生和测序VB1-204是一种IgM MAb，其从乳腺癌患者的淋巴结产生。信使RNA从杂交瘤细胞分离并且使用逆转录酶合成第一链互补DNA(cDNA)。然后 cDNA用于通过PCR分离重链和轻链抗体片段。V1^n λ的共有序列框架区的PCR引物分别 用于扩增重链和轻链。5，VH 弓丨物1 5，CCA GCC ATG GCG CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT G(SEQID NO 12)2 5’ CCAGCC ATG GCG SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG(SEQID NO 13)3 5’ CCAGCC ATG GCG CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG(SEQID NO 14)4 5，CCA GCC ATG GCG SAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG(SEQ ID NO 15)
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5 CCA GCC ATG GCG GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG(SEQID NO 16)
65，CCAGCCATG GCG CAG GTG CAG CTACAGCAG TGG GG(SEQ ID NO 17)
75，CCAGCCATG GCG CAG STG CAG CTGCAGGAG TCS GG (SEQ ID NO 18)
85，CCAGCCATG GCG CAG GAR GTG CAGCTGGTG CAG TCT GG (SEQ ID 19)
95，CCAGCCATG GCG CAG CAG GTA CAGCTGCAG CAG TCA GG(SEQ ID NO 20)
3，引物
15’ CCAGGAGAA AGT GAT GGA GTC GGGAAGGAA GTC CTGTGC GAG(SEQ ID NO 21)
25’ CGACGGGGA ATT CTC ACA GGA GACGAGGGG GAA AAGGGT TGG(SEQ ID NO 22)
λ引物
5，引物
15’ ATGGCCTGS WCY CCT CTC YTC CTCAYC(SEQ ID NO 23)
25’ ATGGCCTGG GCT CTS YTB YTS YTCASC (SEQ ID NO 24)
35’ ATGGCMTGG AYC SYT CTC YTC CTCGGC(SEQ ID NO 25)
3，引物
5，CAC TAG TGT GGC CTT GTT GGC TTG GAC CTC CTC AGA GGAGGG(SEQ ID NO 26)
注释为了分离链，对于某些共有序列，5’引物混合物使用混合的碱基R = A+G，
S = C+G, W = A+T, Y = C+T, D = A+T, H = A+C, K = T+G, B = T+C+G, M = A+C。PCR反应包括50 μ L反应体积，其包含10XPCR 缓冲液5 μ L2mM dNTP5 μ L引物 5，20pmol引物 3，20pmolTaq DNA 聚合酶2. 5UDNA 模板50ngPCR循环条件是94°C下1分钟，62 °C下1分钟，72 °C下1分钟，30个循环，并且最 后在72°C延伸10分钟。采用两轮30个循环并且在第一轮30个循环采用以下引物5’ VH 引物和3’引物-1.。接着用5’ VH引物和3’引物_2将IyL的第一轮PCR反应产物再扩
+飽
+曰ο扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳分离。切下目的条带并使用Qiaquick凝 胶提取试剂盒纯化、克隆入TOPO PCR 2. 1克隆载体中，然后使用373DNA测序仪测序。序列 分析表明，重链和轻链的亚类分别是VH3(图1A)和VL3(图1B)。轻链和重链可变区显示在 图 1 (SEQ ID NO 1-4)中。VB1-204 的 CDR 序列显示在表 1 中(SEQ ID NO :5_10)。实施例2 通过测量肿瘤细胞反应性抗体表征通过流式细胞术测试VB1-204对代表7种不同类型的上皮癌的反应性(图2)并 将结果总结于表2中。MF值表示两个实验中相对于对照抗体的中位荧光的平均增加倍数。 值零表明相对于对照抗体没有反应性。结合最强的是CF-Pac-I和MB-231细胞，其后紧跟 着A-375。因此，VB1-204结合到局限于肿瘤细胞的膜的抗原上。
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实施例3 通过比较肿瘤对正常组织微阵列来分析抗体性质检测VB1-204并与在正常关键组织的低密度(LD)阵列上的同种型对照(IgM骨髓 瘤)比较(表3A)。正常关键组织的膜染色被认为是最少的，在肺组织、结肠细织和肝组织 的膜有一些染色。发现在所有检测的正常关键组织的细胞质中存在显著的染色，这表明与 存在于正常细胞中的胞内蛋白发生了结合。接着在高密度(HD)福尔马林固定的肿瘤组织微阵列中检测VB1-204的反应性 (表3B)。与正常组织不同，在肝、结肠、肺、胰腺和肾膜上检测到VB1-204的反应性。在结肠 上每组织样品的膜染色频率是最高的。在肝、结肠、肾、胰腺和肺上检测到膜染色，发生率、 强度和阳性细胞的百分比不同。实施例4通过共焦显微镜术评定VB1-204的内化VB1-204和对照抗体95E9，已知为细胞内的内化抗体)被用于评定VB1-204的内 化。为了确定细胞表面结合的VB1-204是否内化，使用了借助于激光扫描共焦显微镜术的 荧光分布和胞内染色的直接显影。A-375细胞与VBl-204(100yg/mL)或对照抗体在4°C温 育。在细胞冲洗后一半抗体在37°C温育1小时，另一半维持在4°C。用荧光素标记的第二 抗体标记固定的(用甲醛溶液)和未固定的细胞。如5E9阳性对照抗体所示，与VB1-204 在4°C温育60分钟的A-375细胞显示了荧光标记的周向分布(图3A)。将VB1-204处理的 细胞加热到37°C在60分钟内显示胞内染色图案，如图3B所示，这表明了 VB1-204/抗原复 合物的内化。实施例5 :VBl-204的结合亲合力使用流式细胞术来评定VB1-204的结合亲合力，针对固定数目的肿瘤细胞 (A-375)对一系列的抗体浓度检测了 2小时，获得饱和曲线。使用Sigma PlotQandel Scientific, San Rafael, CA)生成值和图像分析结果。将测定的中位荧光的倒数绘制为抗 体浓度的倒数的函数曲线以通过Lineweaver-Burk方法确定KD。产生了直线并且从曲线 斜率计算Kd (图4A和4B)。通过以下公式确定解离常数和Kd :1/F = 1/Fmax+(KD/Fmax) (1/ IgM)，其中F =背景减去中位荧光，Fmax从曲线计算。如图4A和4B所示，计算的VB1-204 的解离常数为5xl(T9M。实施例6 抗原的分离和鉴定肿瘤细胞系Α375 (黑素瘤)、H印G2 (肝细胞癌)、MB 231 (乳腺癌)CF-PAC-I和 PANC-I (胰腺癌)和DU-145 (前列腺癌)被用于鉴定结合VB1-204的膜相关的抗原。这些 细胞系通过流式细胞术基于肿瘤细胞特性进行选择。细胞系购自ATCC和按照ATCC的指南培养。结合VB1-204的抗原的初步表征VB1-204被用于免疫沉淀来自肿瘤细胞系的膜提取物的蛋白。接着在SDS-PAGE 凝胶上分离纯化的蛋白，随后用VB1-204进行western印迹。在ID-PAGE上检测到一条 65士2kDa的带以及一条 34kDa的带。在用2% SDS在65°C还原纯化的蛋白60分钟后， 所有的带被破坏成在所有反应细胞系始终可见的单条强的 34KDa带。这些实验数据将 VB1-204抗原归类为“可印迹的”含有N-聚糖掩蔽的表位的抗原。如在图5A和5B中所示， 在所有的阳性细胞系中观察到强 34kDa。带的强度也反应了在该特定细胞系中抗原表达 水平。
质谱分析和蛋白鉴定来自阳性细胞系CFPAC-I膜组分以及阴性细胞系Panc-I膜的蛋白用VB1-204免 疫沉淀并在ProteomeLab PF-2D系统上分离。在阳性细胞系中观察到在10. 85分钟洗脱 的单峰而在阴性细胞系中不存在该峰，如图6所示。MS分析的组合结果将在肿瘤细胞系CFPAC-I、A375和MB231上的VB1-204的抗原 鉴定为IkBii 2的变体形式。最初从这些细胞系收集的、与数据库序列100%匹配的肽在图 7A、7B和7C中显示以基于最高概率的得分定位到其蛋白的位置上，并包括在表4中(SEQ ID NO 31-52) ο 例如，针对 IkB^ 2 (SEQ ID NO 27)、IkB β 1 (SEQ ID NO 28)和 IkB^ 2 β 概念 变体(conceptual variant) (SEQ ID NO 29)绘制图谱，显示具有最高的蛋白得分并显示了 最相关的鉴定。所有从全部细胞系收集的、或在最初MS分析或随后的片段化中获得肽以及 被鉴定为变体肽的肽(下述)被组合并在图8中将它们相应的定位到IkB β 2变体中(SEQ ID NO 30)，列在表 4 中(SEQ ID NO :31_52)。肽1985. 978172 和 1070. 468308 的 MS 片段化从头序列鉴定导致鉴定了变体肽以及那些100%定位到序列的肽。安装在纳米 源上的分离的纳米喷雾头用于此目的。碰撞能为48V，帘气和CAD气分别保持为25和6， 并且将样品循环1.667分钟(100周期)来实现稳定的离子片段化。对所述肽中的两个 进行MS/MS片段化(1985. 978172和1070. 468308)产生了图9A和9B中所示的片段离 子。来自肽分子量1985. 978172的肽LGVLAAAVGGVGLGAffL(SEQ ID NO 34)和来自肽分 子量1070. 468308的肽ILGVTSTVVAL (SEQ ID NO 37)显示与IkB β 2的两侧序列具有 100%的同源性，但与中间序列没有这样的同源性，这表明了鉴定了新的序列。所述序列 包括8个氨基酸的改变，导致形成了两个特有的疏水跨膜结构域的可变区。这些区大约 为 LGSLGVLAAAVGGVGLGAWLGPG (SEQ ID NO 53)和 LAAILGVTSTWALYAAGAGLCV (SEQ ID NO: 54)。跨膜结构域的确切跨度随所用的蛋白质结构建模算法而少许不同。疏水可变结构域 M IkB β 的野生型区隔开。一个肽(1205. 378172 来自(402. 800000,3+) (SEQ ID NO 35)) 的MS/MS片段化产生了如图9C所示的另外的碎片离子，其显示与IkBii 2具有100%的同源 性。实施例7 来自癌细胞提取物的IkB β 2免疫沉淀VB1-204被用于免疫沉淀来自肿瘤细胞系CFPAC-I的纯化膜的和全细胞的提取物 的蛋白。接着在SDS-PAGE凝胶上分离纯化的蛋白质。分离的蛋白质通过Western印迹用 VB1-204和用可商业途径获得的识别IkBiil和IkBii 2同种型的抗体分析。商业抗体抗覆 盖的氨基酸56-145 (Abnova，H00004793-M01)的重组肽序列。该区在癌相关的IkB β 2 变体中含有3个氨基酸改变(位于106、111和112位)并也含有推定的所述变体的胞外部 分(大约在氨基酸38与102之间)。图10显示VB1-204结合到存在于全细胞裂解物和膜 部分中的蛋白质，而商业抗体只结合到全细胞裂解物蛋白。所有的条带都具有相同的MW。 数据表明VB1-204也检测位于细胞内以及膜形式的野生型IkBii，但是商业抗体只检测胞 内野生型并且其与癌相关的变体的结合被免疫肽中的氨基酸改变阻止。实施例8衍生自VB1-204的免疫毒素的细胞毒性VB1-204的可变区被用于构建用于治疗癌症的免疫偶联物。改良形式的植物毒素 bouganin融合到Fab形式的VB1-204上。
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VB6-204 构建通过产生EcoRI-PelB-VH204_ApaI 和 AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI 片段，将 它们插入 EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/pING3302 质粒构建 VB6-204 构建物。 构建的片段被直接克隆到pING3302Xoma载体上处于阿拉伯糖诱导的araBAD启动子控制 下。在经L-(+)阿拉伯糖诱导后，紧邻目的基因的PelB前导序列的存在使得蛋白分泌到培 养基上清液中。置于结构域的N端的组氨酸亲和标签使得能够利用Ni2+螯合俘获方 法进行纯化。通过剪接重叠延伸聚合酶链式反以PelB和VB1_204_VHDNA质粒为模板以及下列 引物组装 EcoRI-PelB-VH204-ApaI 片段1)5，PelB :5，GAA TTC CCT GCA GGT CTA TGG AAC GAT AAA TGC (SEQ ID NO 56)2)3，PelB-VH204 :5，CGC CAT CGC TGG TTG GGC AGC GAG TAA TAACAA TCC(SEQ ID NO 57)3)5，PelB-VH204 5' GCT GCC CAA CCA GCG ATG GCG GAG GTG CAGCTG GTG GAG TCT GGG(SEQ ID NO 58)4)3，VH204-ApaI :5，GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGAGAC GGT GAC CAG GGT(SEQ ID NO 59)用上述的全部4条引物进行两步剪接重叠延伸PCR方法来构建和扩增 EcoRI-PelB-VH204-ApaI。加入EcoRI和ApaI限制位点(黑体)来帮助将PelB_VH204克隆 到 EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302 载体上。PCR 反应包括含有以下的 50 μ L 反应体积IOX PCR缓冲液5 μ L
2mM dNTPs5 μ L
50mM MgCl22μ L
引物5’20pmol
引物3’20pmol
Taq DNA聚合酶2. 5U
DNA模板50ngPCR循环条件为94°C lmin，62°C Imin和72 °C 1. 5min，总共20个循环，最后在 72°C延伸 IOmin0步骤1第一个PCR反应包含引物1和2，以及PelB模板。产生在5’端为含有EcoRI限制 位点的PelB区以及在3，端为PelB前导信号的片段(131bp)。在分开的另一个PCR反应中，用引物3和4与204VH模板产生乂』。*片段(438bp)， 其5’端一侧为PelB前导信号和Vh结构域的起点和3’端一侧为含有ApaI位点的Ch结构 域的21核苷酸。步骤2在接下来的PCR反应中，用引物1和4以及1 μ L的各PCR产物来产生 EcoRI-PelB-VH204-ApaI 片段(548bp)。
通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应方法使用VB1-204轻链DNA质粒作为模板和以 下引物组装 AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI 片段1)5，De-boug-AflII 5' ATC CTT AAG TTT AAA AGC TCC AAA TAGTGA TCT AGA GTC GAC (SEQ ID NO 60)2)3，PelB-6xHis :5，GTG ATG GTG ATG GTG ATG CGC CAT CGC TGG(SEQ ID NO 61)3)5' 6xHis-VL-204 5' ATG GCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC TCC TATGAG CTG ACT CAG CCA CCC (SEQ ID NO 62)4) 3'Vl-Cl:5，GAC CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TAG GACGGT CAG CTT GGT CCC(SEQ ID NO 63)5)5，入恒定区5，CAG CCC AAG GCT GCC CCC TCG GTC ACT CTGTTC(SEQ ID NO 64)6)3，端-XhoI 入恒定区 5，CTC GAG TCA CTA TGA ACA TTC TGT AGGGGC CAC TGT(SEQ ID NO 65)用以上列出的全部6条引物进行两步剪接重叠延伸PCR方法来构建和扩增 AflII-PelB-6xHis-VL204-CLXhoL· 加 Λ AflII 和 XhoI 限制位点(加黑)来帮助将 AflII-PelB-6xHis-VL204-CL-XhoI 克隆到 EcoRI-Apal-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302 载体上。步骤1在第一个PCR反应中，引物1和2为用于扩增PelB片段(195bp)，该片段在5’端 一侧含有AflII限制位点，在3’端侧含有6xHis标签。在第二个PCR反应中，引物3和4以及VB1-204轻链模板用于扩增6xHis-VL204 片段(379bp)，该片段两侧，在5’端含有6xHis以及在3’端为Q结构域的前21个核苷酸。用引物5和6以及Q模板进行第3个PCR反应，产生了含有3’端XhoI限制位点 的入轻链恒定区(327bp)。步骤2在接下来的PCR循环中，用引物1和6和1 μ L的各PCR产物来产生 AflII-PelB-6xHis-VL204-C^XhoI片段(833bp)。一旦序列得到了证实，将PelB_VH204片段用EcoRI和ApaI限制酶消化并连接到用 同样的酶预先消化的EcoRI-ApaI-CH-de-bouganin-AflII-XhoI/3302载体中。用所述连接 反应物转化IOF感受态细胞并涂板到补充有四环素的LB琼脂板上。通过质粒PelB-VH204 -CH-de-bouganin-Af 111-XhoI/3302的限制图谱证实了插入片段的存在。接着用AflII和 XhoI限制酶消化AflII-PelB-6XHiS-\204-c￡xhoI片段并连接到预先用同样的酶消化的 PelB-VH204-CHde-bouganin-AflII-XhoI/3302 载体上来构建 VB6-204。在证实了存在正确 的插入后，将构建物转化到大肠杆菌E104细胞中进行表达。纯化和检测从6L TB碎片化产 生的VB6-204蛋白。VB6-204免疫偶联物的核苷酸SEQID NO :36)和氨基酸序列(SEQ ID NO 37)显示在图11中。VB6-204蛋白的细胞毒性通过MTS分析来测量VB6-011的细胞毒性。简单地说，接种抗原阳性和抗原阴性的细胞，每孔1000个细胞，并在37°C培养3小时。随后将不同浓度的VB6-204和de_bouganin 加到细胞中，并在5天后检测存活率。经过5天培养后，由于大量的细胞死亡，确定抗原阳 性细胞系的计算的VB6-204的IC50。相反，由于抗原阴性细胞保持活力，所有没有测定细胞 系的IC50。实施例9 癌干细胞分析与aldef luor (ALDHl)染色相关的VB1-204结合用于评价癌干细胞反应性。一般， 具有强ALDH染色的肿瘤细胞代表能够在异种移植物中自我更新并能够产生肿瘤的癌干细 胞部分。高ALDHl活性被认为赋予对化学治疗剂抗性，导致新肿瘤过度生长和患者随后的 复发(Wicha MS, Liu S 和 Dontu G. 2006, CancerRes. 66,1883-1890 ；Ginestier C, Hur MH, Charafe-Jauffret E et al. 2007, CellStem Cell，1，555-567)。2 色流式细胞术被用于测 定结合宫颈细胞系C33A和前列腺细胞系DU-145的ALDHl阳性细胞的VB1-204。结合ALDHl 阳性的C33A和DU-145亚群的VB1-204突出了其对抗癌干细胞系的潜在用途。实验设计简单地说，将2xl05个细胞与aldefluor试剂在37°C培养30分钟。接 着冲洗细胞并在25 μ g/mL的VB1-204存在下在4°C培养2小进。结合到细胞上的VB1-204 用生物素化山羊抗人H&L接着用链霉亲和素Cy5检测。IgM黑素瘤、人IgM anti-Id被用作 阳性对照。另外，在作为反应的抑制剂DEAB的存在下证实了 aldefluor染色的特异性。结果结果显示在图13和14中。数据分析显示2. 98%和4. 2%的C33A和DU-145 细胞对癌干细胞标记aldefluor是阳性的(图13B和14B的右下四分之一图)。VB1-204 结合大部分的C33A(92. 5% )&DU-145(96.8% )细胞，显示为细胞特征变换到图13C和14C 的左上四分之一图。图13D和14D显示在存在VB1-204时ALDHl阳性的C33A细胞(2. 3% ) 和DU-145(5. 0% )也转换到右上四分之一图。这个数据表明VB1-204结合C33A & DU-145 的癌干细胞部分以及表明VB1-204识别的抗原代表了癌干细胞部分。尽管本申请已通过目前被认为优选的实施例进行了描述，但是应当理解，本发明 不限于所公开的实施例。恰恰相反，本发明旨在涵盖处于所附权利要求书精神和范围内的 多种修改和等同排列。本文所有出版物、专利和专利申请以其全文通过引用并入本文，其程度为似乎各 个出版物、专利、专利申请被明确且单个标明其全文通过引用并入本文表1 :VBl-204 的 CDR 序列 表2 通过流式细胞术表征肿瘤细胞反应性的抗体特征
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评分是基于在0-3+尺度评价的，其中0 =无染色和微量的、小于1+但大于0的染 色。级别1+到3+代表染色强度增加，其中3+为最强。表3B :VBl-204的高密度肿瘤组织微阵列染色 得分在0-3+尺度上评价，0 =没有染色和微量的、少于1+但是大于0的染色。1+ 至3+级表示染色强度增加，3+为强的黑棕色染色。头和颈癌包括气管、喉、扁桃体、喉管、软 腭、舌、口和唇的癌症。括号内的值指在所得分范围内染色细胞的最高百分数表4:对应于IKKi3 2(TRIP_9)和变体的肽以及各自的计算的质量
权利要求
分离的互补决定区(CDR)，其选自下组包含SEQ ID NO8的氨基酸序列的分离的轻链CDR 1或其变体；包含SEQ ID NO9的氨基酸序列的分离的轻链CDR 2或其变体；包含SEQ ID NO10的氨基酸序列的分离的轻链CDR 3或其变体；包含SEQ ID NO5的氨基酸序列的分离的重链CDR 1或其变体；包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的分离的重链CDR 2或其变体；和包含SEQ ID NO7的氨基酸序列的分离的重链CDR 3或其变体；
2.编码权利要求1的互补决定区的分离的核酸序列，或其变体。
3.分离的可变区，其选自下组包含SEQ ID NO :8，9和/或10限定的轻链互补决定区的分离的轻链可变区，或其变 体；和包含SEQ ID NO :5，6和/或7限定的重链互补决定区的分离的重链可变区，或其变体。
4.权利要求3的可变区，其中所述轻链可变区包含SEQID NO :4的氨基酸序列，或其 变体。
5.权利要求3的可变区，其中所述分离的重链可变区包含SEQIDNO :2的氨基酸序列， 或其变体。
6.编码权利要求3-5任一项的可变区的分离的核酸序列，或其变体。
7.根据权利要求6的分离的核酸序列，其包含SEQID NO 3的序列。
8.根据权利要求6的分离的核酸序列，其包含SEQID NO 1的序列。
9.结合蛋白，其包含SEQID N0:8，9和/或10限定的轻链互补决定区，或其变体。
10.结合蛋白，其包含SEQID NO :5，6和/或7限定的重链互补决定区，或其变体。
11.结合蛋白，其包含包括由SEQID NO :8，9和/或10限定的氨基酸序列的轻链互补 决定区和/或包括由SEQ ID NO :5，6和/或7限定的氨基酸序列的重链互补决定区，或其 变体。
12.权利要求9-11任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白结合包含SEQIDNO 28, SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 36 或 SEQ ID NO 30 的氨基酸序列的蛋白质。
13.根据权利要求12的结合蛋白，其中所述蛋白质是跨膜蛋白并且所述结合蛋白对所 述蛋白质的胞外结构域是特异的。
14.能够结合癌细胞上抗原的结合蛋白，其中所述结合蛋白可以通过竞争结合分析被 鉴定，其中所述竞争结合分析包括(1)将固定数目的癌细胞与最小浓度的对固定数目的癌细胞产生最大结合的根据权利 要求23-33任一项的结合蛋白(Abl)温育，并测定Abl的中位荧光(MFAbl)；(2)将测试结合蛋白(Ab2)加到Abl和癌细胞中，检测两种或以上浓度的Ab2，并测定 中位荧光(MF(Abl+Ab2))；(3)测定背景中位荧光(MFbgd)；(4)计算PI，其中PI = [(MF(Abl+Ab2)-MFBgd)/(MFAbl-MFBgd)]XlOO ；和(5)比较所述PI和对照PI值；其中，与对照PI值统计学显著不同的PI表明了所述测试结合蛋白能够结合癌细胞上包含 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 36 或 SEQ ID NO 30 的氨 基酸序列的蛋白质。
15.权利要求9-14任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是抗体。
16.权利要求15的结合蛋白，其中所述抗体是抗体片段。
17.权利要求16的结合蛋白，其中所述抗体片段是Fab、Fab'、F(ab') 2,scFv,dsFv, ds-scFv、二聚体、微型抗体、二抗体，或其多聚体或双特异的抗体片段。
18.分离的核酸序列，其编码根据权利要求9-17任一项的结合蛋白。
19.组合物，其包含根据权利要求9-17任一项的结合蛋白和药用赋形剂、载体、缓冲液 或稳定剂。
20.免疫偶联物，其包含(1)结合癌细胞上抗原的根据权利要求9-17任一项的结合蛋 白，所述结合蛋白附着到(2)癌症治疗剂，所述癌症治序剂是细胞毒性的、细胞抑制性的或 以另外的方式阻止或降低癌细胞分裂和/或转移的能力。
21.权利要求20的免疫偶联物，其中所述癌症治疗剂是细胞毒素。
22.权利要求21的免疫偶联物，其中所述细胞毒素是核糖体失活多肽。
23.根据权利要求21的免疫偶联物，其中所述细胞毒素选自下组白树毒蛋白、 bouganin、肥皂草毒蛋白、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A链、异株泻根毒蛋白、白喉毒素、局限 曲菌素、假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素A或其变体。
24.权利要求21的免疫偶联物，其中所述细胞毒素是修饰的bouganin或其变体。
25.权利要求21的免疫偶联物，其中所述细胞毒素是由氨基酸252-608组成的截短形 式的假单胞菌外毒素A或其变体。
26.根据权利要求20-25任一项的免疫偶联物，其中所述免疫毒素被癌细胞内化。
27.根据权利要求20的免疫偶联物，其包含SEQID NO 67的氨基酸序列。
28.编码根据权利要求20-27任一项的免疫偶联物的分离的核酸序列。
29.根据权利要求28的分离的核酸序列，其包括SEQID NO :66的核酸序列。
30.组合物，其包含根据权利要求20-27任一项的免疫偶联物以及药用赋形剂、载体、 缓冲液或稳定剂。
31.有效量的根据权利要求20-27任一项的免疫偶联物在治疗或预防癌症中的用途。
32.根据权利要求31的用途，其还包含一种或多种另外的癌症治疗剂在同时、分开或 依次治疗或预防癌症的用途。
33.治疗或预防癌症的试剂盒，其包含有效量的权利要求20-27任一项的免疫偶联物 和其治疗或预防癌症的使用指南。
34.检测或监测受试者中癌症的方法，其包括步骤(1)将取自所述受试者的测试样品与特异性结合癌细胞上抗原的权利要求9-17的结 合蛋白的任一个接触，产生结合蛋白-抗原复合物；(2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的量；和(3)比较测试样品和对照中结合蛋白-抗原复合物的量。
35.诊断癌症的试剂盒，其包含结合癌细胞上抗原的权利要求9-17的结合蛋白的任一 个和其使用指示。
36.诊断试剂，其包含(1)结合癌细胞上抗原的根据权利要求9-17任一项的结合蛋白，所述结合蛋白附着到(2)直接或间接产生可检测信号的标记。
37.权利要求36的诊断试剂，其中所述标记是放射性同位素、荧光化合物、化学发光化 合物、酶、显像剂或金属离子。
38.试剂盒，其包含权利要求36或37的诊断试剂和其使用指示。
39.重组表载体，其包含权利要求2、6、7、8、18、28或29任一项的核酸分子。
40.宿主细胞，其包含权利要求39的重组表达载体。
41.分离的蛋白质，其包含SEQID NO: 30、32、36、53或54的氨基酸序列，或其变体。
42.权利要求41的分离的蛋白质，由SEQID NO 30的氨基酸序列或其变体组成。
43.包含SEQID N0:27的氨基酸序列的分离的蛋白质，其中选自第26、27、31、34、39、 106、111和112位的一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代或化学修饰。
44.权利要求43的分离的蛋白质，其中所述取代是以下的一个或多个P026V、D027L、 P031V、P034V、E039W、E106V、ElllV 禾口 / 或 K112A。
45.分离的核酸序列，其编码权利要求41-44任一项的分离的蛋白质。
46.重组表达载体，其包含权利要求45的核酸序列。
47.检测或监测受试者中癌症的方法，其包括检测样品中细胞上的权利要求41-46任 一项的分离的蛋白质，其中如果在细胞上检测到所述分离的蛋白质，表明患有癌症。
48.检测或监测受试者癌症的方法，其包括检测样品中细胞的权利要求41-46任一项 分离的蛋白质的RNA表达，其中如果检测到分离的蛋白质，则表明患有癌症。
49.药物组合物，其包含有效量的权利要求41-46任一项分离的蛋白质或其片段和与 其混合的合适的稀释剂或载体。
50.权利要求49的药物组合物，还包含佐剂。
51.药物组合物，其包含有效量的权利要求45的分离的核酸序列或权利要求46的表达 载体和与其混合的合适的稀释剂或载体。
52.权利要求51的药物组合物，还包含佐剂。
53.权利要求41-44任一项的分离的蛋白质或其片段在治疗或预防癌症的用途。
54.权利要求41-44任一项的分离的蛋白质或其片段在制造引发受试者免疫反应的药 物中的用途。
55.根据权利要求45的分离的核酸序列或根据权利要求46的重组表达载体在治疗或 预防癌症的用途。
56.根据权利要求45的分离的核酸序列或根据权利要求46的重组表达载体在引发受 试者免疫反应的用途。
57.鉴定化合物预防或治疗癌症的能力的方法，包含步骤(a)将在细胞表面上表达权利要求41-44任一项的分离的蛋白质的细胞与测试化合物 接触；和(b)检测所述分离的蛋白质的表达或功能；(c)将所述分离的蛋白质的表达和功能与对照比较，其中所述分离的蛋白质的表达或 能比对照减少，则表明化合物能够用于预防或治疗癌症。
全文摘要
本申请提供了癌症特异性抗体的重链和轻链的互补决定区的氨基酸序列和核酸序列。另外，本申请提供了癌症特异性的抗体和包含附着到毒素或标记的癌症特异性抗体的免疫偶联物，及其方法和用途。本申请也涉及使用本申请的癌症特异性抗体的诊断方法和试剂盒。另外，本申请提供了新的癌症相关抗原及其用途。
文档编号A61K47/48GK101925612SQ200880125628
公开日2010年12月22日 申请日期2008年11月27日 优先权日2007年11月27日
发明者吉恩尼克·西兹尔尤, 弗兰西娜·C·查海尔 申请人:维文蒂阿生物技术公司