一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA及其应用的制作方法

专利名称：：一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物靶点药物及其应用，具体地说，涉及一种特异性阻断PKCa信号传递的siRNA及其在制备治疗眼病理增生性疾病药物中的应用。
背景技术：
：眼病理增生性疾病包括增生性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy，PVR)、外伤性增生性玻璃体视网膜病变(T-PVR)、糖尿病增生性玻璃体视网膜病变(PDR)和青光眼术后滤过泡瘢痕化等。它们共同的病理特征是眼内细胞的过度增生导致的瘢痕化，引起视网膜脱离和堵塞滤过泡，是一组严重的致盲性眼病，是在细胞和分子水平上，由多种细胞和体液因素形成复杂的网络关系，进而调控眼内以视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞为主，还包括胶质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等的过度增生反应。目前的治疗药物，如用糖皮质激素抑制炎症过程，用抗代谢药抑制细胞增殖过程，这些药物均是抗肿瘤的细胞毒性药物，包括5-FU(5-fluoroumcil,5-FU)，道诺霉素或称柔红霉素(daunorubicinordaunomycin)、秋水仙缄(colchicine)和丝裂霉素等。然而这些药物都存在药效较弱、毒性较大等问题，并且缺乏对照的前瞻研究。因此需要寻找一些更安全、更有效的药物来防治这类疾病。研究这类疾病复杂网络中的某一因子或某一细胞的阻断可能比较困难，对这些复杂因素作用细胞的下游汇合处的信号调控进行研究也许更有效。而蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)是转导细胞外信号到细胞内反应的细胞内酶家族，广泛参与细胞信息传递、分泌、离子通道调节、细胞增生、分化及癌变等一系列与生命现象有关的过程，是理想的信号阻断靶点。国内外诸多研究显示，在PVR发生中，RPE细胞的增生(proliferation)、移行(migration)、吞噬(phagocytosis)和胶原纤维收缩(gelcontraction)等行为与RPE细胞自身的PKC有非常重要的关系。这些结果提示我们要研究致病因素作用RPE细胞后，产生的PKC信号是如何调控细胞并导致其行为失常的。本发明的发明人应用PKC的特异性抑制剂首次在国内外发现它通过抑制RPE细胞的钙离子内流，来抑制PVR的发生(OphthalmicRes.2005.37:128-35)，应用PKC特异性抑制剂金丝桃素可以有效抑制兔实验性PVR的发生(高前应，惠延年，王雨生.金丝桃素抑制兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变，眼科学报，2002，18(4):240-245)。从细胞、蛋白和基因水平确定了在PKC的12种亚型中，有IO种PKC亚型在RPE细胞表达，且主要分布在细胞浆中。PKC在成纤维细胞、胶质细胞和血管内皮细胞中也有广泛表达，研究显示应用PKC抑制剂也可以阻断这类细胞的增生，对外伤性增生性玻璃体视网膜病变(T-PVR)、糖尿病增生性玻璃体视网膜病变(PDR)和青光眼术后滤过泡瘢痕化等眼病理增生性疾病具有防治作用。但若从PKC水平阻断生物信号传递，PKC所有亚型的信号传递都会被阻断，影响细胞的生理功能。aprinoearsen(ISIS3521)是一种专一抑制靶向PKCa的mRNA的反义寡核苷酸，可以抑制肿瘤细胞的异常增生和诱导肿瘤细胞凋亡，主要用于恶性肿瘤病人，如非小细胞(型)肺癌、卵巢癌等患者，目前处于临床试验阶段。
发明内容本发明的目的在于提供一种小分子siRNA，该siRNA可特异性地阻断PKCa亚型的信号传递。为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案一种特异性阻断PKCa信号传递的siRNA，所述siRNA为以下针对人PKCa的双链RNA分子中的任意一种正义链5'-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3'，反义链5'-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3';正义链5'-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3'，反义链5'-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3';或正义链5'-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3'，反义链5'-UUUCAUACAACAGGACGCC-3';或所述siRNA为以下针对小鼠PKCa的双链RNA分子中的任意一种正义链5'-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3'，反义链5'-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3';正义链5'-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3'，反义链5'-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3';或正义链5'-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3'，反义链5'-UUUGCCACACACUUUGGGC-3'。优选地，所述双链RNA分子3'末端还设有以两个脱氧核苷组合的悬挂碱基(Over-hang)，以增加siRNA的稳定性。优选地，所述双链RNA分子为正义链5'-GGCGUCCUGUUGUAUGAAAdAdT-3'，反义链5'UUUCAUACAACAGGACGCCdAdT-3'。本发明的另一目的是提供该siRNA在制备治疗眼病理增生性疾病药物中的应用，该siRNA能有效阻断眼病理增生性疾病，为这类严重的致盲性眼病提供一个新的特异性生物治疗靶点和干预方法。为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案特异性阻断PKCoi信号传递的siRNA在制备治疗眼病理增生性疾病药物中的应用，所述眼病理增生性疾病为增生性玻璃体视网膜病变、外伤性增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病增生性玻璃体视网膜病变和青光眼术后滤过泡瘢痕化等眼病理增生性疾病。本发明siRNA可以制成眼科用滴眼液、注射液等不同剂型。本发明的发明人应用分子生物学技术研究体外人RPE细胞周期的多种因子和PKC亚型的关系，发现只有PKCa通过下调p27K^调控RPE细胞的增生和PVR的形成，在PVR发生中起着关键作用。PKCa能调控RPE细胞周期的Gl/S转折点，即能控制细胞从静止状态(G1期)进入DNA合成期(S期)，也称为限制点(restrictionpoint),是细胞能否越过静止期进入细胞增生的关键点。参与调控的是细胞周期素(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependentkinases,CDKs)形成的复合物Cdk2-CyclinE或Cdk2-CyclinA，而细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(cyclindependentkinaseinhibitors,CKIs)主要是p27Kipl。本发明具有以下有益效果1)siRNA-PKCa特异性针对PKCa亚型，在阻断PKCa的同时，并不会引起PKC其它亚型的信号传递阻断而影响细胞的生理功能，从而为治疗这类严重的致盲性眼病提供了一种新的药物特异性干预靶点的基因药物；2)首次应用PKCa信号特异性抑制剂siRNA-PKCa阻断眼病理增生性疾病，效果显著，且没有目前所用药物的副作用。图1为小鼠眼球HE染色比较；其中A:正常小鼠眼球；B:阴性对照组(NotargetsiRNA);C:50nM浓度组；D:100nM浓度组；E:150nM浓度组；F:200nM浓度组；G:300nM浓度组；图2为小鼠PVR的发生率；其中contrast:阴性对照组(NotargetsiRNA);1:50nM浓度组；2:lOOnM浓度组；3:150nM浓度组；4:200nM浓度组；5:300nM浓度组；图3为RPE细胞接受各种处理24小时后的RT-PCR结果图；图4为P27kipl接受PMA和Thy处理0-24小时的mRNA(A)和蛋白(B)的表达情况；图5为RPE细胞接受各种处理后PKCa的mRNA表达情况；图6为各种处理对RPE细胞增殖的影响图；图7为Westernblot法检测各处理组RPE细胞中PKCa蛋白的表达量。具体实施方式以下通过具体实施例来说明本发明。实施例1:利用小鼠siRNA治疗小鼠PVR1、试验模型小鼠PVR模型(C57BL/6小鼠，购自南方医科大学实验动物中心)本实验选择5-6周的SPF级C57BL/6小鼠共36只，按照Frenzel等(FrenzelEM,NeelyKA,WalshAW，etal.Anewmodelofproliferativevitreoretinopathy,InvestOphthalmolVisSci.1998Oct;39(ll):2157-2164)的方法，在无需进行玻璃体切割、视网膜切开或冷冻的条件下用10pL的微量进样器于小鼠右眼角巩膜缘后3mm向玻璃体腔注射2pL(0.2u/nL)的dispase(中性蛋白酶，GIBCO公司)，一般48周时即有明显的PVR形成，形成了小鼠PVR模型。2、PKCasiRNA的设计与合成首先在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取小鼠PKCamRNA的序列全长，设计三条PKCa-siRNA和一条阴性对照siRNA(NotargetsiRNA)。此外，设计了dTdT两个碱基的悬挂末端，以增加siRNA的稳定性。设计的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。将合成的siRNA粉末用无RNA酶的ddH20溶解，配制成20pM的siRNA母液于-20'C保存备用。表1小鼠PKCa-siRNA及阴性对照NotargetsiRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、试验方法将36只C57BL/6小鼠随机分为6组，每组6只，A组为阴性对照组(NotargetsiRNA)，1-5组为实验组，分别代表PKCasiRNA4终浓度为50nM(1组)、I00nM(2组)、150nM(3组)、200nM(4组)和300nM(5组)。小鼠玻璃体腔注射dispase1周后使用水合三氯乙醛(4.3%)麻醉小鼠，用复方托吡卡胺滴眼液散大小鼠瞳孔，在手术显微镜下，用IOML的微量进样器沿小鼠角巩缘进针，抵达视神经乳头表面，在玻璃体腔内注射2pL的药物。其中阴性对照组注射2pL浓度为500nM的NotargetsiRNA，眼内终浓度为100nM，实验组分别注射2pL浓度为250nM、500nM、750nM、1000nM、1500nM的PKCasiRNA4，眼内终浓度分别为50nM(1组)、100nM(2组)、150nM(3组)、200nM(4组)、300nM(5组)。玻璃体腔注射药物后，使用CUY21EDIT多功能活体电转化仪，进行活体电转染。使用前检查仪器，测量空气电阻，设置参数(Resistance:0.8-1.5kohm;Volt:80-100V;Pon:50msec;Poff:950msec;Number:5;Ampere:0.08-0.15A)。将小鼠两眼涂上羟丙基甲基纤维素滴眼液，然后用电极(CUY650P7)贴紧角膜，然后按下Start,开始进行转染。电转染后连续观察4周，颈椎脱臼法处死小鼠，收集标本。用眼科弯镊摘取小鼠双侧眼球，去除球外组织，用OCT包埋眼球，制作冰冻切片并进行常规HE染色和免疫组化检测。4、试验结果A.眼球结构变化药物作用4周后，将小鼠眼球冰冻切片后进行HE染色。图1结果表明，阴性对照组和实验组50nM浓度组6眼球视网膜全脱离，视网膜基本结构发生改变；实验组100nM组、150nM组、200nM浓度组有4眼发生视网膜脱落，2眼未发生视网膜脱落，且眼球基本结构完好；实验组300nM浓度组有3眼发生视网膜脱落，3眼未发生视网膜脱落，且眼球结构完好，说明100nM-300nM的PKCasiRNA对PVR的发生有一定的抑制作用。B.PVR发生率如图2所示，阴性对照组和实验组50nM浓度组视网膜严重脱离，PVR发生率为100%,实验组100nM组、150nM组、200nM组，PVR发生率均为66.7%，300nM组PVR发生率为50%。C.免疫荧光检测1)RPE细胞、Mllller细胞表达通过免疫荧光检测RPE细胞的标志性蛋白RPE65，和MlUler细胞的标志性蛋白GS的表达分布，结果表明正常小鼠视网膜中可见RPE细胞和MUller细胞呈弱阳性表达，阴性对照组、50nM浓度组、lOOnM浓度组、150nM浓度组脱落的视网膜组织RPE细胞和Muller细胞呈强阳性表达，200nM组和300nM组脱落的视网膜组织RPE细胞和Muller细胞呈弱阳性表达。实验组中随着siRNA浓度的升高,RPE细胞和MUller细胞表达明显减少。2)成纤维细胞、星型胶质细胞表达通过免疫荧光检测成纤维细胞的标志性蛋白a-SMA，和星型胶质细胞的标志性蛋白GFAP的表达分布，结果表明正常小鼠视网膜中可见成纤维细胞、星型胶质细胞呈弱阳性表达，阴性对照组、50nM浓度组、100nM浓度组、150nM浓度组脱落的视网膜组织成纤维细胞、星型胶质细胞呈强阳性表达，200nM组和300nM组成纤维细胞、星型胶质细胞呈弱阳性表达。实验组中随着siRNA浓度的升高，成纤维细胞和星型胶质细胞表达明显减少。利用小鼠siRNA治疗小鼠PVR,结果表明PKCasiRNA能够抑制PVR的发生，100-300nM的siRNA对PVR的发生有一定的抑制作用，浓度越高，抑制作用越明显；siRNA通过抑制与眼病理增生性疾病相关的细胞的表达来抑制PVR的发生，随着siRNA浓度的升高,RPE细胞、MUller细胞、成纤维细胞和星型胶质细胞表达明显减少。实施例2:利用人siRNA抑制RPE细胞的增殖1、实验细胞RPE细胞:在中山眼科中心眼库中取捐献者死后24小时内的眼球，在无菌条件下自赤道布环形切开眼球，弃去眼前节，清除玻璃体，分离视网膜神经上皮层，将后节眼杯置于眼球托上，将质量百分比为0.25%的胰酶加入眼杯，37'C孵育消化约IO分钟后用吸管轻轻吹打，使RPE细胞脱落，将含RPE细胞的消化液移入预加有含质量百分含量为20%的胎牛血清和10/o的抗生素的DMEM中，终止胰酶作用。离心、漂洗后用含质量百分含量为20%的胎牛血清和1%的抗生素的DMEM制成浓度为2X104cellZmlRPE细胞悬液，用于接种培养。2、PKCasiRNA的设计与合成首先在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人PKCamRNA的序列全长，设计三条PKCasiRNA和一条阴性对照siRNA(NotargetsiRNA)。此外，设计了两个碱基的悬挂末端，以增加siRNA的稳定性。设计的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。将合成的siRNA粉末用无RNA酶的ddH20溶解，配制成20nM的siRNA母液于-20'C保存备用。表2人PKCa-siRNA及阴性对照NotargetsiRNA名称耙标位置正义链序列反义链序列SEQ(Target/bp)Sense(5'-3，)Antisense(5'-3，)PKCasiRNAl756~774CGACGACUGUCUGUAGAAAdGdTU跳UACAGACAGUCGUCGdGdT1、2PKCasi腿2861~879GGAUGGUACAAGUUGCUUAdAdCUAAGCAACUUGUACCAUCCdAdC3、4PKCasi腿31617~1635GGCGUCCUGUUGUAUGAAAdAdTUUUCAUACAACAGGACGCCdAdT5、6阴性对照ProductNoAGAUAAGGUUCGAGGAGAAdTdTCCCUCGMCCU画CUdTdT7、8(2005527113152)3、实验方法(1)细胞培养将RPE细胞悬液接种于6孔培养板，当细胞融合率达50%时，去除原培养基，每孔加入2ml含质量百分含量为20%的胎牛血清的无抗生素的DMEM培养基。(2)制备转染复合物取60pl浓度为2mg/ml的脂质体LipofectAMINE2000,加入300^1DMEM混匀，室温下静置5分钟得A液；分别取180^1浓度为lOOnM的PKCasiRNA3和NotargetsiRNA，各加300WDMEM混匀得B液，将A液与B液混合，轻轻地颠倒混匀，不要震荡，室温下温育20分钟，形成siRNA-LipofectAMINE2000和NotargetsiRNA-LipofectAMINE2000的转染复合物。(3)转染当细胞融合率达60%时，进行转染处理。各组每个孔内均加入lml对应的液体，前后轻柔推摇培养板以混匀液体，将培养板送入细胞培养箱常规培养。每个组设置5个重复。siRNA组siRNA-LipofectAMINE2000转染复合物；阴性对照组NotargetsiRNA-LipofectAMINE2000转染复合物；Thy组含thymdeatoxin(—种特异性激活PKCa的化学物质)的培养基，终浓度为lOOnM;Control组空白对照组。4、实验结果RT-PCR结果显示细胞接受siRNA、Thy(100nM)或PMA(100nM)处理24小时后，在主要细胞周期调节因子中，只有p27k^mRNA的表达量发生了变化，提示细胞周期抑制性蛋白P27kipl是PKCa促人RPE增殖相关的细胞周期相关蛋白(图3)。P27kipl蛋白分别在1小时(PMA)和3小时(Thy)明显下降(图4)。RPE细胞在接受各种处理3小时后，测定PKCamRNA的表达情况，结果表明，Thy和PMA作用RPE细胞后，PKCamRNA的表达量增加，siRNA作用RPE细胞后，PKCamRNA的表达量下降(图5)。转染2天后，每个处理组均取3孔细胞，采用细胞计数板法分别计数并计算平均数，其余2孔提蛋白做Westernblot检测靶蛋白PKCa的表达。与Control组相比，siRNA组的RPE细胞数明显减少，表明siRNA能显著抑制RPE细胞的增殖，抑制效率达到39.9%(图6)。不同处理组中的p-Actin条带亮度几乎无差异，说明总蛋白量基本一致，Control组的PKCa蛋白表达有明显条带，而转染了PKCasiRNA3的细胞几乎检测不到PKCa蛋白的表达，实验结果进一步证实了PKCasiRNA在蛋白水平对靶基因表达的抑制及作用的特异性(图7)。本发明的siRNA均能不同程度下调PKCa的mRNA水平从而抑制RPE细胞的增殖，其中以50-300nM浓度效果最佳，以PKCasiRNA3的抑制作用最明显。在人RPE细胞转染了100nM的siRNA3后，细胞增殖的抑制效率为39.9%，且此浓度的siRNA对RPE细胞的形态无影响。中心<120>—种特异性阻断PKCa信号传递的siRNA及其应用<160>14<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>1cgacgacugucuguagaaa19<210>2<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>2uuucuacagacagucgucg19<210>3<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>3ggaugguacaaguugcuua19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4uaagcaacuuguaccaucc19<210>5<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>5ggcguccuguuguaugaaa19<210>6<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>6uuucauacaacsgg3cgcc19<210>7<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>7agauaagguucgaggag33<210>8<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>8cuuuccucgaaccuuaucu<210>9<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>9gaaugagagcaaacagaaa<210>10<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>10uuucuguuugcucucauuc<210>11<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>11gcaaaggacuuaugaccaa19<210>12<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>12uuggucauaaguccuuugc19<210>13<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>13gcccaaaguguguggcaaa19<210>14<211>19<212>RNA<213>人工序列<400>14uuugccacacacu皿gggc权利要求1.一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA，其特征在于所述siRNA为以下针对人PKCα的双链RNA分子中的任意一种正义链5′-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3′，反义链5′-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3′；正义链5′-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3′，反义链5′-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3′；或正义链5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3′，反义链5′-UUUCAUACAACAGGACGCC-3′；或所述siRNA为以下针对小鼠PKCα的双链RNA分子中的任意一种正义链5′-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3′，反义链5′-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3′；正义链5′-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3′，反义链5′-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3′；或正义链5′-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3′，反义链5′-UUUGCCACACACUUUGGGC-3′。2.根据权利要求1所述的特异性阻断PKCa信号传递的siRNA，其特征在于所述双链RNA分子的3'末端还设有以两个脱氧核苷组合的悬挂碱基。3.根据权利要求2所述的特异性阻断PKCa信号传递的siRNA，其特征在于所述双链RNA分子为正义链5'-GGCGUCCUGUUGUAUGAAAdAdT-3'，反义链5'UUUCAUACAACAGGACGCCdAdT-3'。4.根据权利要求1所述的特异性阻断PKCa信号传递的siRNA，其特征在于所述针对人PKCa的siRNA的浓度为50-300nM，或所述针对小鼠PKCa的siRNA的浓度为100-300nM。5.权利要求1-4任一项所述的siRNA在制备治疗眼病理增生性疾病药物中的应用。6.根据权利要求5所述的siRNA的应用，其特征在于所述眼病理增生性疾病为增生性玻璃体视网膜病变、外伤性增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病增生性玻璃体视网膜病变或青光眼术后滤过泡瘢痕化。全文摘要本发明公开了一种特异性阻断PKCα信号传递的siRNA，所述siRNA为以下针对人PKCα的双链RNA分子中的任意一种正义链5′-CGACGACUGUCUGUAGAAA-3′，反义链5′-UUUCUACAGACAGUCGUCG-3′；正义链5′-GGAUGGUACAAGUUGCUUA-3′，反义链5′-UAAGCAACUUGUACCAUCC-3′；或正义链5′-GGCGUCCUGUUGUAUGAAA-3′，反义链5′-UUUCAUACAACAGGACGCC-3′；或所述siRNA为以下针对小鼠PKCα的双链RNA分子中的任意一种正义链5′-GAAUGAGAGCAAACAGAAA-3′，反义链5′-UUUCUGUUUGCUCUCAUUC-3′；正义链5′-GCAAAGGACUUAUGACCAA-3′，反义链5′-UUGGUCAUAAGUCCUUUGC-3′；或正义链5′-GCCCAAAGUGUGUGGCAAA-3′，反义链5′-UUUGCCACACACUUUGGGC-3′，siRNA-PKCα特异性针对PKCα亚型，为治疗这类严重的致盲性眼病提供了一种新的药物特异性干预靶点的基因药物。文档编号A61P27/02GK101591655SQ200910039899公开日2009年12月2日申请日期2009年6月1日优先权日2009年6月1日发明者坚葛,高前应申请人:中山大学中山眼科中心