专利名称：：一种马齿苋子总黄酮树脂纯化方法
技术领域：
：本发明涉及维吾尔药成分纯化方法，主要涉及维吾尔药提取物的纯化方法，尤其涉及马齿苋子总黄酮的纯化方法，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：在全球长寿地区之一的新疆，维吾尔传统医药至今广泛流传。新疆具有独特的地理环境和气候条件，因而蕴育了丰富的维吾尔药材资源。马齿苋子为马齿苋科植物马齿苋PortulacaoleraceaL.的干燥种子，夏秋果实成熟时采收全株晒干，抖动后收集落下的种子。本品扁圆形或圆肾形，长约O.94mm，宽0.83mm，厚约0.42mm。表黑色，少数红棕色，于解剖镜下可见密布细小疣状突起。一端有一凹陷，凹陷旁有一白色种脐。质坚硬，难破碎。气微，味微酸。以粒饱满，色黑者为佳。清凉生津，利尿止渴，降低机体胆液质的偏旺。用于治疗热性疾患，胃病，头痛，子宫炎症，脑膜炎，尿道炎及热性台甫。研究认为马齿苋子的这些作用与黄酮类成分有密切关系。马齿苋子总提取物由于成分复杂而使制成的制剂不可避免地存在粗、大、黑的缺点，且总提取物中还因含有较多的糖类而具有较大的吸湿性，限制了其剂型的选择。因此对马齿苋子总黄酮进行纯化，使纯化后的产品符合中药新剂型的需要具有重要的意义。中药中黄酮类化合物的纯化，传统采用溶剂萃取法、聚酰胺和硅胶柱层析法，但是溶剂萃取法操作麻烦，萃取过程又易乳化，所有有机溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇有不同程度的毒性，且用氯仿萃取，只能得到黄酮总量的40%;用乙酸乙酯萃取，也只能得到总量的50%;用正丁醇萃取也仅得到总量的40%左右，因此需要用上述几种溶剂依次萃取才能使总黄酮基本萃取完全。聚酰胺纯化法对马齿苋子总黄酮的不可逆吸附达40%，因此其得率低，且洗脱麻烦。硅胶纯化法对黄酮的不可逆吸附达60%，得率更低。因此上述三种方法在马齿苋子总黄酮纯化中，均不理想。而同时基于大孔树脂在中药纯化中应用日渐广泛，已用于纯化黄酮、皂苷、生物碱等中药成分，大孔树脂种类日益增多，在传统D101、D102树脂的基础上，已开发了各种不同性能的大孔树脂，如，天津农药股份公司树脂分公司生产的D-101、DA201、匿301，河北沧州宝恩化工有限公司的HPD系列，以及南开大学化工厂生产的AB-8、D3520等。可以考虑采用大孔树脂对其进行提纯。
发明内容针对现有马齿苋子中总黄酮的提取与纯化方法上存在的不足之处，本发明提供一种全新的马齿苋子中总黄酮的提取与纯化方法，主要用树脂对马齿苋子进行柱提纯，采用这种方法，降低了有机溶剂在整个提纯过程中的应用，防止了有机溶剂对最终产物的影响，本发明方法纯化马齿苋子，其总黄酮转移率可达90%以上，纯化物总黄酮含量可达55%以上，且重现性好，树脂可重复使用。本发明所述的技术方案如下一种马齿苋子总黄酮树脂纯化方法，由以下具体步骤组成1)取粉碎的马齿苋子，以体积分数为40%乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量IO倍体积量的体积分数为40%乙醇为提取剂，加热至回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，得浓縮液；2)将步骤1得到的提取液浓縮到每毫升含提取物20mg，选用HPD-400或HPD-600或AB-8或D101大孔树脂，上样，上样吸附0.12.0小时，先水洗，水洗体积为1BV3BV，水洗流速为lBV/h3BV/h，然后用乙醇洗脱，洗脱用乙醇体积分数为50%80%，洗脱量为1BV4BV，洗脱速度为2BV/h4BV/h;3)收集步骤2的乙醇洗脱液，浓縮，5(TC真空干燥，得干燥的纯化产品。本发明提供的马齿苋子总黄酮树脂纯化方法步骤2中优选HPD-400大孔树脂对浓縮液进行纯化，优选工艺条件为上样吸附时间为1.0小时，水洗体积为1BV，水洗流速为2BV/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为60%，乙醇洗脱量为2BV，乙醇洗脱速度为2BV/h。本发明提供的马齿苋子总黄酮树脂纯化方法步骤2中提取液浓縮物为透明状棕黄色液体或含有悬浮态棕黄色絮状颗粒的透明状棕黄色液体。本发明提供的马齿苋子总黄酮树脂纯化方法步骤2中浓縮液上样的方式是干法上样，上样体积与大孔树脂质量比值为5:iio:i。优选浓縮液上样体积比大孔树脂质量为8:1。干法上样可以使未溶解的样品与树脂充分混合均匀，吸附的更加充分。上样体积与大孔树脂质量比值太大树脂吸收饱和且有剩余，浪费浓縮液。上样体积与大孔树脂质量比值太小，大孔树脂利用不完全有浪费。本发明提供的马齿苋子总黄酮树脂纯化方法，获得马齿苋子纯化物的总黄酮质量含量>55%，总黄酮转移率>90%。本发明具有以下优点1.本发明提供的马齿苋子总黄酮树脂纯化方法操作简单、快捷；2.所选的大孔树脂具有吸附量大、解吸率大的功能；3.浓縮液上样的方式是干法上样，使未溶解的样品与树脂充分混合均匀，吸附的更加充分；4.以乙醇为溶剂和洗脱剂，价廉、无毒；5.本发明方法纯化马齿苋子，其总黄酮转移率可达90%以上，纯化物总黄酮含量可达55%以上，且重现性好，树脂可重复使用。具体实施例方式为了更好理解本发明的技术方案，以下通过具体的实施例进一步详细描述。实施例1—种马齿苋子总黄酮树脂纯化方法，具体步骤如下1)取粉碎的马齿苋子50g，以体积分数为40%乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量10倍体积量的体积分数为40%乙醇为提取剂，加热至回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，得浓縮液；2)将提取液浓縮到每毫升含提取物20mg，选用D101大孔树脂，上样体积与大孔树脂质量比值为8:1干法上样，上样吸附1.0小时，先用2BV蒸馏水水洗，水洗流速为2BV/h，然后用3BV体积分数为50%乙醇洗脱，洗脱速度为2BV/;3)将收集的乙醇洗脱液，浓縮，5(TC真空干燥，得干燥的纯化产品3.58g。实施例2四种树脂对马齿苋子总黄酮的静态吸附与解吸试验称取lg干树脂，分别装入100ml锥形瓶中，各加入浓度为10mg/ml的样品溶液20ml。每隔lOmin振荡10s，持续2h，静止24h，使其达到饱和吸附，抽滤，取滤液l.Oml，按标准曲线项下操作，求得样品的黄酮含量。按下式计算树脂吸附量吸附量=[初始质量浓度_剩余质量浓度]X溶液体积/树脂量将滤出的树脂另置100ml锥形瓶中，加入70%乙醇20ml，每隔lOmin振荡lOs，持续2h，抽滤，取滤液1.0ml，按标准曲线项下操作，求得样品的黄酮含量。按下式计算解吸率(%):解吸率=[解吸液浓度X解吸液体积]/吸附量X100%表1四种树脂静态饱和吸附量及静态洗脱率测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>通过表1可知，DIOI和HPD-400的解吸率接近，而HPD-400的吸附量更大，故选择HPD-400型吸附树脂。实施例3浓縮液上样体积与大孔树脂质量比值称取已处理的HPD-400型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，干法装柱，浓縮液(20mg/ml)上样体积与大孔树脂质量比值(mg/ml)分别为5:1、8:1、10:1，以2BV蒸馏水，2BV/h速度冲洗后，以3BV的50%的乙醇溶液进行洗脱，流速3BV/h，纯化后总黄酮回收率分别为90.97%，91.56%，89.55%。故宜选择浓縮液(20mg/ml)上样体积与大孔树脂质量比值(mg/ml)为8:1。实施例4冲洗杂质用水体积称取已处理的HPD-400型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，干法装柱，干树脂质量lg，上柱黄酮提取液6ml(20mg/ml)，静置1小时，分别用1BV、2BV、3BV蒸馏水以2BV/h的速度冲洗，继用2BV的60%乙醇洗脱，收集洗脱液，测其吸光度，计算总黄酮含量。结果表明总黄酮回收率分别为89.3%、88.9%、89.4%，总黄酮的纯度分别为45.6%、45.7%、45.6%，数据结果表明洗脱水用量对总黄酮回收率和纯度无明显影响。为减少洗脱用水，縮短洗脱时间且充分冲洗杂质，选择1BV为洗脱杂质用水量。实施例5洗脱剂流速对纯化的影响称取已处理的D101型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，干法装柱，干树脂质量lg，上柱黄酮提取液10ml(20mg/ml)，静置1小时，让其充分吸附，以2BV蒸馏水，2BV/h速度冲洗后，以3BV的50%的乙醇溶液进行洗脱，流速分别为lBV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h，纯化后总黄酮回收率分别为93.22%，92.97%，91.19%，89.55%。洗脱剂流速lBV/h比2BV/h的回收率高，但相差不大，为了提高效率，洗脱剂流速选择2BV/h。实施例6HPD-400大孔吸附树脂动态吸附_洗脱实验洗脱用醇的体积称取已处理的HPD-400型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，干法装柱，干树脂质量lg，上柱黄酮提取液8ml(20mg/ml)，静置1小时，以4BV水冲洗后，用2BV、3BV、4BV的70%乙醇洗脱，收集洗脱液，测吸光度计算总黄酮含量。结果表明总黄酮的回收率分别为92.6%、92.8%、93.2%。总黄酮的回收率接近，洗脱用量过多会增加洗脱时间，同时造成一定的浪费，故选择2BV的70%乙醇进行洗脱。实施例7洗脱剂浓度对总黄酮回收率的影响称取已处理的HPD-600型树脂3份(每份相当于干树脂8g)，干法装柱，干树脂质量lg，上柱黄酮提取液8ml(20mg/ml)，静置1小时，以2BV蒸馏水，2BV/h速度冲洗后，分别用浓度为50%、60%、70%、80%的2BV乙醇水溶液进行洗脱，流速为2BV/h。收集洗脱液，测定黄酮的吸光度并计算总黄酮的回收率。总黄酮的纯度分别为48.6%，58.3%，57.9%，54.1%，宜选乙醇溶液浓度为60%。权利要求一种马齿苋子总黄酮纯化方法，其特征是其纯化步骤为1)取粉碎的马齿苋子，以体积分数为40％乙醇为溶剂，浸泡12小时，以药材质量10倍体积量的体积分数为40％乙醇为提取剂，加热至回流提取，收集提取液，减压回收乙醇，得浓缩液；2)将步骤1得到的提取液浓缩到每毫升含提取物20mg，选用HPD-400或HPD-600或AB-8或D101大孔树脂，上样，上样吸附0.1～2.0小时，先水洗，水洗体积为1BV～3BV，水洗流速为1BV/h～3BV/h，然后用乙醇洗脱，洗脱用乙醇体积分数为50％～80％，洗脱量为1BV～4BV，洗脱速度为2BV/h～4BV/h；3)收集步骤2的乙醇洗脱液，浓缩，50℃真空干燥，得干燥的纯化产品。2.如权利要求1所述的马齿苋子总黄酮纯化方法，其特征是提取液浓縮物为透明状棕黄色液体或含有悬浮态棕黄色絮状颗粒的透明状棕黄色液体。3.如权利要求1所述的马齿苋子总黄酮纯化方法，其特征是浓縮液上样的方式是干法上样，上样体积与大孔树脂质量比值为5:110:1。4.如权利要求1所述的马齿苋子总黄酮纯化方法，其特征是获得纯化的马齿苋子总黄酮含量>55%，总黄酮转移率>90%。全文摘要本发明属于医药
技术领域：
，涉及一种维吾尔中草药马齿苋子的总黄酮树脂纯化方法，是以大孔树脂吸附法将马齿苋子提取液经上柱、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的马齿苋子总黄酮。本发明提供的马齿苋子总黄酮树脂纯化方法，采用干法上样，是一种简单、便捷的方法。所选的大孔树脂具有吸附量大、解吸率大。本发明方法以乙醇为溶剂，既廉价又无毒。用本发明方法纯化马齿苋子提取物，其总黄酮转移率可达90％以上，纯化物总黄酮含量可达60％以上，且重现性好，树脂可重复使用。文档编号A61P15/00GK101708199SQ20091023009公开日2010年5月19日申请日期2009年11月13日优先权日2009年11月13日发明者段洪东,王世潇申请人:段洪东