新颖的佐剂组合物的制作方法

专利名称：新颖的佐剂组合物的制作方法
新颖的佐剂组合物发明背景 发明领域本发明一般涉及用于增强对抗原的免疫应答的新颖的佐剂配制物，该新颖的佐剂 配制物用于免疫原性和疫苗组合物中，但不在受试者中产生毒性或不想要的副作用。本发 明还涉及所述佐剂、免疫原性组合物及疫苗组合物的制备方法和用途。相关技术的历史和描述细菌、病毒及寄生虫感染广泛分布于人和动物。由这些感染剂引起的疾病通常对 抗微生物药学疗法具有抗性，使得无有效的治疗方法。因此，愈来愈多人使用疫苗学方法以 控制传染病。完整的传染性病原体可在经化学灭活或合适的遗传工程处理后变得适用于疫 苗配制物。或者，可将病原体的蛋白质亚基在重组表达系统中表达并纯化，以用于疫苗配制 物中。疫苗可通过在组合物中包含合适的佐剂而变得更有效。使用疫苗学方法以治疗动物和人的癌症的兴趣亦持续增加。用于治疗癌症的所述 治疗途径涉及以包含肿瘤特异性抗原及佐剂的疫苗为癌症患者接种疫苗。然而，研发中的 许多具有此性质的疫苗无一被主管机关批准。疫苗并未显示出可缩小肿瘤——此为癌症药 物效力的标准度量。术语“佐剂”一般是指增加对抗原的体液或细胞性免疫应答的任何物质。佐剂被 用于达成二个目的其减缓抗原从注射部位释出，且其刺激免疫系统。传统疫苗通常由灭活 或被杀死或经修饰的活致病微生物的粗制备物组成。与这些致病微生物的培养物相关的杂 质可作为增强免疫应答的佐剂。然而，以利用致病微生物或纯化的蛋白质亚基的同质制备 物作为抗原而制成的疫苗所激发出的免疫力通常不够。因此，加入某些外源物质(诸如佐 剂)变得必要。再者，制造合成及亚基疫苗很昂贵。加入佐剂可容许使用较小剂量的抗原 来刺激类似的免疫应答，从而减少疫苗的制造成本。因此，当将药剂与佐剂组合时可显著增 加某些可注射药剂的效力。在选择佐剂时必须考虑许多因素。佐剂应该以有效方式使抗原的释出和吸收速率 缓慢，且对宿主的毒性、变应原性、刺激及其它不想要的作用最小。为了使人满意，佐剂应为 非杀病毒性、可生物降解、可持续产生高水平的免疫力、能刺激交叉保护作用、可与多种抗 原兼容、在多种物种中有效、对宿主无毒且安全(如无注射部位反应)。其它期望的佐剂 特征为可微量给药、剂量节省、具有优良的货架稳定性、可承受干燥、可制成不含油、可作为 固体或液体存在、为等张性、容易制造且其制造并不昂贵。最后，高度期望能够根据疫苗接 种方案的需要而将佐剂配置成诱导体液或细胞免疫应答或二者兼有。然而，可符合上述条 件的佐剂的数量有限。佐剂的选择系取决于疫苗的需要，无论所述需要是增加抗体应答的幅度或功能、 增加由细胞介导的免疫应答、诱导黏膜免疫力或降低抗原剂量。已提出大量佐剂，然而，其 无一显示出理想适用于所有疫苗。第一种在文献中报导的佐剂为弗氏完全佐剂(Freimd' s Complete Adjuvant) (FCA)，其含有油包水乳液及分枝杆菌(mycobacterium)的提取物。不幸地，FCA的可耐受性差且可能引起无法控制的发炎。自从在超过80年前发现FCA起，人 们一直努力减少不想要的佐剂副作用。一些已作为佐剂使用的其它物质包括金属氧化物(如氢氧化铝)、明矾、盐的无 机螯合物、明胶、不同的石蜡型油、合成树脂、藻酸盐、类粘蛋白及多糖化合物、酪蛋白酸盐 及从血液衍生的物质诸如纤维蛋白凝块。虽然这些物质通常可有效刺激免疫系统，但由于 宿主中的不利作用(如产生无菌脓肿、损伤、致癌性或变应原性应答)或令人不满的药学 性质(例如物质从注射部位快速分散或分散控制不良，或膨胀)，因此无一令人完全满意。合成油及石油衍生物已被用作佐剂，因其显示出在体内分散得相对缓慢，但其可 能令人不满意，因其经常分裂成芳香烃，而此物质可能具致癌性。再者，这些物质中有些已 被发现能够产生无菌脓肿且可能永远无法从身体完全排出。当正确选择且调制成正确浓度 时，油可相对安全且无毒性。自南美洲皂树(Qui 1 laja saponaria)的树皮取得的皂苷已作为佐剂一段 时间° 见，Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (A review of the biological and pharmacological activities of saponins。许多现今使用的兽医疫苗包含QuilA，其为来 自南美洲智利皂荚树(Quillaja saponaria moIina)的树皮的皂苷馏分。将Quil A进一 步分馏则产生次馏分，包括QS-7、QS-17、QS-18及QS-21。(见美国专利No. 5，057，540)。使用皂苷作为佐剂有多种缺点。皂苷为可溶性，因此刺激非特异性免疫应答。然 而，疫苗学的目的是刺激针对一种或多种特异性抗原的靶向应答。皂苷对胆固醇具有强亲 和力。其与细胞膜中所发现的胆固醇形成复合物而使细胞溶血。其亦显示出引起注射位点 坏死且难以配制成微粒构造。当用于含有经修饰的活包膜病毒的疫苗中时，皂苷可破坏病 毒被膜从而将病毒抗原灭活。为了克服Qui 1 A的溶血及杀病毒性质，现已将其与胆固醇和磷脂组合而形成称为 免疫刺激性复合物(ISCOM)或ISCOM基质(ISC0MATRIX)的特殊构造。见，Ozel M.，et al.； J. Ultrastruc. and Molec. Struc. Re 102，240-248 (1989)。当与抗原组合时，ISCOM 通常会 诱导Thl细胞毒性T细胞应答。然而，尽管大幅减弱Quil A的溶血性质，但Quil A与胆固 醇组合并不会完全消除此类性质。ISCOM的另一限制为蛋白质抗原必须具有足够大的疏水 结构域来与ISCOM交互作用，从而被并入ISCOM中。高度亲水的蛋白质无法被并入ISCOM 中。最后，ISCOM可在受试者内刺激不想要的自体免疫应答。免疫调节剂已被用作佐剂，其例子包括二甲基双十八烷基溴化铵(以下称“DDA”) 和拉韦定(avirdine)。DDA为亲脂性季铵化合物(胺)，其带有结合正电荷季铵分子的二 个18碳烷基链及二个甲基基团，分子量为631。其作为佐剂的用途由fell (Immunol. V. 11， p. 369,1966)发现。据报导，DDA可刺激强烈的经细胞介导的免疫应答，亦显示出可诱导 体液免疫应答。许多论文已发表，证明DDA作为蛋白质抗原、半抗原(hapten)、肿瘤、病 毒、原生动物及细菌的佐剂的效力。(见，Korsholm, K S.，et al.，Immunology, vol. 121， PP. 216-226,2007)。大部分研究已在实验室动物中进行，然而仅有少量在较大型的动物诸 如鸡(见,Katz, D.，et al. FEMSImmunol Med Microbiol. Vol 7(4) :303_313，1993)、猪和 牛中进行。DDA可在实验室动物以及较大型的动物中有效诱导延迟型超敏(DTH)反应。然 而，其在水中不易溶。聚合物亦已被用作佐剂，其例子包括二乙基-氨乙基(DEAE)-葡聚糖、聚乙二醇及聚丙烯酸(如(CARBOPOL ))。本领域中已知多糖DEAE-葡聚糖为非常强的佐剂。然 而，其与令人无法接受的反应原性(reactogenicity)有关。CARBOPOL 聚合物为丙烯 酸与聚链烯基醚或二乙烯乙二醇(divinyl glycol)交联的聚合物。CARBOPOL 已用 于多种疫苗中，但其作为佐剂的用途并未被证实。一些佐剂已显示刺激Th2应答，其例子包括水合N-(2_脱氧基-2-L-亮氨酰氨 基-b-D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰胺乙酸酯(当其为乙酸酯形式时亦已知为商 标名BayR1005 )及铝。Bay R1005 与经纯化的病毒疫苗或亚基疫苗组合可增加经病 毒攻击的小鼠中抗体的生产。在其它动物物种(猪、绵羊、马)中进行的临床前试验在抗体 生产方面得到相当的结果。由Bay R1005 诱导的抗体合成的增加特异性地取决于抗原而 非多克隆刺激的结果。在本发明之前并无佐剂配制物拥有理想佐剂所应有的广泛的期望的特征。寻求用 于疫苗中的可克服常规佐剂的缺陷的新佐剂的努力一直在进行。特别地，高度期望下述佐 剂配制物，其可在人和动物中引发针对广泛抗原的有效的经细胞介导的免疫应答及体液免 疫应答，但无常规佐剂的副作用和配制困难。

发明内容
本发明涉及新颖的佐剂、免疫原性组合物和疫苗组合物。特别地，本发明涉及包含 Thl刺激剂、免疫调节剂、聚合物及Th2刺激剂的佐剂配制物。本发明还涉及包含这类佐剂 配制物及一或多种抗原的免疫原性组合物及疫苗组合物，以及制备该佐剂和疫苗组合物的 方法。在一个实施方案中，该佐剂组合物包含皂苷、固醇及季铵化合物的组合。在一个实 施方案中，该佐剂组合物包含Quil A、胆固醇及DDA。在另一个实施方案中，该佐剂组合物包含皂苷、固醇、季铵化合物及聚合物的组 合。在一个实施方案中，该佐剂组合为Quil A、胆固醇、DDA及聚丙烯酸。在另一个实施方案中，该佐剂组合物包含皂苷、固醇、季铵化合物、聚合物及糖脂 的组合。在一个实施方案中，该佐剂组合为Quil A、胆固醇、DDA、聚丙烯酸及BayR1005 。在一个实施方案中，包含佐剂配制物及免疫有效量的抗原的免疫原性组合物(其 中该佐剂配制物包含皂苷、固醇、季铵化合物及聚合物)通过包括下列步骤的方法制备a)在缓冲液中制备抗原的组合物；b)将皂苷加入步骤a的组合物中；c)将固醇加入步骤b的组合物中；d)将季铵化合物加入步骤c的组合物中；e)将聚合物加入步骤d的组合物中。在所述方法的一个实施方案中，该皂苷为Quil A，该固醇为胆固醇，该季铵化合物 为DDA且该聚合物为聚丙烯酸。在一个实施方案中，包含佐剂配制物及免疫有效量的抗原的疫苗(其中该佐剂配 制物包含皂苷、固醇、季铵化合物、聚合物及糖脂)系藉包含下列步骤的方法制备a)在缓冲液中制备该抗原成分的组合物；b)将皂苷加入步骤a的组合物中；
c)将固醇加入步骤b的组合物中；d)将季铵化合物加入步骤c的组合物中；e)将聚合物加入步骤d的组合物中；及f)将糖脂加入步骤e的组合物中。在所述方法的一个实施方案中，该皂苷为Quil A，该固醇为胆固醇，该季铵化合物 为DDA，该聚合物为聚丙烯酸且该糖脂为Bay R1005 。现已发现，本文中所报导的佐剂组合物具有令人惊讶且出人预料的超乎人对这类 组合所预期的性质。令人惊讶地，现已发现这些佐剂组合物中的Quil A/胆固醇的杀病毒 性质已被消除。其适合用作冻干的经修饰的活病毒抗原的稀释剂。本文所述的佐剂组合 物可被构造成引发极有效的针对经细胞介导的免疫应答、体液免疫应答或此二者的免疫应 答。此外，通过使用这些佐剂配制物可大幅避免注射部位反应。该反应原性低于包含该组 合佐剂的数种个别组分的反应原性。此外，这些佐剂配制物提供长期贮存的能力。本申请人已发现当这些新颖的佐剂组合物与横跨大范围物种的一或多种大量不 同抗原组合时具有高度免疫原性。其可与一或多种病毒、细菌、寄生虫、重组蛋白质和合成 的肽抗原及其组合一起使用。该新颖的疫苗佐剂组合物可用于治疗性疫苗中以治疗癌症。因此，本发明提供佐剂、免疫原性组合物和疫苗组合物。此外，本发明提供用于制 造该组合物的方法。本发明亦提供该组合物于治疗疾病的用途。本发明亦提供其用于制备 下述药物的用途，所述药物用于针对疾病(特别是针对下述疾病)治疗受试者受试者。本 发明亦提供其用于制备用于预防或减轻受试者中疾病的药物的用途。本发明还提供了它们在制备下述药物中的用途，所述药物用于针对由猫白血病 病毒引起的感染治疗猫，针对禽球虫病(avian coccidiosis)治疗禽类，针对由大肠杆菌 (Escherichia coli)引起的疾病治疗牛，针对由牛病毒性腹泻病毒引起的疾病治疗牛，针 对由肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia)引起的疾病治疗猪，针对由猫流感病毒引起 的疾病治疗猫，受试者针对癌症治疗受试者，针对由犬冠状病毒(canine coronavirus)引 起的疾病治疗犬，针对由牛轮状病毒(bovine rotavirus)引起的疾病治疗牛，以及针对由 犬流感病毒引起的疾病治疗犬。本发明亦提供佐剂作为标记物疫苗来帮助确认已接受疫苗 接种的动物的用途。本发明亦提供CpG用于增强佐剂效果的用途。附图详述

图1展示了通过放射性免疫沉淀实验进行的凝胶电泳，其显示BVD病毒的NS2/3 蛋白和E2蛋白之间的抗体图谱。经I^reZent A处理的组显示对NS2/3蛋白以及E2蛋白二 者的抗体应答，而经Q⑶C及Q⑶CR处理的组则显示出仅对E2蛋白有抗体应答，对NS2/3蛋 白则无。发明详述定义当与可测量的数值变量相关联地使用时，“约”或“大约”是指所指示的变量值及 所有在所指示数值的实验误差内(如平均值的95%置信区间内)或所指示数值的10%内 (无论那一个数值较大)的变量值，除非“约”被用于表示以周计的间隔，其中“约3周”为 17至25天，而约2至约4周为10至40天。“佐剂”是指可增加对抗原的体液或细胞免疫应答的任何物质。佐剂通常被用于达成两种目的减缓抗原从注射部位释出及刺激免疫系统。“烷基”是指直链和支链的饱合烃部分。“胺”是指含氮的化学化合物。胺是通过以烃基团取代氢原子而从氨衍生的一类化 合物。“季胺”是指以铵为基础，带有4个烃基团的化合物。“抗体”是指可因为对抗原的免疫应答而与特异抗原结合的免疫球蛋白分子。免疫 球蛋白是由具有“恒定”及“可变”区的“轻”及“重”多肽链所组成的血清蛋白质，且根据该 恒定区的组成而区分为数类(如=IgA, IgD, IgE, IgG及IgM)。“抗原”或“免疫原”是指任何刺激免疫应答的物质。此名词包括被杀死的、灭活 的、减毒的或经修饰的活细菌、病毒或寄生虫。术语抗原亦包括个别的或其任何组合的多核 苷酸、多肽、重组蛋白质、合成的肽、蛋白质提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、多糖、或脂 质、或其片段。术语抗原亦包括抗体，诸如抗受试者遗传型抗体或其片段，以及可模拟抗原 或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟位(mimotopes)。“菌苗(bacterin)，，是指可作为疫苗或免疫原性组合物的组分使用的一或多种被 杀死的细菌的悬浮液。“缓冲液”是指防止另一种化学物质的浓度变化的化学系统，如质子供体及受体 系统可作为防止氢离子浓度(PH)明显改变的缓冲液。另一缓冲液例子为含有弱酸及其盐 (共轭碱)或弱碱及其盐(共轭酸)的混合物的溶液。“细胞性免疫应答”或“经细胞介导的免疫应答”为一种由T-淋巴细胞或其它白细 胞或此二者介导的免疫应答，其包括生产细胞因子、趋化因子及由活化的T细胞、白细胞或 此二者制造的类似分子。“胆固醇”是指化学式为C27H45OH的白色结晶型物质。其为一种被归类为脂质的环 状烃醇。其不溶于水，但可溶于多种有机溶剂中。“迟发型超敏反应(DTH) ”是指暴露于被免疫系统视为外来的抗原后M至72小时 时发展出的炎性应答。此类型的免疫应答主要涉及T细胞而非(由B细胞制造的)抗体。“剂量”是指给予受试者的疫苗或免疫原性组合物。“第一剂量”或“先发疫苗 (priming vaccine) ”是指在第0天给予的这类组合物的剂量。“第二剂量”或“第三剂量” 或“年剂量”是指在第一剂量之后给予的这类组合物的量，所述组合物可以是或不是与第一 剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。“乳化剂”是指用于使乳液更稳定的物质。“乳液”是指两种不相溶混的液体的组合物，其中一种液体的小滴悬浮于另一种液 体的连续相中。“酯类”是指与无机盐对应的任何一种类别的有机化合物，其系从有机酸单位与醇 分子的缩合反应(其中消除一水分子)形成。“赋形剂”是指任何非抗原的疫苗的组分。“勻化”是指将一或多种相似或不相似的组分混合成均勻的混合物的过程。“体液免疫应答”是指由抗体介导的免疫应答。“疏水性”是指不溶于水、不易吸收水分或受到水的不利影响；与水不相容或对其 亲和力低。受试者受试者中的“免疫应答”是指应答抗原的体液免疫应答、细胞性免疫应答或体液及细胞性免疫应答的发生。免疫应答通常可利用本领域已知的标准免疫分析及中和分 析来测定。抗原的“免疫保护量”或“免疫有效量”或“产生免疫应答的有效量”为可在接受者 体内有效诱导免疫原性应答的量。该免疫原性应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或 可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果 或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组 合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型 菌株攻击后通过监控征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量 例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少，温度数值，受试者总体生理状况及总体健 康和表现来评估。免疫应答可包括，但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。“免疫原性”是指激发免疫或抗原应答。因此，免疫原性组合物可为任何能诱导免 疫应答的组合物。“免疫刺激性复合物”或ISCOM是指当Quil A与胆固醇及磷脂组合时形成的特殊构造。“免疫刺激分子”是指产生免疫应答的分子。“脂质”是指任何不溶于水但溶于非极性有机溶剂中，触摸起来为油性，且与碳水 化合物及蛋白质一起构成活细胞的主要构造物质的任何有机化合物群组，包括脂肪、油、 蜡、固醇及三酸甘油脂。“亲脂性”是指显示出对脂质的显著亲和力或在脂质中显示显著的溶解度。“脂质体”是指由包围水性隔室的脂质双层形成的微小球形颗粒，其在医学上被用 于在体内携带药物、抗原、疫苗、酶或另一物质至靶向的细胞。“医疗剂(Medicinal agent) ”是指任何用于预防、治愈或改善疾病，或预防一些生 理状况或发病的药剂。“肠胃外施用”是指将物质(诸如疫苗)通过或经由不包括消化道在内的途径引入 受试者体内。肠胃外施用包括皮下、肌内、透皮、皮内、腹膜内、眼内及静脉内施用。“药学上可接受的”是指在明智的医疗判断下适合与受试者组织接触而无不当毒 性、刺激、变应原性应答等，与合理的利益对风险的比率匹配并对其预期用途有效的物质。“反应原性”是指受试者受试者中应答佐剂、免疫原性或疫苗组合物的施用所引出 的副作用。其可在施用部位发生，且通常就所发展出的症状数目来评估。这些症状可包括 发炎、发红及脓肿。其亦可就发生、持续时间及严重性来评估。例如“低度”反应将涉及仅 可通过触摸而非由目视检测到的肿胀，或持续时间短。较严重的反应为，例如可目视检测或 持续时间较长的反应。“室温”是指18至25°C的温度。“皂苷”是指一群源自植物的表面活性糖苷，其由与具有类固醇或三萜构造的疏水 区结合的亲水区(通常为数个糖链)所组成。“类固醇”是指易溶于有机溶剂而微溶于水的属于生化类别脂质的一群有机化合 物之任何。类固醇包含一个四-融合环系统，此环系统具有3个融合的环己烷(六碳)环 加第4个环戊烷(五碳)环。“固醇”是指动物体内从萜类前体生物制造的化合物。其包含具有羟基(OH)基团
12(通常附于碳-3上)的类固醇环构造。该脂肪酸取代基的烃链的长度不同，通常为16至 20个碳原子，且可为饱和或不饱和的。固醇通常在环构造中含有一或多个双键以及多种不 同的附于环的取代基。固醇及其脂肪酸酯类基本上不溶于水。“受试者”是指任何需要施用佐剂组合物的动物。其包括哺乳动物和非哺乳动物， 包括灵长类、家畜、伴侣动物、实验室试验动物、圈养的野生动物、鸟(包括卵)、爬行动物和 鱼。因此，该术语包括，但不限于猴子、人、猪；牛、绵羊、山羊、马、小鼠、大鼠、荷兰猪、仓鼠、 兔子、猫、犬、鸡、火鸡、鸭、其它禽类、青蛙和蜥蜴。"TCID5tl ”是指“组织培养感染剂量”且定义为感染50%指定批次的经接种的细胞培 养物时所需要的病毒稀释量。可使用多种方法来计算TCID5tl，包括本说明书全文中所使用的 斯皮尔曼-卡伯法(Spearman-Karber method)。斯皮尔曼-卡伯法的描述见B. W. Mahy&H. 0. Kangro, Virology Methods Manual, p.25-46(1996)。“治疗有效量”是指可在接受抗原或疫苗的受试者内诱导足以预防或减轻由于病 原体(诸如病毒或细菌)感染所引起的疾病的征兆或症状(包括不利的健康影响或其并发 症)的免疫应答的抗原或疫苗量。可以诱导体液免疫力或细胞介导的免疫力或体液与细胞 介导的免疫力二者。动物对疫苗的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析 来间接评估，或在以野生型菌株攻击后通过监控征兆或症状来直接评估。由疫苗提供的保 护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆诸如死亡率、发病率的减少，温度数值，总体 生理状况及总体健康和效能来评估。疫苗的治疗有效量可根据所使用的具体佐剂、所使用 的具体抗原或受试者的状况而有不同，且可由本领域技术人员决定。“治疗(treating) ”是指预防应用了此术语的病症、病况或疾病，或预防或减轻这 类病症、病况或疾病的一或多种症状。“治疗(treatment) ”是指如上述定义的“治疗(treating) ”的行为。“三萜”是指大量且多样的自六个五-碳异戊二烯O-甲基-1，3-丁二烯)单位衍 生的天然存在的有机分子，其可以上千种方法装配及修饰。其大部分为多环形构造，彼此的 差异在于官能基及其基本的碳骨架。这些分子可在所有种类的活物中找到。“疫苗”是指包含如本文定义的抗原的组合物。将疫苗施用给受试者可产生大致上 针对一种或多种特定疾病的免疫应答。治疗有效的疫苗量可根据所使用的具体抗原、或受 试者的状况而有不同，且可由本领域技术人员决定。组合物的组分三萜和CpGs适用于佐剂组合物的三萜可来自多种来源(自植物衍生或合成的等同物)，包括， 但不限于皂树、西红柿素、人参提取物、蘑菇及构造上类似于类固醇皂苷的生物碱糖苷。因 此，适合用于佐剂组合物中的三萜包括皂苷、角鲨烯及羊毛固醇。适合用于佐剂组合物中的 三萜的量取决于所使用的三萜的性质。然而，其使用量通常为每剂量约1微克至约5000微 克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约4000微克、每剂量约1微克至约3000微克、每剂 量约1微克至约2000微克及每剂量约1微克至约1000微克。其使用量亦可为每剂量约5 微克至约750微克、每剂量约5微克至约500微克、每剂量约5微克至约200微克、每剂量 约5微克至约100微克、每剂量约15微克至约100微克及每剂量约30微克至约75微克。若使用皂苷，该佐剂组合物通常含有来自皂树树皮的免疫活性皂苷馏分。该皂苷可为，例如Quil A或其它经纯化或部分纯化的皂苷制剂(其可商业获得)。因此，皂苷提 取物可以作为混合物或经纯化的个别组分(诸如QS-7、QS-17、QS-18及QS-21)来使用。在 一个实施方案中，Quil A为至少85%纯。在另一个实施方案中，Quil A为至少90%、91 %、 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,^； 99%纯。CpG ODN为最近报告的一类药物治疗剂，其特征为在特异性碱基-序列上下文 (CpG 基序(motif))出现未甲基化的 CG 二核苷酸。(Hansel TT, Barnes PJ(eds) :New Drugs for Asthma,Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger,2001,vol 31,pp 229-232，该文献通过引用并入本文)。这些CpG基序不存在于真核DNA (其中CG 二核苷酸 受遏制，且当存在时通常系经甲基化)中，但存在于可由这些CpG赋予免疫刺激性质的细菌 DNA中。这些免疫刺激性质包括诱导Thl型应答并大量释出IFN-A、IL-12及IL-18。CpG 0DN(长度为18-24bp)拥有类似于细菌DNA的免疫调节性质。细胞表面蛋白质可吸收这些 分子，得到不同结果。然而，通过载体诸如Q⑶C、Q⑶CR及其它本专利中所列举的组合，可显 著增强该免疫调节性质及CpG的吸收。适合用于佐剂组合物中的CpG的量系取决于所使用的CpG及预期物种的性质。然 而，其使用量通常为每剂量约1微克至约20毫克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约10 毫克、每剂量约1微克至约5毫克、每剂量约1微克至约4毫克、每剂量约1微克至约3毫 克、每剂量约1微克至约2毫克及每剂量约1微克至约1毫克。其使用量亦可为每剂量约5 微克至约750微克、每剂量约5微克至约500微克、每剂量约5微克至约200微克、每剂量 约5微克至约100微克、每剂量约10微克至约100微克、每剂量约15微克至约100微克及 每剂量约30微克至约75微克。固醇适合用于佐剂组合物的固醇包括β-谷固醇、豆固醇、麦角固醇、麦角钙化醇及胆 固醇。这些固醇为本领域公知并且可自市场上购得。例如胆固醇公开于Merck Index, 12th Ed.，p. 369中。适合用于佐剂组合物中的固醇的量取决于所使用的固醇的性质。然 而，其使用量通常为每剂量约1微克至约5000微克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约 4000微克、每剂量约1微克至约3000微克、每剂量约1微克至约2000微克及每剂量约1 微克至约1000微克。其使用量亦可为每剂量约5微克至约750微克、每剂量约5微克至约 500微克、每剂量约5微克至约200微克、每剂量约5微克至约100微克、每剂量约15微克 至约100微克及每剂量约30微克至约75微克。免疫调节剂佐剂组合物可还包括一或多种免疫调节剂，诸如季铵化合物(如DDA)及白介素、 干扰素或其它细胞因子。这些物质可自市场购得。适合用于佐剂组合物中的免疫调节剂的 量取决于所使用的免疫调节剂的性质及受试者。然而，其使用量通常为每剂量约1微克至 约5000微克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约4000微克、每剂量约1微克至约3000 微克、每剂量约1微克至约2000微克及每剂量约1微克至约1000微克。其使用量亦可为 每剂量约5微克至约750微克、每剂量约5微克至约500微克、每剂量约5微克至约200微 克、每剂量约5微克至约100微克、每剂量约15微克至约100微克及每剂量约30微克至约 75微克。在一特殊例子方面，含DDA的佐剂组合物可通过单纯将抗原溶液与新鲜制备的DDA 溶液混合来制备。
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聚合物佐剂组合物可还包括一或多种聚合物，诸如，例如DEAE葡聚糖、聚乙二醇和聚丙 烯酸，以及聚甲基丙烯酸(如CARBOPOL )。这类物质可自市场购得。适合用于佐剂 组合物中的聚合物的量取决于所使用的聚合物的性质。然而，其使用量通常为约0.0001% 体积比体积(ν/ν)至约75% ν/ν。在其他实施方案中，其使用量为约0. 001% ν/ν至约50% ν/ν、约 0. 005% ν/ν 至约 25% ν/ν、约 0. 01% ν/ν 至约 10% ν/ν、约 0. 05% ν/ν 至约 2% ν/ ν及约0. ν/ν至约0.75% ν/ν。在另一个实施方案中，其使用量为约0.02% ν/ν至约 0.4% v/v。DEAE-葡聚糖的分子大小可在50，OOODa至5，000, OOODa的范围内，或者，其可 在500，OOODa至2，000, OOODa的范围内。这些物质可自市场购得或可从葡聚糖制得。另一特殊例子为聚丙烯酸(如CARBOPOL 聚合物)，其平均当量为76。其 系从平均直径约0. 2至6. 0微米的初始聚合物颗粒制得。CARBOPOL 聚合物在水中可 膨胀至多达其原始体积的1000倍及其原始直径的10倍，以在暴露于PH环境高于羧酸化物 基团的PKa时形成凝胶。在较羧酸化物基团的PKa更高的PH下，该羧酸化物基团离子化， 导致负电荷基团间的排斥，使聚合物的膨胀增加。Th2刺激剂佐剂组合物可还包括一或多种Th2刺激剂，诸如，例如Bay R1005 及铝。适合 用于佐剂组合物中的Th2刺激剂的量取决于所使用的Th2刺激剂的性质。然而，其使用量 通常为每剂量约0. 01毫克至约10毫克。在其他实施方案中，其使用量为每剂量约0. 05毫 克至约7. 5毫克、每剂量约0. 1毫克至约5毫克、每剂量约0. 5毫克至约2. 5毫克及每剂量 约1毫克至约2毫克。一种特殊例子为BayR1005 ，其为一种化学名称为“N-(2-脱氧 基-2-L-亮氨酰氨基-β -D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰胺乙酸酯”的糖脂。其可 根据 Lockhoff，0. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30 :1611-1620 ；1991)中所找到的程序合成。 建议将其贮存在2-8°C的气密容器中。其化学或物理性质为轻微吸湿，不形成多形体，在温 度高达50°C的空气和光下以及环境温度下pH 2-12的水性溶剂中为化学上稳定。其为在水 溶液中形成胶束的两亲分子。抗原和疾病佐剂组合物可含有一或多种抗原。该抗原可为能在受试者中产生期望的免疫应答 的多种物质的任一。虽然单独的Quil A是杀病毒的，Quil A加上胆固醇在形成螺旋形胶束 时可解除Quil A的毒性(见，美国专利No. 7，122，191)。现已发现，本文所述的佐剂组合物 是非-杀病毒的、非溶血的或是溶膜的。因此，与这些佐剂组合物一起使用的抗原可为个别 的或其任何组合的一或多种病毒(灭活、减毒及经修饰的活病毒)、细菌、寄生虫、核苷酸、 多核苷酸、肽、多肽、重组蛋白质、合成的肽、蛋白质提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、多 糖、碳水化合物、脂肪酸、磷壁酸(teichioc acid)、肽聚糖、脂质、或糖脂。与本发明的佐剂一起使用的抗原亦包括核苷酸、多核苷酸、肽、多肽的免疫原性片 段，其可分离自本文中所提及的生物。不会在受试者中引起疾病的活病毒、经修饰的活病毒及减毒的病毒株已以非毒性 形式被分离，或已利用本领域公知的方法(包括在合适的细胞系中进行系列传代或暴露于 紫外线或化学诱变剂)减毒。灭活或被杀死的病毒株为那些已藉本领域技术人员已知的方 法(包括以福尔马林、β丙内酯(BPL)、二乙烯亚胺(BEI)、灭菌辐射、加热或其它这类方法处理)灭活的毒株。可将两种或多种抗原组合在一起以制造可保护针对由病原体引起的多种疾病来 保护受试者的多价组合物。目前，疫苗的商品制造者以及终端使用者偏好多价疫苗产品。虽 然常规佐剂通常受限于可与其一起有效使用的不同抗原(单价或多价)，但是本文所述的 佐剂可有效用于广泛的抗原(单价以及多价)中。因此，本文所述的抗原可合并在包含本 文所述的佐剂的单一组合物中。一些可作为抗原与佐剂组合物一起使用的细菌的例子包括，但不限于醋酸 丐 f 云力木干 (Aceinetobacter calcoaceticus)、 E T # $ JP Sl Sl ff ^ (Acetobacter paseruianus)、胸膜月市炎方文线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、嗜水气单 胞菌(Aeromonas hydrophila)> 月旨环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、 闪烁古球菌(Arhaeglobus fulgidus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪 芽孢掉菌(Bacillus stearothermophillus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 热链形芽孢杆菌(Bacillus thermocatenulatus)、支气管败血性博德特氏菌 (Bordetella bronchiseptica)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、谷伯 克霍尔德菌(Burkholderia glumae)、大肠弯曲菌(Campylobacter coli)、胎儿弯 曲菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、猪肠弯曲杆 菌(Campylobacter hyointestinalis)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼 衣原体(Chlamydia trachomatis)、衣原体属(Chlamydophila spp.)、黏性染色菌 (Chromobacterium viscosum)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathieae)、 单核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、犬埃立克体(Ehrlichia canis)、 大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、睡眠嗜血 菌(Haemophilus somnus)、猪螺杆菌(Helicobacter suis)、细胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)、口耆月市军团菌(Legionella pneumophilia)、莫氏木干菌属(Moraxellsa sp·)、牛分枝杆菌(Mycobactrium bovis)、猪月市炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、 丝状支原体亚种(Mycoplasma mycoides subsp. )、LC丝状菌(Mycoides LC)、产气荚膜梭 菌(Clostridium perfringens)、犬牙周臭味菌(Odoribacter denticanis)、溶血巴氏杆 |if (Pasteurella(Mannheimia)haemolytica) >^^rEiESIflii (Pasteurella multocida)、发 光光杆菌(Photorhabdus luminescens)、喉管口卜H|木单胞菌(Porphyromonas gulae)
口卜H|木单 1 (Porphyromonas gingivalis)、唾^夜口卜H|木单 1 (Porphyromonas salivosa) > 痤疫丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、威斯康 辛绿脓杆菌(Pseudomonas wisconsinensis)、绿脓杆菌、荧光假单胞菌C9 (Pseudomonas fluorescens C9)、荧光假单胞菌 SIKWl (Pseudomonas fluorescens SIKW1)、莓实假 单胞菌(Pseudomonas fragi)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、食油假单胞 菌(Pseudomonas oleovorans)、假单孢菌 Bll-1 (Pseudomonas sp B11-1)、富养产碱菌 (Alcaliges eutrophus)、不动嗜冷单胞菌(Psychrobacter immobilis)、普氏立克次体 (Rickettsia prowazekii)、立克次氏立克次体(Rickettsia rickettsia)、鼠伤寒沙门 氏菌(Salmonella typhimurium)、邦哥利沙门氏菌(Salmonella bongiri)、肠沙门氏菌 (Salmonella enterica)、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱 沙门氏菌(Salmonella choleraseuis)、纽波特沙门氏菌(Salmonella newport)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、钝顶螺方宠藻(Spirlina platensis)、金黄色葡萄球菌、表 皮葡萄球菌、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、 肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、除角质链 霉菌(Streptomyces exfoliates)、挤疫链霉菌(Streptomyces scabies)、嗜酸热硫化 叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、集胞藻属(Syechocystis 8卩.)、霍舌匕弧菌(Vibrio cholerae)、·{白氏舒lfe累旋菌(Borrelia burgdorferi)、齿密lfe累旋菌(Treponema denticola)、 小密螺旋菌(Treponema minutum)、噬齿密螺旋菌(Treponema phagedenis)、屈曲密螺旋菌 (Treponema refringens)、文氏密螺方宠菌(Treponema vincentii)、把密螺方宠体(Treponema palladium)及钩端螺旋体种(Leptospira species)，诸如已知的病原体犬钩端螺旋体 (Leptospira canicola) > ^ g1 MM^I^m WiMW (Leptospira grippotyposa) > Pp 端il旋体(Leptospira hardjo)、f専氏哈佐牛钩端il旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis)、t専氏哈佐普拉伊特 i若钩端 il 旋体(Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno) > H^i^^m^MW (Leptospira interrogans)、HH 出HMi本 (Leptospira icterohaemorrhagiae)、波莫纳钩端螺方宠体(Leptospira pomona)禾口布拉迪 斯拉发钩端螺旋体(Leptospira bratislava)，及其组合。灭活的病毒及减毒的活病毒可用于佐剂组合物中。一些可作为抗原使用的病毒例 子包括，但不限于鸟疱疹病毒、牛疱疹病毒、犬疱疹病毒、马疱疹病毒、猫病毒性鼻气管炎 病毒、马立克氏病病毒(Marek' s disease virus)、羊疱疹病毒、猪疱疹病毒、伪狂犬病病 毒、鸟副黏病毒、牛呼吸道合胞体病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、 牛副流感病毒3、羊副流感病毒3、牛疫病毒、边界病病毒(Border disease virus)、牛病毒 性腹泻病毒(BVDV)、I 型BVDV、II 型BVDV、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus)、 鸟白血病病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛结核病病毒、猪感染性贫血病毒、猫免疫 缺陷病毒、猫白血病病毒O^eLV)、新城疫病毒(Newcastle Disease virus)、羊进行性肺炎 病毒、羊肺腺癌病毒、犬冠状病毒(CCV)、泛嗜性CCV(pantr0picCCV)、犬呼吸道冠状病毒、 牛冠状病毒、猫杯状病毒、猫肠冠状病毒、猫感染性腹膜炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪凝血 性脑骨髓炎病毒、猪细小病毒、I型猪环病毒(PCV)、II型PCV、猪生殖及呼吸综合征(PRRS) 病毒、传染性胃肠炎病毒、火鸡冠状病毒、牛流行热病毒、狂犬病轮状病毒、水泡性口炎病 毒、慢病毒、鸟流感病毒、鼻病毒、马流感病毒、猪流感病毒、犬流感病毒、猫流感病毒、人流 感病毒、东方马脑炎病毒(EEE)、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗河病毒、西方马脑炎病毒、人 免疫缺陷病毒、人乳头状瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、鼻病毒和麻疹病毒，及 其组合。肽抗原的例子包括支气管败血性薄德特氏菌(Bordetella bronchis印tica)p68、 &iRH、IgE肽、Fel dl和癌症抗原，及其组合。其它抗原例子包括核苷酸、碳水化合物、脂质、 糖脂、肽、脂肪酸和磷壁酸和肽聚糖，及其组合。一些可作为抗原与佐剂组合物一起使用的寄生虫例子包括，但不限于无形体属 (Anaplasma)、肝片吸虫(Fasciola h印atica)(肝吸虫)、球虫、艾美球虫(Eimeria)属、犬 新孢子虫(Neospora caninum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、贾第虫(Giardia)、恶 Vi^ (Dirofilaria)(Ancylostoma) ( )(Trypanosoma spp.)、禾丨J什曼原虫属(Leishmania spp.)、毛滴虫属(Trichomonas spp.)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、巴贝西虫(Babesia)、血吸虫(Schistosoma)、练虫 (Taenia)、类圆线虫(Strongyloides)、蛔虫(Ascaris)、毛线虫(Trichinella)、肉孢子虫 (Sarcocystis)、哈蒙德虫(Hammondia)和等孢子球虫(Isopsora)，及其组合。亦考虑的有 外寄生虫，包括但不限于蜱(ticks)，包括硬蜱属(Ixodes)、扇头蜱属O^hipic印halus)、 革蜱属(Dermacentor)、钝眼蜱属(Amblyomma)、牛蜱属(Boophilus)、琉眼蜱属(Hyalomma) 和血蜱属(Haemaphysalis)，及其组合。用于诱导免疫应答的抗原量根据所使用的抗原性质、受试者及期望的应答水平将 有相当大的变化，且可由本领域技术人员决定。在含经修饰的活病毒或减毒病毒的疫苗方 面，抗原的治疗有效量通常在从约IO2组织培养感染剂量(TCID)5tl(含)至约IOiciTCID5ci(含) 的范围内。对许多这类病毒而言，治疗有效的剂量通常系在从约IO2TCID5tl(含)至约 IO8TCID50 (含)的范围内。在一些实施方案中，治疗有效的剂量通常系在约IO3TCID5tl (含)至 约IO6TCID5tl (含)的范围内。在一些其他实施方案中，治疗有效的剂量系在约IO4TCID5tl (含) 至约IO5TCID5tl(含)的范围内。就含有灭活病毒的疫苗而言，抗原的治疗有效量通常为每剂量至少约100个相对 单位，通常在每剂量约1，000至约4，500个相对单位的范围内。在其他实施方案中，抗原 的治疗有效量为每剂量约250(含)至约4，000个相对单位(含)、每剂量约500(含)至 约3，000个相对单位(含)、每剂量约750 (含)至约2，000个相对单位(含)，或每剂量约 1，000 (含)至约1，500个相对单位(含)。在含灭活的病毒的疫苗中，治疗有效量的抗原亦可按照每毫升的相对效力(RP) 测量。治疗有效量通常在每毫升约0.1(含)至约50冊(含)的范围内。在其他实施方案 中，抗原的治疗有效量的范围从每毫升约0.5(含)至约30ra(含)、每毫升约1(含)至约 25PR(含)、每毫升约2(含)至约(含)、每毫升约3(含)至约15PR(含)，或每毫升 约5(含)至约10PR(含)。在一个实施方案中，从持续受KT-FeLV-UCD-I猫白血病病毒株感染的FL74-UCD-1 细胞系(ATCC编号CRL-8012)中制造!^eLV抗原。疫苗中的!^eLV抗原量系以每毫升的gp70 病毒蛋白质量来测量。当通过每毫升的gp70病毒蛋白质量来测量时，！^eLV抗原的治疗有 效量通常在约100(含)至约350，000纳克/毫升(含)的范围内。在另一个实施方案中， 该范围从约1，000 (含)至约300，000纳克/毫升(含)，或从约2，500 (含)至约250，000 纳克/毫升(含)、或从约4，000(含)至约220，000纳克/毫升(含)、或从约5，000(含) 至约150，000纳克/毫升(含)、或从约10，000(含)至约100，000纳克/毫升(含)。在疫苗中施用的细菌抗原的细胞数为每剂量约1 X IO6 (含)至约5 X 101° (含)个 菌落形成单位(CFU)。在其他实施方案中，该细胞数范围为约1 X IO7 (含)至约5 X 101° (含) CFU/剂量、或约1X108(含)至约5X101(I (含)CFU/剂量。再还在其他实施方案中，该细胞 数范围为约1X102(含)至约5X 101°(含)CFU/剂量、或约1X104(含)至约5X109(含) CFU/剂量、或约IX IO5(含)至约5X109(含)CFU/剂量、或约1X106(含)至约5X109(含) CFU/剂量、或约1X106(含)至约5X108(含)CFU/剂量、或约1X107(含)至约5X109(含) CFU/剂量。在疫苗中施用的寄生虫抗原的细胞数为每剂量约1 X IO2 (含)至约1 X 101° (含)。 在其他实施方案中，该细胞数范围为约1XIO3(含)至约1 X IO9(含)、或约1 X IO4(含)至约1X108(含)、或约1X105(含)至约1X107(含)、或约1X106(含)至约1X108(含)。本领域公知，使用常规佐剂时与经修饰的活病毒或减毒病毒相比需要显著更大量 的灭活病毒来刺激可比较的血清学应答水平。然而，令人惊讶地发现，通过本文所述的佐剂 组合物，大约相同量的灭活病毒和经修饰的活病毒刺激类似的血清学应答水平。此外，当 与常规佐剂相比较时，使用本文所述的佐剂时，为实现相同的血清学应答水平需要更少量 的经修饰的活病毒、减毒病毒及灭活病毒。这些出人意料的发现证明在制备免疫原性组合 物和疫苗组合物期间保护资源并降低成本。在具有广泛用途的疫苗方面，每年需要制造数 百万个剂量，因此这些节约是重要的。赋形剂水性佐剂提供某些优点。其通常容易配制及施用，且可诱导很少或较少的严重注 射部位反应。然而，带有抗原的水性佐剂倾向从注射部位扩散，由受试者的肝脏清除并产生 不想要的非特异性免疫应答。令人惊讶地发现，本文所述的水性佐剂组合物可保持在注射 部位直到被生物代谢(这在很长的期间内发生)，并提供靶向的免疫应答。当作为佐剂的组分加入时，油通常提供长且缓慢的释出谱。本发明中，油可代谢或 不可代谢。油可为水包油、油包水或水包油包水乳液的形式。适合用于本发明的油包括烷、烯、炔，其对应的酸及醇，及其醚及酯，及其混合物。 油的个别化合物为轻烃化合物，即，这类组分具有6至30个碳原子。该油可合成制备或从 石油产物纯化。此部分可具有直链或支链构造。其可为完全饱和或具有一个或多个双键或 参键。用于本发明的一些不可代谢的油包括，例如矿物油、石蜡油及环烷烃。术语油亦欲包括“轻矿物油”，即以类似方法通过蒸馏石油取得，但其比重较白矿 物油稍低的油。可代谢的油包括可代谢的、无毒的油。油可为任何可被施用佐剂的受试者的身体 代谢且对受试者无毒性的植物油、鱼油、动物油或经合成制备的油。植物油的来源包括坚 果、种籽及谷粒。本发明提供的水包油乳液系由AMPHIGEN 配制物组成。此配制物包含水性组 分、卵磷脂、矿物油及表面活性剂。描述该配制物的组分的专利包括美国专利No. 5，084，269 和 US 6，572，861。典型地，本发明的油组分的存在量为至50% (以体积计)；或为10%至45% ； 或为20%至40%。组合物的其它组分可包括药学上可接受的赋形剂，诸如载体、溶剂和稀释剂、等张 剂、缓冲液、稳定剂、防腐剂、血管收缩剂、抗细菌剂、抗真菌剂等。典型的载体、溶剂和稀释 剂包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油、油等等。代表性的等张剂包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、 山梨糖醇、乳糖等等。有用的稳定剂包括明胶、白蛋白等等。表面活性剂被用于协助稳定被选择作为佐剂和抗原的载体的乳液。适合用于本发 明的表面活性剂包括天然的生物相容的表面活性剂和非天然的合成的表面活性剂。生物相 容的表面活性剂包括磷脂化合物或磷脂的混合物。优选的磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂)，诸 如大豆或卵的卵磷脂。通过水洗粗制植物油，再将得到的水合胶分开并干燥，可取得作为磷 脂与三酸甘油酯的混合物的卵磷脂。通过在丙酮清洗移除三酸甘油酯和植物油后，将剩余 的不溶于丙酮的磷脂与甘油脂的混合物分馏，可取得精制的产物。或者，可从不同的商品来
19源取得卵磷脂。其它合适的磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心磷 脂及磷脂酰乙醇胺。磷脂可从天然来源分离出或以常规方式合成。适合用于本发明的非天然的合成表面活性剂包括基于脱水山梨糖醇的非离 子性表面活性剂，如经脂肪酸取代的脱水山梨糖醇表面活性剂(可以名称SPAN 或ARLACEL 商业获得)、聚乙氧基化山梨糖醇的脂肪酸酯(TWEEN )、来自诸 如蓖麻油的来源的脂肪酸的聚乙二醇酯(EMULFOR )、聚乙氧基化的脂肪酸(如 可以名称SIMULS0LM-53 取得的硬脂酸)、聚乙氧基化的异辛酚/甲醛聚合物 (TYLOXAPOL )、聚氧乙烯脂肪醇醚(BRIJ )、聚氧乙烯壬苯基醚(TRITON N)、聚 氧乙烯异辛苯基醚(TRITON X)。一般而言，若使用两种或更多表面活性剂时，表面活性剂或表面活性剂的组合 在乳液中的存在量为以体积计0. 01 %至10 %，优选地0. 1 %至6. 0 %，更优选地0. 2 %至 5. 0%。本文所使用的“药学上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂覆层、佐 剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂、吸收延迟剂等等。载体在可与组 合物的其它组分兼容且对受试者无害方面必须为“可接受的”。典型地，载体应为无菌且不 含病原体，并根据欲使用的施用模式选择。本领域技术人员已知包含组合物的药学上可接 受的载体的优选配制物为美国(UQ农业部或美国食品药物管理局或在非美国国家中的同 等政府机构所发布的适用规则所核准的药物载体。因此，用于组合物的商业生产中的药学 上可接受的载体为已被美国或外国的适当政府机构核准或将要核准的载体。组合物任选地可包含作为药学载剂、赋形剂或介质发挥作用的，相容的药学上可 接受(即，无菌或非毒性)的液体、半固体或固体稀释剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、 乙醇、甘油等等。等张剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖及其他。稳定剂包 括白蛋白及其他。组合物亦可含有抗生素或防腐剂，包括，例如庆大霉素、硫柳汞、或氯甲酚。本领 域技术人员公知可用于选择的不同类别的抗生素或防腐剂。组合物的制备方法佐剂配制物的制备方法ISCOM可通过组合皂苷、固醇及磷脂来制备。例如ISCOM可含有以重量计5%至 10%的Quil A、l%至5%的胆固醇和磷脂，以及剩余部分的蛋白质。佐剂配制物中皂苷对 固醇的比例典型地为1 100 (重量对重量)(w/w)至5 1 (w/w) 0在一些实施方案中存 在过量的固醇，其中皂苷对固醇的比例为至少1 2(w/w)，或1 5(w/w)。在其他实施方 案中，皂苷相对于固醇而言为过量，并使用的皂苷对固醇的比例为约5 1 (w/w) 0 ISCOM及 ISC0MATRIX 可自 Isconova AB (瑞典)购得。在一些实施方案中，CARBOPOL 与DDA组合使用，其使用量为每重量份的DDA 至少使用0.1重量份的CARBOPOL 。在其他实施方案中，每重量份的DDA至少使用 0. 5重量份的CARBOPOL 。还在其他实施方案中，每重量份的DDA至少使用1重量份的 CARBOPOL 。CARBOPOL 与DDA组合形成复合物，藉此，DDA叔胺官能基将使聚合 物上的羧酸侧基团免疫官能化。这可令特定的免疫细胞同时靶向抗原及佐剂，且在最适的 时间和浓度下将抗原及佐剂共同投递至所述细胞。
本文所述的佐剂通常不需要任何特殊载体，且将调制在水性或其他药学上可接受 的缓冲液中。在一些情况下，公开的实施方案的疫苗将存于合适的载剂中，诸如，例如另外 的脂质体、微球或经包囊的抗原颗粒。该抗原可包含在囊泡膜中或包含在囊泡膜外。一般 而言，可溶性抗原在囊泡膜外，疏水性或经脂化的抗原包含在囊泡膜内或外。根据施用途径、贮存需要等等，可将佐剂组合物制成多种不同的形式。例如，其可 制成适合注射用的无菌水溶液或分散液形式，或利用冻干、真空干燥或喷雾干燥技术制成 冻干形式。冻干的组合物可在使用前于稳定化溶液例如盐水或HEPES中重建。因此，佐剂 组合物可以作为固体、半固体或液体剂型使用。佐剂可利用本领域已知的技术制备。例如可将皂苷与胆固醇在合适的清洁剂中 混合，再通过溶剂萃取技术形成脂质体或ISC0M。亦可如美国专利案No. 7，122，191中所述， 将皂苷与胆固醇组合以形成螺旋形胶束。磷酸盐缓冲盐水(PBS)可作为水性缓冲介质使用；该缓冲液的PH值可为中性或微 碱性或微酸性。因此，PH值可在pH 6至8的范围内。pH值一般为约7. 0至约7. 3。缓冲 液的强度可介于10至50mM PO4及10至150mM PO4之间。在一个例子中使用0. 063% PBS0 PH值可依需要利用NaOH或HCl调整。典型的浓度包括IN至ION HCl及IN至ION的NaOH。
所使用的佐剂量系取决于所使用的抗原及期望施用的抗原剂量。其亦取决于计划 的物种及所需的配制物。通常，佐剂的量在常规佐剂用量的范围内。例如在1毫升剂量 中，佐剂典型地包含约1微克(含)至约1000微克(含)。类似地，在1毫升剂量中，抗生 素典型地包含约1微克(含)至约60微克(含)。可将佐剂配制物勻化或微射流勻化(microfluidizing)。对配制物进行初级混合 步骤，这典型地通过将配制物通过一个或多个勻化器一次或多次来实现。任何可购得的勻 化器均可用于此目的，如Ross乳化器(Hauppauge，纽约)、Gaulin 勻化器(Everett，ΜΑ) 或Microfluidics (Newton，ΜΑ)。在一个实施方案中，将配制物在10，OOOrpm勻化3分钟。通 过使用市售的微射流机(诸如自Microfluidics (Newton，麻州)取得的型号IlOY ；Gaul in 30CD 型(Gaulin 公司，Everett，MA)；及 Rainnie Minilab 8· 30H 型(Miro Atomizer Food and Dairy公司，Hudson，威斯康星州))可实现微射流勻化。这些微射流勻化器通过在高压 下将流体用力推过小孔隙来操作，从而使二种流体流在交互作用室中以高速交互作用，形 成具有次微米大小的液滴的组合物。在一个实施方案中，将配制物在10，000+/-500psi下 通过200微米的限制尺寸室来将其微射流勻化。本文所述的佐剂组合物可被勻化并且微射流勻化。在一个实施方案中，将抗原加 入合适的缓冲液中。搅拌溶液并将皂苷慢慢加入抗原溶液中。然后，将固醇慢慢加入抗原 /皂苷溶液中，再将季铵化合物慢慢加入抗原/皂苷/固醇溶液中。将得到的组合物勻化， 再微射流勻化。微射流勻化后，将聚合物加入微射流勻化组合物中。根据所使用的组分，可 改变这些步骤的次序，以将组合物的制备过程最优化。免疫原性组合物和疫苗组合物的制备方法本文所述的佐剂组合物可用于制备免疫原性组合物和疫苗组合物。在疫苗或免疫 原性组合物方面，各剂量含有治疗有效量的一种或多种抗原，此量根据受试者的年龄和一 般状况、施用途径、抗原性质及其它因素而有所变化。疫苗或免疫原性组合物中的其它组分 的量和浓度可经调整以修饰组合物的物理及化学性质，且可由本领域技术人员轻易测出。
21佐剂组合物的有利性质为其可完全根据该组合物的所需特征来构建。例如若需要较强的 Thl应答，则可增加Thl刺激剂的量。同样地，若需要较强的Th2应答，则可增加Th2刺激剂 的量。亦可取得平衡的Thl/Th2应答。免疫原性组合物和疫苗组合物亦可依上述方法勻化 或微射流勻化。组合物的施用和用途组合物的施用根据受试者及抗原，组合物的剂量大小典型地在约1毫升(含)至约5毫升(含) 的范围内。例如在犬或猫方面典型地使用约1毫升的剂量，而在牛方面典型地使用约2至 5毫升。然而，这些佐剂亦可配制成微小剂量，其中可使用约100微升的剂量。佐剂组合物的施用途径包括肠胃道外、口、口鼻、鼻内、气管内、局部及卵内等途 径。任何合适的装置均可用来施用组合物，包括注射器、滴管、无针注射装置、贴片等等。被 选用的途径及装置取决于佐剂组合物、抗原及受试者，这些是本领域技术人员公知的。组合物的用途用于商业用途的任何疫苗佐剂制剂的要求之一是建立佐剂溶液的稳定性以供长 期贮存。本文中提供了容易制造且可保持稳定至少18个月的佐剂配制物。在一个实施方 案中，该配制物可保持稳定约18个月。在另一个实施方案中，该配制物可保持稳定约18至 约24个月。在另一个实施方案中，该配制物可保持稳定约M个月。加速测试程序亦指出 本文所述的配制物是稳定的。本发明的佐剂组合物的一个有利特性是，其可安全且有效地施用很多种受试者。 本领域中预期佐剂的组合将显示出较个别组分更强的反应原性。然而，当与其中使用任何 一种或二种组分的组合物相比较时，本文所述的组合物显示出降低的反应原性，同时仍保 持佐剂的效果。还令人惊讶地发现，当与其它佐剂组合物相比较时，本文所述的佐剂组合物 显示出安全性改善。本文所述的佐剂组合物可用于在受试者内产生所需的免疫应答。其在多种物种中 均有效。任何需要施用佐剂组合物的动物均为合适的受试者。其包括哺乳动物及非哺乳动 物，包括灵长类、家畜、伴侣动物、实验室试验动物、圈养野生动物、鸟类(包括卵)、爬行动 物及鱼。因此，该术语包括，但不限于猴子、人、猪；牛、绵羊、山羊、马、小鼠、大鼠、荷兰猪、 仓鼠、兔子、猫、犬、鸡、火鸡、鸭、其它禽类、青蛙和蜥蜴。本文所述的佐剂可用于显示受感染与已接种疫苗的动物间的血清学差异。因此， 其可在标记物疫苗中使用，其中所述疫苗中的抗原可在已接种经疫苗的动物中引发与野生 型病毒不同的抗体模式)。标记物疫苗通常与伴随诊断试验(其测量抗体模式中的差异并 证明何种动物已接受疫苗接种，何种动物被野生型病毒感染)一起使用。这类技术可用于 控制及消灭来自受试者种群的病毒。下列实施例作为阐述性实施方案展示，但不应被用来限制本发明的范围。本领域 技术人员可明白本发明的许多改变、变化、修饰及其它用途及应用。
实施例实施例1. Quil A/胆固醇(QC)溶液将Quil A(Superfos)溶解在水中，制备50毫克/毫升的储备溶液。将胆固醇(Fabri Chem he.)溶解在乙醇中，制备18毫克/毫升的储备溶液。然后，利用0. 2微米滤 器过滤胆固醇储备溶液。不同配制物中Quil A和胆固醇的浓度范围可从Quil A对胆固醇低至1/1 (微克 /毫升)到高达1000/1000(微克/毫升)。为了制备50/50(微克/毫升)的Quil A/胆 固醇储备溶液，用水将Quil A储备溶液稀释成50微克/毫升的浓度。一边搅拌此溶液，一 边慢慢加入胆固醇储备溶液，使最终浓度为50微克/毫升。实施例2. DDA (D)溶液将二甲基双十八烷基溴化铵(DDA ；Fluka Analytical)溶解在乙醇中，制备18毫 克/毫升的储备溶液。利用0. 2微米滤器过滤DDA储备溶液。实施例3. Quil A/胆固醇/DDA⑴⑶)溶液依实施例1制备具所需浓度的Quil A/胆固醇储备溶液。依实施例2制备DDA储 备溶液并将其慢慢加入Quil A/胆固醇储备溶液中。将溶液混合以取得所需的最终浓度。 依需要以NaOH或HCl调整该溶液的pH值以取得所需的最终pH(通常在约6. 9至约7. 5的 范围内)。实施例4. CARBOPOL (C)溶液将CARBOPOL (Noveon，墨西哥)溶解在去离子水中，制备1. 5%的储备溶液。 在另一个实施方案中，将CARBOPOL 溶解在去离子水中，制备0. 75%的储备溶液。实施例5. DDA/ CARBOPOL (DC)溶液依实施例2制备DDA储备溶液。依实施例4制备0. 75 %的CARBOPOL 储备 溶液。将溶液混合以取得所需的最终浓度。实施例6. Quil A/ 胆固醇 /DDA/ CARBOPOL ^CDC)溶液依实施例3制备Quil A/胆固醇/DDA储备溶液。依实施例4制备0. 75 %的 CARBOPOL 储备溶液。将CARBOPOL 储备溶液慢慢加入QuilA/胆固醇/DDA储 备溶液中，以取得所需的最终浓度。以NaOH或HCl调整该溶液的pH值以取得所需的最终 PH(通常在约6. 9至约7. 5的范围内)。实施例7. Bay R1005 (R)溶液为了制备Bay R1005 储备溶液，将糖脂N-Q-脱氧基-2-L-亮氨酰氨 基-β-D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰胺溶解在乙醇(60%，v/v)中。然后，加入吐 温20及冰醋酸。在一个实施例中，将3. 49gm的N- (2-脱氧基-2-L-亮氨酰氨基-β -D-吡 喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰胺溶解在44. 64毫升的乙醇/水(60%，v/v)中。将此溶 液与1. 12毫升吐温20及0. 68毫升冰醋酸合并。实施例8. Quil A/ 胆固醇 /DDA/ CARBOPOL /Bay Rl005 ^CDCR)溶液依实施例6制备Quil A/胆固醇/DDA/CARBOPOL 储备溶液。依实施 例7制备Bay Rl005 储备溶液。将Bay Rl005 溶液慢慢加入Quil A/胆固醇/ DDA/ CARBOPOL 溶液中，以取得所需的最终浓度。依需要，以NaOH或HCl调整该溶液 的PH值以取得所需的最终pH(通常在约6. 9至约7. 5的范围内)。实施例9. DEAE葡聚糖溶液(X)将200毫克/毫升的DEAE葡聚糖溶解在水中以制备DEAE葡聚糖(X)储备溶液。 可将此溶液在摄氏120度(C)高压灭菌约20分钟。
实施例10. Quil A/ 胆固醇 /DDA/DEAE 溶液 ^CDX)依实施例3制备Quil A/胆固醇/DDA储备溶液。依实施例9制备DEAE储备溶液。 将溶液直接加入勻化器中以将其合并。混合时使用大于1000秒-1的剪力，利用闪蒸混合 法(flash blending method)进行。混合如下进行将水性溶液直接送入含有非极性佐剂 和抗原组分的油相中并搅拌至取得均勻稳定的混合物。典型地，根据所需的颗粒大小此步 骤可能为至少几分钟或更久。实施例11.油组合物(0)将Drakeol矿物油与吐温85及司盘85 (Span85)合并，加热至约55°C，冷却后再进 行无菌过滤，以制备油储备溶液。因此，此混合物包含用于基于油的载体的油相基质组分。 若选择胆固醇和/或DDA作为这些组合物之一的协作免疫调节剂，则在过滤前亦将其加入 此混合物中，因其可溶于油相中。实施例12. Quil A/ 胆固醇 /DDA/DEAE 溶液 ^CK(O)依实施例10制备Quil A/胆固醇/DDA/DEAE储备溶液。依实施例11制备油贮存 组合物。该溶液是Quil-A、DEAE葡聚糖和水的组合，以实现所述浓度下的量。将反应物在 室温或更高的温度下持续搅拌数分钟或更久以混合水相，然后进行无菌过滤并贮存，以供 加入油相中。将水相慢慢加入持续混合的油相中。实施例13.免疫原性组合物或疫苗组合物的制备方法为了制备包含抗原及一种上述佐剂的免疫原性组合物或疫苗组合物，将所需抗原 加入合适的缓冲液中。然后，依上述加入所需佐剂的组分。用缓冲液使得到的溶液达到最 终体积。实施例13a.抗原、Quil A、胆固醇、DDA、CARBOPOL 为了制备包含抗原、Quil A、胆固醇、DDA及CARBOPOL 的免疫原性组合物或 疫苗组合物，将所需抗原加入合适的缓冲液中。依实施例1制备Quil A储备溶液，将其慢慢 加入该抗原溶液中。依实施例1制备胆固醇储备溶液并将其慢慢加入该抗原/Quil A溶液 中。依实施例2制备DDA储备溶液并将其慢慢加入该抗原/Quil A/胆固醇溶液中。将抗原 /Quil A/胆固醇/DDA/溶液勻化及微射流勻化。依实施例4制备0.75%CARBOPOL 溶液。微射流勻化后，将CARBOPOL 溶液(0.05%，ν/ν)加入经微射流勻化的组合物 中，以NaOH或HCl将ρΗ值调整为约6. 9至约7. 5。实施例13b.抗原、Quil A、胆固醇、DDA、CARBOPOL 、BayR1005 为了制备包含抗原、Quil A、胆固醇、DDA、CARBOPOL 及BayR1005 的免疫
原性组合物或疫苗组合物，将所需抗原加入合适的缓冲液中。依实施例1制备Quil A储备 溶液并将其慢慢加入该抗原溶液中。依实施例1制备胆固醇储备溶液并将其慢慢加入该抗 原/Quil A溶液中。依实施例2制备DDA储备溶液并将其慢慢加入该抗原/Quil A/胆固醇 溶液中。将抗原/Quil A/胆固醇/DDA/溶液勻化及微射流勻化。依实施例4制备0.75% CARBOPOL 溶液。微射流勻化后，将CARBOPOL 溶液(0. 05% ν/ν)加入微射流勻 化组合物中，以NaOH或HCl将ρΗ值调整为约6. 9至约7. 5。依实施例7制备Bay Rl005 储备溶液，在加入DDA后，将Bay Rl005 组分加入水相中。实施例13c.抗原、Quil A、胆固醇、DDA、DEAE葡聚糖
为了制备包含抗原、Quil A、胆固醇、DDA及DEAE葡聚糖的免疫原性组合物或疫苗 组合物，将所需抗原加入合适的缓冲液中。依实施例1制备Quil A储备溶液并将其慢慢加 入该抗原溶液中。将组合物勻化。依实施例1制备胆固醇储备溶液并在勻化期间将其慢慢 加入抗原/Quil A溶液中。依实施例2制备DDA储备溶液并在勻化期间将其慢慢加入该抗 原/Quil A/胆固醇溶液中。依实施例9制备DEAE葡聚糖溶液。在勻化期间加入DEAE葡 聚糖溶液并使得到的组合物达到最终体积。实施例13d.抗原、Quil A、胆固醇、DDA、DEAE葡聚糖、油为了制备包含抗原、Quil A、胆固醇、DDA、DEAE葡聚糖及油的免疫原性组合物或疫 苗组合物，将所需抗原加入合适的缓冲液中。依实施例1制备Quil A储备溶液并将其慢慢 加入该抗原溶液中。将组合物勻化。依实施例1制备胆固醇储备溶液并在勻化期间将其慢 慢加入抗原/Quil A溶液中。依实施例2制备DDA储备溶液并在勻化期间将其慢慢加入该 抗原/Quil A/胆固醇溶液中。依实施例9制备DEAE葡聚糖溶液。在勻化期间，加入DEAE 葡聚糖溶液。依实施例11制备油组合物。勻化期间，通过将水相加入油相中同时勻化来加 入油组合物，并使得到的组合物达到最终体积。实施例14.猫白血病病毒O^eLV)疫苗利用随机化完全区组设计(Randomized complete block design)将动物随机分 配至处理组。表1显示该研究设计。区组以生日及胎次为基础。先根据生日，再根据胎次 将动物分类。使用4个区组。同一区组内随机指定动7物所接受的治疗。在研究的疫苗接 种阶段方面，将二个连续区组组合以形成含8只动物的组别。将各动物组随机分配至二个 房间，使每个房间含有5组(10个区组)动物。在一组动物中，将动物随机分配至彼此靠近 的四个笼子内，使每个笼子内包含二只接受相同治疗的动物。在研究的攻击阶段方面，将来 自一个疫苗接种室的动物随机分配至一或二个攻击室。被选择为分成二个攻击室的疫苗接 种室具有五个随机分配至各个攻击室的区组(2. 5组；20只动物)。另一攻击室包含十个区 组(5组；40只动物)。在一个攻击室内将同一区组的动物随机分配至四个彼此靠近的笼子 内。依实施例13制备用于此研究的疫苗，但使用1. 5%的CARBOPOL 储备溶液。 特定地，在经!^LV转化的淋巴样细胞中繁殖!^eLV次群体A、B及C以制备LEUKOCELL 2 (Pfizer, Inc.) 0将病毒抗原以化学方式灭活，与无菌佐剂组合以增强免疫应答，并以 液体形式包装。制备总量为100毫升，含有猫白血病病毒及25微克Quil A/氢氧化铝 (ALHYDROGEL )的研究用兽医制品 anvestigational Veterinary Product, I VP)。 将总计94. 5毫升的1. 106X IO5纳克/毫升!^eLV储备溶液慢慢混合15分钟。若需要，以 4NHC1或18% NaOH将pH值调整为5. 9至6. 1。一边搅拌，一边将0. 5毫升的5. 0毫克/毫升 Quil A溶液加入抗原溶液中。然后慢慢加入5. 0毫升的100% (v/v) ALHYDROGEL 。 将组合物在4°C下搅拌至少2小时。依需要，以18% NaOH或IN HCl将pH值调整为7. 0至 7. 3。依用于25微克Quil A IVP的相同方式制备包含猫白血病病毒及37. 5微克Quil A/氢氧化铝(ALHYDROGEL )的IVP，但向该抗原溶液中加入7. 5毫升的Quil A储备 溶液。制备总量为350毫升，含有猫白血病病毒、Quil A、胆固醇、DDA及CARBOPOL
25的研究用兽医制品(IVP)。一边搅拌349. 3毫升的1.106 X IO5纳克/毫升!^eLV储备溶液， 一边将0. 14毫升的50.0毫克/毫升Quil A溶液慢慢加入该抗原溶液中。然后，慢慢加入 0. 39毫升的18毫克/毫升胆固醇/乙醇溶液。将组合物在10，OOOrpm勻化3分钟。一边 搅拌，一边将总量为0. 19毫升的18. 0毫克/毫升DDA/乙醇溶液加入该组合物中。将总量 为5. 0毫升的1. 5%CARBOPOL 溶液慢慢加入145. 0毫升的猫白血病病毒、QuilAJi 固醇及DDA组合物中。依需要，以18% NaOH或IN HCl将pH值调整为7. 0至7. 3。表1:实验设计
权利要求
1.免疫原性组合物，其包含佐剂配制物及免疫有效量的抗原成分，其中所述佐剂配制 物包含皂苷、固醇、季铵化合物及聚合物。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷的存在量为每剂量约1微克 至约5，000微克，所述固醇的存在量为每剂量约1微克至约5，000微克，所述季铵化合物的 存在量为每剂量约1微克至约5，000微克且所述聚合物的存在量为约0. 0001%体积比体积 (ν/ν)至约 75% ν/ν。
3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述皂苷为QuilA或其经纯化的馏 分，所述固醇为胆固醇，所述季铵化合物为二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)且所述聚合物 为聚丙烯酸。
4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其还包含Th2刺激剂。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述Th2刺激剂为糖脂。
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述Th2刺激剂为N-(2-脱氧 基-2-L-亮氨酰氨基-β -D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰胺乙酸酯。
7.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述糖脂的存在量为每剂量约0.01毫 克至约10毫克。
8.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包含灭活的病毒。
9.制备根据权利要求1所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括a)在缓冲液中制备所述抗原成分的组合物；b)将所述皂苷加入步骤a的组合物中；c)将所述固醇加入步骤b的组合物中；d)将所述季铵化合物加入步骤c的组合物中；e)将所述聚合物加入步骤d的组合物中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述皂苷为QuilA或其经纯化的馏分，所述固醇 为胆固醇，所述季铵化合物为DDA且所述聚合物为聚丙烯酸。
11.根据权利要求9所述的方法，其还包括下述步骤将步骤a的组合物勻化，并在步 骤a至d的每个步骤期间持续勻化。
12.根据权利要求11所述的方法，其还包括下述步骤，所述步骤包括将步骤d的组合物 微射流勻化。
13.根据权利要求9所述的方法，其还包括步骤f)将Th2刺激剂加入步骤e的组合物中。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述Th2刺激剂为糖脂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述Th2刺激剂为N-(2-脱氧基-2-L-亮氨酰 氨基- β -D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰胺乙酸酯。
16.疫苗组合物，其包含佐剂配制物及治疗有效量的抗原成分，其中所述佐剂配制物包 含皂苷、固醇、季铵化合物及聚合物。
17.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述皂苷的存在量为每剂量约1微克至 约5，000微克，所述固醇的存在量为每剂量约1微克至约5，000微克，所述季铵化合物的存 在量为每剂量约1微克至约5，000微克且所述聚合物的存在量为约0. 0001% ν/ν至约75%
18.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述皂苷为QuilA或其经纯化的馏分， 所述固醇为胆固醇，所述季铵化合物为DDA且所述聚合物为聚丙烯酸。
19.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其还包含Th2刺激剂。
20.根据权利要求19所述的疫苗组合物，其中所述Th2刺激剂为糖脂。
21.根据权利要求20所述的疫苗组合物，其中所述Th2刺激剂为N-(2-脱氧基-2-L-亮 氨酰氨基- β -D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰胺乙酸酯。
22.根据权利要求20所述的疫苗组合物，其中所述糖脂的存在量为每剂量约0.01毫克 至约10毫克。
23.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含灭活的病毒。
24.制备根据权利要求16所述的疫苗组合物的方法，所述方法包括a)在缓冲液中制备所述抗原成分的组合物；b)将所述皂苷加入步骤a的组合物中；c)将所述固醇加入步骤b的组合物中；d)将所述季铵化合物加入步骤c的组合物中；e)将所述聚合物加入步骤d的组合物中。
25.根据权利要求M所述的方法，其中所述皂苷为QuilA或其经纯化的级分，所述固 醇为胆固醇，所述季铵化合物为DDA且所述聚合物为聚丙烯酸。
26.根据权利要求M所述的方法，其还包括下述步骤将步骤a的组合物勻化，并在步 骤a至d的每个步骤期间持续勻化。
27.根据权利要求沈所述的方法，其还包括下述步骤，所述步骤包括将步骤d的组合物 微射流勻化。
28.根据权利要求M所述的方法，其还包括将Th2刺激剂加入步骤e的组合物中的步 骤f)。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述Th2刺激剂为糖脂。
30.根据权利要求观所述的方法，其中所述Th2刺激剂为N-(2-脱氧基-2-L-亮氨酰 氨基- β -D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰胺乙酸酯。
31.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其还包含油。
32.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其还包含油。
33.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包含猫白血病病毒。
34.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法，其中所 述抗原成分包含猫白血病病毒。
35.根据权利要求16至23中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含猫白血病病毒。
36.根据权利要求35所述的疫苗组合物，其中所述猫白血病病毒的存在量为约100纳 克/毫升(含)至约350，000纳克/毫升(含)。
37.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含由持续受 KT-FeLV-UCD-I猫白血病病毒株感染的FL-74细胞系所制造的gp70。
38.针对由猫白血病病毒引起的感染来治疗猫的方法，所述方法包括对所述猫施用根据权利要求35所述的疫苗组合物。
39.如权利要求35所述的疫苗组合物在制备下述药物中的用途，所述药物用于针对由 猫白血病病毒引起的感染来治疗猫。
40.用于卵内施用的禽球虫病疫苗，其包含(a)佐剂，所述佐剂包含QuilA或其包括QS21在内的经纯化的馏分、胆固醇、 CARB0P0L、DDA 及 R1005 ；及(b)选自下列的原生动物抗原(1)一或多种经重组表达的蛋白质，( 一或多种通过 常规手段从所述原生动物分离的蛋白质或其它大分子，及(3)来自所述原生动物的全细胞 提取物或制剂。
41.根据权利要求1至7及31中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包 含大肠杆菌J-5株菌苗。
42.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法，其中所 述抗原成分包含大肠杆菌J-5株菌苗。
43.根据权利要求16至22及32中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含 大肠杆菌J-5株菌苗。
44.针对由大肠杆菌引起的感染来治疗牛的方法，所述方法包括对所述牛施用根据权 利要求43所述的疫苗组合物。
45.根据权利要求43所述的疫苗组合物在制备下述药物中的用途，所述药物用于针对 由大肠杆菌引起的感染来治疗牛。
46.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包含牛病 毒性腹泻病毒(BVDV)。
47.根据权利要求46所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包含1型 BVDV (BVDV-I)及 2 型 BVDV(BVDV_2)。
48.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法，其中所 述抗原成分包含BVDV。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述抗原成分包含BVDV-I及BVDV-2。
50.根据权利要求16至23中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含BVDV。
51.根据权利要求50所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含BVDV-I及BVDV-2。
52.针对由BVDV引起的感染来治疗牛的方法，所述方法包括对所述牛施用根据权利要 求50或51所述的疫苗组合物。
53.根据权利要求50或51所述的疫苗组合物于制备下述药物的用途，所述药物用于针 对由BVDV引起的感染来治疗牛。
54.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包含猪肺 炎支原体(M. hyopneumonia)。
55.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法，其中所 述抗原成分包含猪肺炎支原体。
56.根据权利要求16至22中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含猪肺炎 支原体。
57.针对由猪肺炎支原体引起的感染来治疗猪的方法，所述方法包括对所述猪施用根据权利要求56所述的疫苗组合物。
58.根据权利要求56所述的疫苗组合物于制备下述药物的用途，所述药物用于针对由 猪肺炎支原体引起的感染来治疗猪。
59.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包含猫流 感病毒(FIV)。
60.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法，其中所 述抗原成分包含FIV。
61.根据权利要求16至23中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含FIV。
62.针对由FIV引起的感染来治疗猫的方法，所述方法包括对所述猫施用根据权利要 求61所述的疫苗组合物。
63.根据权利要求61所述的疫苗组合物于制备下述药物的用途，所述药物用于针对由 FIV引起的感染来治疗猫。
64.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包含癌症 抗原。
65.根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述抗原成分包含癌症抗原。
66.根据权利要求16至22中任一项的疫苗组合物，其中所述抗原成分癌症抗原。
67.针对癌症来治疗受试者的方法，所述方法包含对所述受试者施用根据权利66所述的疫苗组合物。
68.根据权利要求66的疫苗组合物在制造用于针对癌症来治疗受试者的药物的用途。
69.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其还包含ORN/ODN。
70.根据权利要求63所述的免疫原性组合物，其中所述ORN/ODN为CpG。
71.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法，其还包含将ORN/ODN加入步骤a的组合物中的步骤。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述ORN/ODN为CpG。
73.根据权利要求16至23中任一项所述的疫苗组合物，其还包含ORN/ODN。
74.根据权利要求73所述的疫苗组合物，其中所述ORN/ODN为CpG。
75.根据权利要求1至8中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含大冠状病毒(CCV)。
76.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法 ，其中所述抗原成分 CCV。
77.根据权利要求16至23中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含CCN。
78. 针对由CCV引起的感染来治疗犬的方法，所述方法包括对所述犬施用根据权利要求77所述的疫苗组合物。
79.根据权利要求77所述的疫苗组合物在制备下述药物中用途，所述药物用于针对由CCV引起的感染来治疗犬。
80.根据权利要求1至8中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含牛轮状病。
81.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法，其中所 述抗原成分包含牛轮状病毒。
82.根据权利要求16至23中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含牛轮状病毒。
83.针对由牛轮状病毒引起的感染来治疗牛的方法，所述方法包括对所述牛施用根据 权利要求82所述的疫苗组合物。
84.根据权利要求82所述的疫苗组合物于制备下述药物的用途，所述药物用于针对由 牛轮状病毒引起的感染来治疗牛。
85.根据权利要求1至8中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原成分包含犬流 感病毒(CIV)。
86.根据权利要求9至15中任一项及权利要求M至30中任一项所述的方法，其中所 述抗原成分包含CIV。
87.根据权利要求16至23中任一项所述的疫苗组合物，其中所述抗原成分包含CIV。
88.针对由CIV引起的感染来治疗犬的方法，所述方法包括对所述犬施用根据权利要 求87所述的疫苗组合物。
89.根据权利要求97所述的疫苗组合物在制备下述药物中的用途，所述药物用于针对 由CIV引起的感染来治疗犬。
90.区分被BVDV自然感染的动物与接种了根据权利要求50或51所述的疫苗组合物的 动物的方法，所述方法包括从测试动物取得样品，并测量所述样品中E2蛋白质及NS2/3蛋 白质的含量，其中所述NS2/3蛋白质的不存在表示所述动物接种了所述疫苗组合物。
全文摘要
本发明涉及包含三萜、固醇、免疫调节剂、聚合物及Th2刺激剂的多种组合的佐剂配制物；用于制备该佐剂组合物的方法；及该佐剂配制物在含有不同抗原的免疫原性组合物和疫苗组合物中的用途。本发明还涉及该配制物在动物治疗中的用途。
文档编号A61K39/00GK102076358SQ200980124560
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月24日 优先权日2008年6月27日
发明者保罗·约瑟夫·多米诺斯基, 克多·马丁·巴吉, 张树成, 拉玛萨米·曼娜·曼南, 泰德·艾伦·奇尔德斯, 玛丽·凯瑟琳·奥尔森, 理查德·李·克莱博斯, 罗伯特·约翰·小燕西, 詹姆斯·理查德·汤普森, 里斯尼·达米卡·维拉特纳 申请人:辉瑞有限公司