专利名称：一种降低血总胆固醇的免疫调节剂及其给药方式的制作方法
技术领域：
本申请涉及心血管疾病领域。具体地说，本发明涉及牛结核分枝杆菌热休克蛋白65及含有完整牛结核分枝杆菌热休克蛋白65的蛋白组合物在治疗和/或预防动脉粥样硬 化中的应用。
背景技术：
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是常见的心血管疾病之一，也是现代死亡 率最高的疾病之一。动脉壁上大量脂质的积聚是动脉粥样硬化的主要表征，它同时也是一 种慢性炎症过程，天然免疫和适应性免疫反应不仅参与动脉粥样硬化斑块的形成，而且侵 蚀动脉壁，降低动脉弹性，影响血液流动。动脉粥样硬化斑块往往使动脉管腔变窄，进一步 诱发血栓栓塞，造成局部缺血，有时还会导致血流灌注区的组织萎缩。严重后果包括缺血造 成的心绞痛、心衰竭。HSP65/60分子属于HSP60家族，分子量60kDa左右，是生物体应对外界刺激发生 反应而表达的应激蛋白，在进化上高度保守。人源HSP60和结核分枝杆菌HSP65大约具有 50 %的同源性。当病原体侵入时，机体的免疫系统针对病原体产生抵抗性的免疫应答，这 时针对菌源HSP65的免疫反应赋予机体抗感染的能力，但同时由于人源HSP60和微生物源 HSP65分子的高度同源性，免疫系统在识别菌源HSP65的同时也可能针对自身的HSP60产 生应答，这种交叉免疫反应使得HSP65/60分子成为了一种危险的自身抗原。以往的研究证 明HSP65/60分子是AS的一个主要自身抗原。在AS患者或AS模型动物血清中都检测到针 对HSP65/60的抗体，抗体滴度与疾病的严重程度呈正相关。在AS斑块中也检测到大量针 对HSP65/60的T细胞。覆盖有AS斑块的血管内皮处存在大量表达HSP60的内皮细胞、巨 噬细胞和平滑肌细胞。在用重组HSP65或含有HSP65的卡介苗免疫动物时发现可明显促进 AS的发生。抗HSP65/60分子的抗体被证明对内皮细胞和巨噬细胞具有直接的损伤作用，这 种细胞毒性很可能诱导和加速了 AS。随着对HSP65/60与AS关系研究的深入，人们开始尝试用HSP65/60分子开发自身 抗原疫苗来预防AS的发生。当AS发生时，机体内可以检测到Thl型细胞因子Y-干扰素 (interferon- γ，IFN- γ )、白介素(interleukin，IL)-12的升高，同时伴随Th2型细胞因子 IL-4、IL-5和IL-10的降低。因此AS被认为是一种Thl型免疫应答过于亢进而造成的自 身免疫性疾病，针对这种Thl偏向性的自身免疫性疾病，预防和治疗的原则应当以抑制Thl 型免疫应答为首要任务。通常有两种方法一是诱发免疫耐受，即诱导针对自身抗原的全面 无应答状态；二是诱导免疫应答由Thl向Th2漂移，即诱导体内针对自身抗原的免疫调节 反应，使得Th2型应答上调，利用Th2型应答对Thl型应答的抑制能力来达到预防疾病的目 的。这两种方法都被广泛地应用于自身免疫性疾病的预防，但从免疫途径和免疫策略上两 者并没有特定的区别，主要还是与具体的疾病和抗原有关。在AS的预防上，已有实验证明鼻腔或口服免疫HSP65分子可以抑制低密度脂蛋白 受体缺陷型(low-density lipoprotein receptor deficient,LDL-RD)小鼠上AS 的发生，这主要是通过抑制Thl偏向性免疫反应达到的。血脂异常是诱发AS的传统危险因素之一，研究发现血脂异常除了与饮食、遗传相 关外，感染、炎症等因素也会导致血脂异常。感染、炎症导致的急性时相反应(acute-phase response, APR)可以影响体内脂质和脂蛋白的代谢升高甘油三酯水平、促进肝脏脂肪酸 和胆固醇合成、抑制脂肪酸的氧化、降低脂蛋白脂肪酶活性、降低LDL的清除率、抑制胆固 醇的逆向转运等等。这些变化可能是由感染过程中所分泌的炎症性细胞因子所介导产生 的，而脂质代谢的异常最终促进了 AS的发展。Xu等人用HSP65混合佐剂皮内免疫新西兰 大白兔，在观察到AS斑块程度加重的同时也发现了家兔血清中胆固醇水平的升高，这说明 HSP65相关的炎症性免疫应答也可以对动物的血脂代谢造成影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种降低血清总胆固醇的免疫调节剂本发明的又一目的是提供该免疫调节剂的给药途径及剂量本发明的最终目的是公开该免疫调节剂的用途在本发明的第一方面，提供牛结核分枝杆菌热休克蛋白65(表示为HSP65，国际基 因库登录号是M17705)作为降低低密度脂蛋白-胆固醇的免疫调节剂。作为本发明的第 一个实施实例，本免疫调节剂是利用基因工程手段通过可溶性表达而获得的HSP65，步骤包 括(1)HSP65基因的设计与获得借助于计算机设计两条寡聚核苷酸链，从医用卡介苗提取的DNA中通过聚合酶链 式反应获得HSP65基因，在5’端添加Ncol的识别位点，3’端添加了 Hindlll的识别位点。(2)PET-28a-HSP65重组基因工程菌的构建HSP65 基因经 Ncol、Hindlll 切割，插入经 Ncol、Hindlll 切割的 PET_28a 质粒载 体中，组成重组质粒PET-28a-HSP65，重组质粒转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组基因
工程菌。(3)工程菌发酵及HSP65的获得以LB为基础培养基，玉米浆培养基为发酵培养基，发酵参数如下温度36_38°C， PH6. 8-7. 2。发酵后离心收集工程菌，裂解菌体，离心获得含有可溶性蛋白的上清，硫酸铵分 级沉淀，35 %-40 %的硫酸铵沉淀重新溶解后经阴离子交换柱层析纯化，通过SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳，可以检测纯化的HSP65纯度。在本发明的第二方面，提供了该免疫调节剂的免疫途径和免疫剂量。鼻黏膜有丰 富的粘膜下淋巴系统，是诱导免疫耐受的重要部位，低剂量HSP65蛋白(10-20 yg)的反复 刺激能有效降低血清中低密度脂蛋白_胆固醇和血清总胆固醇。在本发明的第三方面，提供了该免疫调节剂的用途。如上所述，该免疫调节剂能降 低血清总胆固醇，显著激活全血细胞和动脉组织中LXRa和ABCA1的表达，从而增加了胆固 醇逆转途径，起到保护细胞的作用。从而降低动脉粥样硬化因素对动物体的影响。
图 1 质粒 pET-28a_HSP65 结构图。
图 2pET-28a_HSP65 测序图。图3SDS-PAGE电泳显示HSP65纯化。图4小鼠给药后14天血清中总胆固醇的变化(*表示p < 0. 05，与PBS组相比)。图5小鼠给药后14天血细胞、肝脏和主动脉中基因表达水平的变化(*表示p < 0. 05，与PBS组相比)。
具体实施例方式材料(1)菌株和质粒宿主菌Escherichia coli (DE3)是基因工程常用工具菌种，在从事基因工程研究 有关的实验室一般都有保存。质粒pET_28a由本实验室保存。(2)酶和试剂分子克隆工具酶和试剂、质粒抽提试剂盒为普洛麦格(Promega)公司产品，PCR回 收试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。(3)培养基LB 培养基，配方见参考文献 Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning ；A LaboratoryManual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。 该书是基因工程技术的经典著作，在许多高校图书馆都有收藏。(4)Cellulose-DEAE :DEAE_52 为 Whatman 公司产品。(5)测定血清中胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、甘油三酯浓度的仪器为美国贝克 曼库尔特有限公司的全自动生化检测仪。(6)考马斯亮蓝试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。(7)实验动物C57BL/6小鼠，6周龄，雄性，由南京大学模式动物中心提供。(8)总RNA提取试剂盒购自南京天为生物科技有限公司。(9) Quant cDNA 第一链合成试剂盒和 RealMasterMix (SYBR Green I)荧光定量试 剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司方法分子生物学操作方法质粒提取、聚合酶链反应、限制性核酸内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转 行在基因工程研究领域这些都是常规操作，参见Sambrook J，Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning :A LaboratoryManual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，pp.16—340。重组蛋白表达量的测定参见 Sambrook J, Fristsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning :ALaboratory Manual 2nd ed. NY :Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989, 方法进行。实施例1 :HSP65基因的克隆从市售的卡介苗提取基因组DNA(具体步骤参考《精编分子生物学实验指南》)，由 National Center forBiotechnology Information (NCBI)查到卡介苗中 HSP65 的全基因序列。在不改变HSP65氨基酸序列的前提下，选用大肠杆菌偏爱的密码子，借助计算机软件设 计两条引物P1和P2。两条引物核苷酸序列如下P1 :5’ TTCGCCATGGCCAAHACA ATTGCGTACG 3’P2 :5’ TTCCGAAGCTTAGAAATCCATGCCACCCATG 3’上游引物P1中引入Ncol酶切位点，下游引物P2中引入Hindlll酶切位点。PCR 反应体系为100pmol PI, lOOpmol P2，2 ii g 卡介苗基因组 DNA，2ii 1 dNTP(10mM),5u 1 lOXPfu缓冲液以及5单位Pfu DNA聚合酶，总体系为50 yl。PCR采用 热启动，在94°C变性10分钟后加入Pfu DNA聚合酶，具体条件为94°C 45秒，62°C 45秒， 72°C 3分钟，循环数为30 ；72°C 10分钟。通过PCR法获得HSP65基因的核苷酸序列，5，端 添加了 Ncol的识别位点，3’端添加了 Hindlll的识别位点。PCR产物用上海生工的PCR纯化试剂盒纯化，采用限制性内切酶Ncol和Hindlll 进行切割，酶切或用PCR产物纯化试剂盒纯化。将上述酶切回收的HSP65DNA片段和pET28a 质粒经限制性内切酶Ncol和Hindlll酶切得到的大片段进行连接，所得连接产物转化大肠 杆菌BL21 (DE3)，经酶切和PCR筛选出含有HSP65基因的重组质粒，称为pET-28a_HSP65 (示 意图见附图1)。经测序验证HSP65基因及阅读框的正确，结果见附图2.实施例2 :HSP65在大肠杆菌中的表达从pET-28a-HSP65平板上挑取单菌落接种到5ml含有50 u g/ml卡那霉素的LB 培养基中，37°C恒温振荡培养过夜，按转接到新鲜玉米浆液体培养基(50 y g/ml卡那霉 素)中，37°C培养4小时后，加入终浓度为5mmol/L的a -乳糖诱导重组大肠杆菌表达蛋白 HSP65。诱导6小时后工程菌经离心回收菌体，将菌体悬浮在菌体裂解液(pH8. 0，10mmol/L Tris-HCl缓冲液，0. 02%溶菌酶)中，冻融一次，加入DNase I将DNA消化至溶液不再粘稠， 离心回收上清，硫酸铵分级沉淀，将35-40%的沉淀重新溶解在离子交换缓冲液(lOmmol/L Tris-HCl, pH8. 0)中，透析脱盐，离心获取上清进行阴离子交换柱层析(DEAE纤维素DE-52 柱，2X60cm)，用离子交换缓冲液(lOmmol/L Tris-HCl, pH8. 0)/NaCl梯度洗脱，分段收集进 行SDS-PAGE电泳检测，HSP65在80-120mmol/L NaCl处洗脱。12% SDS-PAGE电泳检测样 品纯度，见附图3.实施例4 :HSP65重组蛋白的药效学研究24只6周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为3组，每组8只，分别为PBS空白组，0VA (卵 清蛋白)鼻黏膜免疫组和HSP65鼻黏膜免疫组。动物喂以高脂高胆固醇饲料(普通小鼠饲 料中加入10 %猪油，2 %胆固醇和0. 5 %胆盐)。20天后开始免疫，每天一次，连续10天。将 HSP65重组蛋白用灭菌的PBS溶解，经考马斯亮蓝试剂盒定量，配置成1 P g/yl，从鼻腔滴 入，20iU/只，含有20iig蛋白。检测免疫后血清中胆固醇的变化情况。于第10次免疫后 14天眼眶后静脉丛取血，每只0. 2ml左右，4000转/分钟，离心10分钟，收集血清。获得的 血清5小时内用全自动生化分析仪测定总胆固醇含量。结果表明HSP65可以显著降低高 脂高胆固醇喂养的C57BL/6小鼠血清总胆固醇。结果见附图4.实施例5 :HSP65重组蛋白对肝脏、全血细胞和主动脉组织中基因表达的影响16只6周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为2组，每组8只，分别为PBS空白组和HSP65 鼻黏膜免疫组。动物喂以高脂高胆固醇饲料(普通小鼠饲料中加入10%猪油，2%胆固醇和0.5%胆盐)。20天后开始免疫，每天一次，连续10天。将HSP65重组蛋白用灭菌的PBS溶 解，经考马斯亮蓝试剂盒定量，配置成1 P g/ Pi，从鼻腔滴入，20 yl/只，含有20 y g蛋白。 于第10次免疫后15天摘除眼球收集血液，肝素抗凝，4000转/分钟，离心5分钟，收集血 细胞90iU。处死动物，剥离胸腔主动脉及lOOmg肝脏组织。根据总RNA提取试剂盒说明 书提取血细胞、主动脉和肝脏组织总RNA，并将1 P g总RNA用Quant cDNA第一链合成试剂 盒逆转录。RealMasterMiX(SYBR Green I)荧光定量试剂盒检测肝脏LDLr (低密度脂蛋白 受体)、ABCA1(ATP结合盒转运子A1)、LRP(低密度脂蛋白受体相关蛋白)和MTP(微粒体甘 油三酯转移蛋白)在转录水平的表达。RealMasterMiX(SYBR Green I)荧光定量试剂盒检 测血细胞、主动脉中LXR a (肝X受体a )、LXR 0 (肝X受体0 )和ABCA1的转录水平的表 达。结果见附图5。
权利要求
1.一种降低血总胆固醇的方法，它包括用有效剂量的物质降低血总胆固醇和血低密度 脂蛋白胆固醇。
2.一种增加全血ABCA1(ATP结合盒转运子A1)表达的方法，它包括有效剂量的物质增 加全血ABCA1的表达。
3.一种增加主动脉ABCA1和LXRa (肝X受体a )表达的方法，它包括有效剂量的物质 增加主动脉ABCA1的表达。
4.权利要求1-3中的物质是一种源于牛结核分枝杆菌的热休克蛋白HSP65，其国际基 因库登录号是M17705，以及牛结核分枝杆菌的热休克蛋白HSP65与其它蛋白、肽类的组合 化合物。
5.权利要求1-3中的物质剂量为10u g-20 u g牛结核分枝杆菌的热休克蛋白HSP65。
6.权利要求1-3中的给药方法，它包括看权利要求4中物质为刺激主体，权利要求5中 物质剂量，生理盐水为溶剂，通过鼻腔吸入的方式进入体内。
7.—种预见和评估体内由胆固醇压力介导的动脉粥样硬化的方法，它包括对血液中总 胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的量化。
8.—种预见和评估体内由胆固醇压力介导的动脉粥样硬化的方法，它包括对细胞内胆 固醇外排能力替代标记的量化。
9.权利要求8的方法，其中的替代标志是循环细胞和动脉内皮细胞ABCA1。
10.评估循环细胞和动脉内皮细胞胆固醇外排能力的方法，它包括权利要求4中物质 为刺激主体，并与正常循环细胞和动脉内皮细胞中的ABCA1和LXRa的浓度进行比较。
全文摘要
本发明提供了牛结核分枝杆菌热休克蛋白65在预防和治疗动脉粥样硬化中的新用途，及达到这个用途的给药途径、剂量。本发明的牛结核分枝杆菌热休克蛋白65通过基因工程和生物工程手段获得，并证明其具有降低血总胆固醇，增加细胞胆固醇逆转运相关基因表达的药理学性质。
文档编号A61P3/06GK101874897SQ20101013380
公开日2010年11月3日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者刘景晶, 张会勇, 张宇, 曹荣月, 李泰明, 胡向兵, 鲁勇 申请人:中国药科大学