增强型嵌合基因重组卡介苗及其制备方法

专利名称：增强型嵌合基因重组卡介苗及其制备方法
技术领域：
本发明属微生物和生物工程领域。具体涉及嵌合基因重组疫苗，更具体涉及嵌合 基因重组卡介苗及其制备方法。
背景技术：
结核病是全世界关注的一种主要的公众传染性疾病。早在1993年，世界卫生组织 (WHO)就因为全球的结核病例日趋增多而宣布结核病疫情进入紧急状态。目前，全世界约 有1/3人口 (18. 6亿)携带有结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，每年约有800万 新增病例，200万人死于结核病；我国大约有活动性结核病人600万，每年有25万人死于结 核病。根据卫生部公布的2005年传染病疫情，在27种法定甲、乙类传染病中，肺结核的发 病数已经超过乙型肝炎，肺结核的死亡数也超过了狂犬病，发病数和死亡数均居第一位。而 且，结核病的控制也因为多重抗药性(Multidrug-resistant，MDR)菌株和艾滋病的出现使 得原本就越来越严重的结核病疫情变得更加复杂化。目前，预防结核病唯一有效的疫苗是卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)， 一种活的减毒牛型分支杆菌(Mycobacterium bovis)。然而遗憾的是，由于BCG发明的当 时还没有冻干技术，用来生产BCG的菌种在早期是通过培养的方法进行传代和保存的，这 种方法一直沿用到20世纪60年代，结果造成了世界各国使用的卡介苗菌种之间极大的差 异性。据统计，在世界各国进行过大小数十次的卡介苗临床试验，然而试验结果显示，卡 介苗对肺结核的免疫保护力是0-80%，差异性极大(Brewer，Τ. F. and Colditz, G.A.Clin Infect Dis. 1995 ；20 126-35.Colditz, G. Α. ， Brewer, T.F. ， et al.JAMA. 1994 ；271 698-702.)。因此，研究一种保护效力超过BCG的结核病新疫苗势在必行。尽管BCG对成人结核病的保护效力差强人意，但是由于其良好的免疫刺激效果以 及数十年来业已证实的安全性，使其作为预防结核病以及其他传染病的优良细菌表达载体 成为可能。已有实验报道，不同来源的保护性候选抗原基因可在BCG菌中克隆并得以表达， 从而构建相对高效的重组 BCG 疫苗(Stover, C. K.，de la Cruz, V. F.，et al. Nature. 1991 ； 351 456-60. Stover, C. K.，Bansal，G. P.，et al. J Exp Med. 1993 ；178 197-209. Grode, L.， Seller, P. , et al. J Clin Invest. 2005 ;115 :2472_9·)。有人利用来源于Mfortuitum质粒 PAL5000 的复制起点(Ranes，Μ. G.，Rauzier, J.，et al. JBacteriol，1990 ；172 :2793_7·)， 构建了多种不同的大肠杆菌-分支杆菌穿梭载体，并用来对分支杆菌进行遗传操作使之 表达了异源基因(Stover, C. K.，dela Cruz, V. F.，et al. Nature. 1991 ；351 :456_60. Timm, J. , Lim, E. M. et al. JBacteriol. 1994 ；176 :6749_53. Garbe, T. R. , Barathi, J. , et al. Microbiology, 1994 ； 140 133-8.)。在我们的前期工作中，曾将小分子量的ESAT-6基因插入结核杆菌的主要保护性 抗原基因Ag85A的Kpn I、Pst I和Acc I位点中的一个或两个位点，将得到的Ag85A_ESAT6 嵌合基因克隆到真核表达载体PVAXl中，构建了嵌合基因核酸疫苗。该项发明已被授予 中国发明专利(ZL200410084376. 1，李忠明，结核杆菌嵌合基因疫苗及其制备方法)，并提交了 PCT 申请(PCT/2005/CN2005/001914, Li, Zhongming. A ChimericMycobacterium tuberculosis Gene Vaccine and the Preparation MethodThereof)。动物试验表明，以 此种嵌合基因为基础的DNA疫苗在小鼠和恒河猴中均诱导了理想的免疫应答(Li Z,Zhang H,Fan X，et al.Vaccine 2006 ；24 4565-8. Li Ζ,Song D，et al.DNA Cell Biol 2006 ；25 25-30.)。ESAT-6抗原分子量小，虽在小动物中具有良好的免疫原性但单独免疫大动物产 生的免疫应答反应很弱保护力差。然而，我们在恒河猴实验中，采用此种嵌合基因DNA疫苗 进行初次免疫、再用重组ESAT-6蛋白加强免疫，令人^C喜地观察到了高滴度的抗ESAT-6抗 体的产生，说明此种嵌合基因DNA疫苗可以增强ESAT-6的免疫原性，这对抗结核感染非常 重要。从理论上讲，在Ag85A基因中插入ESAT-6基因不仅增加了抗原表位，增强了免疫原 性，而且框内形式的嵌入使得Ag85A的构型没有受到破坏，最大限度地保留了其特异性表 位，且Ag85A可作为ESAT-6的载体蛋白为其提供激活细胞免疫应答所需的T细胞表位，使 得ESAT-6也能在大动物中诱导出良好的免疫应答反应。大量临床研究资料和动物实验研究结果显示，增强Thl型免疫应答反应及Thl细 胞的IFN-Y分泌，对机体建立抵抗结核杆菌感染的保护性免疫非常重要(Kaufmarm SH, Andersen P.Chem Immunol 1998 ;70 :21_59·Andersen P.Trends Immunol 2001 ；22 160-8)。增强的Thl型免疫反应定义为高水平IFN-Y的分泌以及IgG2a抗体亚类的大量 产生。IFN-Y对于小鼠或者其他动物来说是一种主要的抗M.tb.保护性细胞因子，IFN-γ 基因敲除小鼠的Thl细胞因为不能分泌IFN-γ，在M. tb.攻击实验中小鼠往往会发生致死 性结核感染(Cooper AM, Dalton DK, et al. J Exp Med 1993 ； 178 :2243_7· Flynn JL，Chan J，et al. J Exp Med 1993 ； 178 :2249_54.)。Thl 细胞主要分泌 IFN-γ，而 IFN-γ 升高可抑 制Th2细胞的分化以及IL-4、IL-9基因的表达；反之，IL-4和IL-IO升高则会下调Thl细胞 的分化。而且，Th细胞产物还可以调节IgG抗体亚类的转换，IL-4介导B细胞产生的抗体 IgM转换为 IgGl 和 IgE，而 IFN-γ 则介导其向 IgG2a 的转换(Snapper CM, Paul WE. Science 1987 ；236 :944-7)。因此，不同的抗体亚类和细胞因子的产生可以反应免疫动物中所诱导 产生的特殊Th应答类型；而增强的Thl型免疫应答反应或者诱导产生的高水平IFN- γ均 可以导致机体抗结核杆菌感染能力的提高。有研究表明，在BCG中过表达免疫优势抗原也 可以诱导产生增强的Thl型免疫应答反应(Dhar N,Rao V,Tyagi AK. Immunol Lett 2003 ； 88 175-84. Rao V,DharN, N, agiAK. Scand J Immunol 2003；58 449-61.)。我们在已获批专利ZL200410084376. 1的基础上，利用我们实验室所构建的分枝 杆菌差异表达载体(CN200810033549. 5)又经过了大量实验和对本领域技术的潜心研究， 成功构建并筛选到了新型结核病预防用嵌合基因重组卡介苗，并在小鼠体内诱导产生了增 强的Thl型免疫反应及高水平IFN-γ，从而完成了本发明。因此，本发明的第一个目的是提供一种增强型嵌合基因重组卡介苗。本发明的第二个目的是提供这种增强型嵌合基因重组卡介苗的制备方法。本发明的第三个目的是提供含这种增强型嵌合基因重组卡介苗在制备预防结核 病重组疫苗上的应用。

发明内容
本发明的第一个方面是提供一种增强型嵌合基因重组卡介苗，包含通过电转化方
4法导入BCG中的克隆了结核杆菌嵌合基因Ag85A-ESAT6的穿梭表达载体。本发明的嵌合基因重组卡介苗中，所述嵌合基因Ag85A-ESAT_6包含序列1所示 的编码结核杆菌结构蛋白Ag85A基因和序列2所示的编码结核杆菌ESAT-6基因，其中所 述ESAT-6基因嵌合在Ag85A基因的第245-250位限制性内切酶Kpn I所识别的序列、第 325-330位内切酶Pst I所识别的序列和第430-435位内切酶Acc I所识别的序列中的一 个或两个位点上。本发明的嵌合基因重组卡介苗于2010年1月25日保藏于中国典型培养物保藏 中心(CCTCC，地址中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCC M 2010025，命名为牛分支 杆菌属卡介苗丹麦株 GW-A2/rBCG856 (Mycobacterium bovisBCG-Danish strain GW-A2/ rBCG856)。本发明的一个优选实施方案中，嵌合基因Ag85A_ESAT6为含两个ESAT-6拷贝小基 因的嵌合基因Ag856A2。更优选的是，两个ESAT-6拷贝小基因嵌合在Ag85A基因的Acc I 位点上。本发明的一个优选实施方案中，所述穿梭表达载体为分枝杆菌差异表达系统。本发明的一个更优选的实施方案中，所述穿梭表达载体为pMFA41。本发明的第二个方面是提供增强型嵌合基因重组卡介苗的制备方法，包括将嵌合 基因Ag85A-ESAT6克隆到穿梭表达载体中，再通过电转化方法导入BCG中。本发明的一个优选实施方案是以嵌合基因Ag856A2 (含两个ESAT-6拷贝小基因的 嵌合基因Ag85A-ESAT-6)作为目标基因，将其克隆至分枝杆菌高效表达载体pMFA41中，通 过电转化方法将其导入BCG中，筛选并鉴定高水平表达结核杆菌嵌合抗原的重组卡介苗菌 株。具体地说，该优选实施方案包括以下步骤1)结核杆菌嵌合基因Ag856A2的PCR扩增设计一对引物，以核酸疫苗HG856A质 粒DNA为模板，通过PCR扩增以获得嵌合基因Ag856A2。2)重组表达质粒的构建将PCR扩增获得的嵌合基因Ag856A2片段及穿梭表达载 体pMFA41经BamHI-EcoR I双酶切消化，琼脂糖凝胶电泳分离后回收、纯化目的片段，并将 目的基因与载体连接后转化大肠杆菌DH5 α。3)嵌合基因重组卡介苗的构建与筛选将克隆有嵌合基因的重组质粒通过电转 化的方法导入BCG感受态细胞中，并涂布于含卡那霉素及OADC的Middlebrook 7Η11平板 上，37°C培养3 4周筛选抗性重组子，并通过Western-blot方法进一步验证嵌合抗原在 BCG中的表达。4)嵌合基因重组卡介苗的制备将鉴定正确含有重组表达质粒的rBCG菌株在 完全Middlebrook 7H9培养基中生长至对数期，离心收集菌体，并重悬于含15%甘油的 PBS-T80缓冲液，-80°C冰箱中保存备用。本发明采用分枝杆菌差异表达系统或其他穿梭表达质粒为载体，可实现结核杆菌 嵌合基因在卡介苗中的高水平表达。本发明的第三个方面是提供增强型嵌合基因重组卡介苗在制备预防结核病重组 疫苗中的应用。本发明以嵌合基因重组卡介苗免疫BALB/c小鼠，腹腔接种(i. p.) —次，并于第
510周用同样剂量的疫苗i. p.接种加强免疫一次。通过ELISA方法测定不同免疫时间诱导 产生的抗Ag85A、抗ESAT-6特异性抗体的水平及其亚类，以分析其体液免疫应答效果；并在 免疫12周后，拉断颈动脉处死小鼠，无菌分离脾脏，制备脾淋巴细胞，通过ELISP0T方法分 别测定Ag85A、ESAT-6抗原刺激产生的IFN-γ水平，以分析其细胞免疫应答效果。结果显 示，较之野生型的BCG(wtBCG)菌株，本发明的嵌合基因重组卡介苗可以产生抗原特异的增 强性Thl型免疫应答，具体表现为高水平IFN-Y的分泌以及IgG2a抗体亚类的大量产生。 大量的临床研究资料和动物实验的研究结果显示，增强的Thl型免疫反应及IFN- γ的产生 对机体建立抵抗结核杆菌感染的保护性免疫非常重要。IFN-Y对于小鼠或者其他动物来 说是一种必要的抗M.tb.保护性细胞因子，IFN-γ基因敲除小鼠因为不能分泌IFN-Y，在 M. tb攻击实验中往往会发生致死性的结核感染。增强的Thl型免疫反应或者诱导产生的高 水平IFN-Y均可以导致机体抗结核杆菌感染能力的提高。


图1是实施例1结核杆菌嵌合基因Ag856A2的PCR扩增及重组表达质粒的构建图谱。其中，Lane 1 :DNA marker DL-250plus ；Lane 2 重组表达质粒的 BamHI-EcoR I 的双酶切图谱；Lane 3 嵌合基因Ag856A2的PCR扩增片段；Lane 4 :DNA marker DL-2000。图2是实施例2嵌合基因重组表达载体质粒图谱及其蛋白融合表达序列。图2A为嵌合基因重组表达质粒图谱，其中Kna表示卡那霉素抗性编码基因，OriM 表示分枝杆菌复制子；OriE表示大肠杆菌复制子；pfurAma表示-35区/起始密码双突变的 fur A基因启动子，ag856a2表示嵌合基因；图2B为嵌合基因重组表达质粒的表达序列图谱，其中DNA序列显示在上方，含 PfurAma启动子及融合表达的Ag856A2嵌合基因，启动子上游核糖体结合位点(RBS)加粗并 下划线显示；嵌合基因克隆于PMFA41表达载体的BamHI/EcoRI位点之间，fur A基因头六 个氨基酸编码序列加粗显示，BamHI位点斜体下划线显示，嵌合抗原融合表达于fur A基因 之后，终止密码子以*表示。图3是实施例3嵌合基因重组卡介苗的Western-blot分析图谱。其中，Lane 1 预染蛋白Marker ；Lane 2 :wtBCG全菌体；Lane 3 嵌合基因重组卡 介苗rBCG856全菌体；Lane 4 :E. coli中纯化的rAg856A2蛋白。图4是ELISA检测嵌合基因重组卡介苗诱导产生的抗体水平。腹腔接种BALB/c小鼠(η = 5)，阴性及空白对照组分别接种wtBCG或PBS，第10 周用同样剂量的疫苗加强免疫一次；在指定的时间采血，分别1 100、1 100或1 400 稀释后以ELISA检测其诱导产生的Anti-Ag85A (Α组),Anti-ESAT-6 (B组)或Anti-BCG全 菌体蛋白(C组)的抗体水平，并用ANOVA分析wtBCG组与rBCG856A2的差异显著性(*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)。图5是ELISA检测嵌合基因重组卡介苗诱导产生的抗体亚类及水平。腹腔接种BALB/c小鼠(η = 5)，阴性及空白对照组分别接种wtBCG或PBS，第 10周用同样剂量的疫苗加强免疫一次；采集加强免疫前后的血清，分别1 100、1 100 或1 400稀释后以HRP标记的羊抗鼠IgGl和IgG2a作为二抗，检测其诱导产生的八壯^885六仏，8组)、六11衍45六11-6((，0组)或Anti-BCG全菌体蛋白(E，F组)的抗体亚 类水平，同时分析其IgG2a/IgGl的比例，并用ANOVA分析wtBCG组与rBCG856A2的差异显 著性(*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)。图6是ELISP0T定量测定嵌合基因重组卡介苗所诱导产生的抗原特异性分泌 IFN- γ的CD4+T淋巴细胞数量。免疫12周(加强免疫3周)后，处死小鼠，无菌分离脾淋巴细胞，分别加入2yg/ mL rAg85A(A)，6 μ g/mL rESAT-6 (B), orlOy g/mL BCG extract (C)刺激淋巴细胞，并以小 鼠ELISP0T试剂盒(eBioscience Inc.)定量测定抗原特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞数 量。细胞数显示在各空的下方括号内，并以ANOVA分析wtBCG组与rBCG856A2的差异显著 性(*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)。
具体实施例方式以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明本发明，而 不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方 法，这些方法是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员按照以下实施例，不难根据具 体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围 内。实施例1.结核杆菌嵌合基因Ag856A2的PCR扩增与克隆设计一对引物，其序列如下85A-M1 5' -ATA GGA TCC TTT TCC CGG CCG GGC TTG C-3'，85A-M2 5' -TAA GAA TTC CTA GGC GCC CTG GGG CGC-3‘。其中5'端引物(序列表中的序列3)在Ag85A结构基因上游引入BamH I酶切位 点；3'端引物(序列表中的序列4)在Ag85A基因下游引入EcoRI酶切位点，引物的合成由 上海英骏生物技术公司完成。以核酸疫苗HG856A质粒DNA为模板，设置PCR反应程序为 950C X5min，(94°C X 30s, 60°C X 30s, 72°C X 90s) X 30Cycles，最后 72°C X5min 延伸，PCR 扩增获得嵌合基因Ag85A(图1，泳道3)，DNA序列见图2B，并提交至GenBank(Accession No.EU702753)。实施例2.嵌合基因重组表达载体的构建将PCR扩增获得的嵌合基因Ag856A2片段及穿梭表达载体pMFA41经BamHl-EcoR I双酶切消化，琼脂糖凝胶电泳分离后回收、纯化目的片段，并将目的基因与载体以摩尔比 3 1混合，于22°C进行连接Ih后转化DH5 α感受态细胞。重组克隆接种至LB液体培养 基中培养过夜，抽提重组质粒，BamHI-EcoR I双酶切验证嵌合基因片段成功插入了分枝杆 菌表达载体PMFA41中(图1，泳道2)，说明嵌合基因重组表达质粒构建成功。重组表达载 体PMFA856质粒图谱见图2Α，嵌合蛋白融合表达的氨基酸序列见图2Β。实施例3.嵌合基因重组卡介苗的构建与筛选DBCG电转化感受态细胞的制备从上海生物制品研究所购得冻干的卡介苗菌 株，加入无菌水重悬后在Middlebrook 7H11+10% OADC平板上划线活化，37°C培养3_4周， 直至出现单菌落。挑取一个单菌落接种至150mL Middlebrook 7H9+10% OADC液体培养基 中，于37°C轻微振荡培养至对数中期(OD6tltl约为0.8左右)后，将三角瓶在冰上放置30min，使培养基冷却至0°C，于4°C 5，OOOg离心5min，回收菌体。用15mL冰预冷的10%油溶液重 悬菌体沉淀，于4°C 5，OOOg离心5min，洗涤细胞2次。最后于4°C 5，OOOg离心5min回收细 胞，并以初始培养物1/20体积预冷10%甘油溶液重悬，200 μ L/管分装于无菌1. 5mL微量 离心管并于-80°C保藏备用。2)电转化取两支200yL电转感受态细胞，在管中加入克隆有嵌合基因的重组表 达粒5 μ L，食指轻弹以混勻内容物，在冰上放置lOmin。然后将其转移至冰预冷的2mm电击 杯，设置电转化仪(Gene Pluser 11，Bio-rad)参数为2. 5kV、25 μ FU, 000 Ω,放电后立即加 入900 μ L Middlebrook7H9培养基，混勻后将内容物转移至无菌试管，置于37°C摇床上温 育20h使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因。将已转化的感受态细胞涂布在 添加卡那霉素的Middlebrook 7H11培养基上。将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿， 并将平皿置于封口袋中以防培养基水分蒸发，于37°C培养，3-4w后可出现菌落。实施例4.嵌合基因重组卡介苗的鉴定挑取重组克隆接种于含20 μ g/mL卡那霉素的Middlebrook 7H9+10% OADC完全 培养基中，37°C慢摇床上(50r/min)培养约2_3周至0D_约为1.0左右。离心收集菌体并 重悬于1 X TBS缓冲液后超声波破碎细胞，收集裂解液上清，用Bradford法测定其蛋白浓度 后，Western-blot鉴定其嵌合抗原的表达情况。各取等量蛋白(约15 μ g)跑12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，20VX30min半干转 印，PVDF膜在10%脱脂奶粉中封闭1小时后与小鼠嵌合蛋白Ag856A2抗血清(1 1000) 孵育1小时，再于HRP标记的羊抗鼠IgG 1 6000 (Santa Cruz)中孵育45分钟，最后用化 学发光底物ECL反应1分钟后曝光于X光片。实施例5.嵌合基因重组卡介苗的制备与小鼠免疫将嵌合基因重组卡介苗菌株(rBCG856)及wtBCG在Middlebrook 7H9+10% OADC 培养基中生长至对数期，4，OOOXg离心收集菌体，并重悬于含15%甘油的PBS-T80缓冲液 (1XPBS, pH7. 4,0. 05% Tween80)，_80°C冰箱中保存备用。SPF级6 8周龄的雌性BALB/c小鼠购买于上海市实验动物中心，5只/组，共3 组，分别腹腔接种(i. P.) 106CFU/0. 4mL wtBCG或rBCG856，空白对照组接种0. 4mL PBS-T80。 每隔3周尾静脉采血一次，并于第10周用同样剂量的疫苗i. p.接种加强免疫一次。加强 免疫3周后杀死小鼠无菌条件下摘取脾脏，分离淋巴细胞。实施例6. ELISA测定血清抗体水平及其亚类分别将不同免疫时间采集到的各免疫组别的小鼠血清等体积混勻，稀释后加样于 抗原包被过的96孔可拆酶标板，通过间接ELISA方法测定其血清中所产生的抗体水平；同 时，分别以HRP标记的羊抗小鼠IgGl及IgG2a为二抗，分析其各自的抗体亚类。具体实验 步骤如下1)抗原包被以50mM碳酸盐缓冲液(pH9. 6)包被96孔可拆酶标板(MICR0L0N600， Greiner Bio—one)，抗原浓度分另Ij为 0. 25 μ g/mL rAg85A、l μ g/mL rESAT_6、10 μ g/mL BCG extract，包被体积为100uL，37°C包被2h或者4°C包被过夜。2)弃抗原包被液，加入 200yL 1XPBS-T20 缓冲液(1XPBS，pH7. 4，0. 05 % Tween20)洗涤2 3遍。3)封闭加入 100 μ L 封闭液(1% BSA，1XPBS-T20)，37°C封闭 Ih0
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4)弃封闭液，加入200 μ L 1 XPBS-T20缓冲液洗涤1 2遍。5)加样血清样品以1 100稀释于样品稀释液(0. 5% BSA，1 XPBS-T20)，各取 100 μ L加入rAg85A与rESAT_6抗原包被过的酶标板中，1 400加入BCG extract包被过 的酶标板中，每个样品均复孔加样，37°C反应lh。6)弃样品液，加入200 μ L 1 XPBS-T20缓冲液洗涤5 6遍。7)酶联反应将HRP标记的羊抗小鼠IgG (Santa Cruz Biotechnology)以 1 12，500稀释于样品稀释液，每孔各加入100 μ L，37°C反应lh。8)弃酶联液，加入200 μ L 1 XPBS-T20缓冲液洗涤6 7遍。9)显色反应等体积混合TMB Α、Β组分(KPL Inc.)，每孔各加入底物100 μ L，37°C 反应20min。10)终止反应每孔各加入终止液2M H2SO4 50 μ L。11)读数将酶标板置入酶标仪(Thermo Labsystem)中，于波长450nm下读数。实施例7.小鼠脾淋巴细胞制备及IFN- y ELISP0T测定免疫12周后，拉断颈动脉处死小鼠，无菌分离脾脏，并将每组小鼠脾脏集中于 200目尼龙网袋一起碾磨，制备各组的脾淋巴细胞，以小鼠ELISP0T试剂盒(eBioscience Inc.)定量测定抗原特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞数量。具体实验步骤如下1)活化PVDF膜在超净工作台中小心揭开96孔ELISP0T板(MAIPS4510， Millipore)盖子，每孔加入15yL 35%乙醇，室温静置片刻以浸润并活化其中内置的PVDF 膜。2)小心甩去乙醇，并在灭菌纱布上拍干。3)加入200 μ L包被液，洗去可能残余的乙醇。重复洗涤2遍。4)小心甩去抗原包被液，并在灭菌纱布上拍干。5)抗原包被按说明书稀释捕获抗体(clone AN-18，eBioscience Inc.)于抗原 包被液中，终浓度为4 μ g/mL，每孔加入100μ L，4°C包被过夜。6)小心甩去包被液，并在灭菌纱布上拍干；加入包被液200 μ L/孔，洗涤3遍。7)封闭加入含10% NBS的1640完全培养液200 μ L/孔，室温静置1小时，以封 闭非特异性结合的抗原位点。8)小心甩去封闭液，并在灭菌纱布上拍干。9)调整细胞浓度为4X 106/mL，每孔加入250 μ L，即1 X IO6/孔，并加入抗原刺激物 至其终浓度分别为 rAg85A 2 μ g/mL、rESAT_66 μ g/mL、BCGextract 10 μ g/mL ；37°C 5% CO2 中培养细胞24h。*以上步骤均需无菌操作，以下步骤为非无菌操作。10)弃细胞培养液，加入200 μ L/孔1 XPBS-T20缓冲液，洗涤3遍。11)按说明书稀释生物素标记的检测抗体(clone R4-6A2，eBiosciencelnc.)于 1 X样品稀释液中，终浓度为2 μ g/mL,每孔加入100 μ L，室温孵育2h。12)弃抗体溶液，加入200 μ L/孔1 XPBS-T20缓冲液，脱色摇床上洗涤lmin，重复 洗涤5遍。13)按说明书稀释HRP标记的链霉亲和素于IX样品稀释液中，终浓度为0. 4 μ g/ mL，每孔加入100 μ L，室温孵育45min。
14)弃HRP-SA溶液，加入200 μ L/孔1 XPBS-T20缓冲液，洗涤4遍；加入200 μ L/ 孔1XPBS，洗涤3遍。15)加入100 μ L/孔新鲜配置的AEC底物溶液(LabVision Corporation)，室温孵 育10 30min，实时观察斑点形成情况。16)弃底物溶液，加入200 μ L/孔去离子水，洗涤3遍。17)在超净台中风干 ELISP0T 板，并用 ELSIP0T 计数仪(BioReader-4000，Biosys) 自动计数斑点形成数量(SFU)。
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权利要求
一种增强型嵌合基因重组卡介苗，包含通过电转化方法导入BCG中的克隆了结核杆菌嵌合基因Ag85A ESAT6的重组穿梭表达载体。
2.如权利要求1所述的嵌合基因重组卡介苗，其中所述嵌合基因Ag85A-ESAT6包含序 列1所示的编码结核杆菌结构蛋白Ag85A基因和序列2所示的编码结核杆菌ESAT-6基因， 其中所述ESAT-6基因嵌合在Ag85A基因的第245-250位限制性内切酶Kpn I所识别的序 列、第325-330位内切酶Pst I所识别的序列和第430-435位内切酶Acc I所识别的序列 中的一个或两个位点上。
3.如权利要求1所述的嵌合基因重组卡介苗，所述嵌合基因重组卡介苗为保藏于 CCTCC、保藏号 CCTCC M 2010025 的 rBCG856。
4.如权利要求1所述的嵌合基因重组卡介苗，其中所述嵌合基因Ag85A-ESAT6为 Ag856A2。
5.如权利要求1所述的嵌合基因重组卡介苗，其中所述表达载体为分枝杆菌穿梭表达 载体。
6.如权利要求5所述的嵌合基因重组卡介苗，其中所述分枝杆菌穿梭表达载体为 PMFA41。
7.权利要求1所述嵌合基因重组卡介苗的制备方法，其特征在于将嵌合基因 Ag85A-ESAT6克隆到穿梭表达载体中，再将重组穿梭表达质粒通过电转化方法导入BCG中。
8.如权利要求7所述的制备方法，其中所述嵌合基因Ag85A-ESAT6为Ag856A2时的制 备步骤为采用序列3所示引物a和序列4所示引物b，以核酸疫苗HG856A质粒DNA为模 板进行PCR扩增。
9.如权利要求7所述的制备方法，其中所述嵌合基因克隆到穿梭表达载体中的步骤是 将PCR扩增所得嵌合基因与穿梭表达载体经酶切后连接，再转化大肠杆菌感受态细胞，细 胞培养，并抽提重组质粒。
10.如权利要求7-9之一所述的制备方法，其中所述穿梭表达载体为PMFA41。
11.权利要求1所述增强型嵌合基因重组卡介苗在制备预防结核病重组疫苗中的应用。
全文摘要
本发明提供一种增强型嵌合基因重组卡介苗，包含通过电转化方法导入卡介苗(BCG)中的克隆了结核杆菌嵌合基因Ag85A-ESAT6的重组穿梭表达载体。本发明也提供了这种增强型嵌合基因重组卡介苗的制备方法及其在制备预防结核病重组疫苗中的应用。本发明采用分枝杆菌差异表达系统或其他穿梭表达质粒为载体，实现了结核杆菌嵌合基因在卡介苗中的高水平表达。本发明的增强型嵌合基因重组卡介苗可产生分别针对Ag85A及ESAT-6抗原特异的增强性Th1型免疫应答，可望成为替代卡介苗的新型结核病疫苗。
文档编号A61K39/04GK101912605SQ20101015606
公开日2010年12月15日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者李忠明, 范小勇, 赵国屏, 马辉 申请人:上海市公共卫生临床中心