香薷三萜在制备防治猪免疫抑制性病毒感染药物的用途及应用的制作方法

专利名称：：香薷三萜在制备防治猪免疫抑制性病毒感染药物的用途及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种天然植物在制备防治猪免疫抑制性病毒感染药物中的用途及应用。
背景技术：
：“猪粮安天下”是中国的国策。农村70%的现金来源于养猪，年销售收入达10万个亿，就业人数达1亿人，猪肉的价格又影响到全国13亿人民最基本的生活，影响到全中国的经济和全社会的稳定，是中国最大的政治经济问题。中国的养猪业已发展到集约化养殖阶段，抗生素的长期滥用，产生大量的耐药菌(毒)株的形成，导致猪免疫抑制性病毒感染年年暴发流行，疫情造成的直接经济损失就达几百亿元；通过猪产品给人体健康形成严重威胁，续延损失更严重。现有防治猪免疫抑制性病毒感染药物存在的问题目前，临床经常和长期使用的防治猪病毒感染药物，包括干扰素、解热药、抗炎药、杀病毒药、抗血虫药等，对“高热、红皮、便秘，急性死亡的，统称猪高热病的免疫抑制性病毒复合感染”，只暂时收到解表效果体温下降、食欲增加、精神恢复、红皮炎症消除等，几天后，迅速反弹，并越治越严重，甚至全群覆没的严重后果。目前公知的技术和公开的专利公知的技术《中国药典》记载，中药香薷化学成分含挥发油约0.7%，香荆芥酚(Carvacrol)65%、香荆芥酚乙酸酯6%，尚有对一聚伞花素(p-Cymene)、a-侧柏烯(a-Thujene)、芳樟醇(Linalool)、龙脑(Borneol)、a-石竹烯(a-Caryophyllene)等。香薷功能发汗解暑，和中化湿，行水消肿。主治夏季外感风寒，内伤于湿，恶寒发热，头痛无汗，脘腹疼痛，呕吐腹泻，小便不利，水肿。《别录》:“主霍乱腹痛吐下，散水肿”。《本草经集注》“霍乱煮饮无不瘥者。作煎除水肿尤良”。《食疗本草》“去热风，卒转筋，可煮汁顿服。又干末止鼻衄，以水服之。”临床应用夏季乘凉饮冷，外感于寒，内伤于湿，发热恶寒，头痛无汗，胸闷泛恶，甚则腹痛吐泻。如《局方》香薷散。药理作用具有解热、镇痛、增强兔疫、挥发油有抗菌、抗病毒作用。在体外对亚洲甲型流感病毒和孤儿病毒(ECH011)有显著抑制作用；体内试验，在孤儿病毒(ECH011)感染同时或感染后给药能延缓病变出现72-96小时。用来治疗中暑发热、感冒恶寒、急性肠胃炎、跌打肿痛、牙龈肿痛、下肢水肿、颜面浮肿、多发性疥肿、毒蛇咬伤、腹痛吐泻、小便不利等；还可治疗风湿关节痛、小儿惊风、支气管炎、肝炎、肾炎等；外用可治脓疮、皮肤病、疥疮等。现代研究香薷主要含有挥发油、黄酮类和微量元素等功能成分。挥发油的研究文献记载，挥发油是石香薷的主要有效功能成分，全草含挥发油0*3-2%。不同地区的石香薷的主要成分含量有所不同，但基本上都是以百里香酚和(或)香荆芥酚为主。黄酮的研究郑尚珍等(1996)从石香薷中发现了5-羟基-6-甲基-7-0-3-D-口比喃木糖(3—吡喃木糖双氢黄酮甙和鼠李柠檬素-3-0-5，7-二羟基-6，7-二甲氧基黄酮与鼠李柠檬素-3-0-0-D-芹糖(1—5)芹糖-4-0-0-D-葡萄糖甙的2个新黄酮甙。杨彩霞等(2003)从石香薷中分离出4个黄酮类化合物，即5，7_二甲氧基-4-羟基黄酮、芹菜素等黄酮。微量元素的研究据文献资料记载，石香薷含有Cu、Zn、Mn、Co、Ni、Se、Cr、Sn、F、Si、Mo等11种微量元素。抗病毒作用的研究石香薷挥发油在体外对亚洲甲型流感病毒和孤儿病毒有显著抑制作用。在体内，在孤儿病毒(E-CH011)感染的同时或感染后给药能延缓病变出现7296h。严银芳等(2002)发现石香薷挥发油具有抗流感A3型病毒的作用，每千克体重给药lOOmg以上对小鼠流感病毒性肺炎有明显的治疗作用。葛冰等(2005b)采用体外细胞培养的方法研究石香薷挥发油对新城疫病毒(NDV)感染的拮抗作用，测定其对鸡胚成纤维细胞的最大无毒浓度(TD0)、半数细胞中毒浓度(TD50)、抑制50%细胞病变的药物浓度(IC50)、治疗指数(TI)及体外抗NDV效果。试验发现，石香薷挥发油的TD0、TD50、IC50、TI分别为1.56g/l、3.13g/l、0.20g/l、15.65，0.79g/l的石香薷挥发油对所致的CPE有明显的抑制作用，试验结果表明，石香薷挥发油具有明显的抗NDV作用。免疫增强作用的研究刘静等(1996)发现，香薷油具有增强特异性和非特异性免疫应答、提高机体防御机制的作用。试验结果表明，香薷油能使脾脏重量增加，提示可促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖；香薷油能使小鼠脾脏抗体形成细胞合成和分泌抗体的活力增强；香薷油能使抗SRBC(绵羊红细胞)的抗体总量增加，提示对抗体免疫的反应阶段和效应阶段均有促进作用。香薷油能增加外周血ANAE+与淋巴细胞的比率，提示可提高细胞免疫功能。在非特异性免疫应答方面，香薷油能使血清溶菌酶的含量增加，提示有提高吞噬细胞的吞噬功能和加强溶菌作用。补体系统在机体防御功能中起着重要作用，但只有在被激活之后才能发挥其溶菌、中和毒素、调理和加强吞噬作用等功能。香薷油能直接激活补体系统，因而可在抗体形成之前发挥其抗感染作用。公开的专利中国专利香薷调味品(申请号99116443.1)，公开了“一种调味用的香薷调味品，其特征在于该香薷调味品是由香薷粉或香薷汁构成。”中国专利天然植物饮料及其制备(申请号=98112300.7)，公开了“一种天然植物饮料及其制备，其特征是“由香薷挥发油、香薷浸膏、香薷浸膏提纯液、香薷浸膏提纯醇洗液、党参醇浸膏各按030%；030%015%05%030%(体积)的比例溶入可饮用水中，调节pH为6.06.3，装瓶、灭菌，即得饮料；其中香薷挥发油的用量为030%(体积)，香薷浸膏的用量为030%(体积)香薷浸膏提纯液的用量为015%(体积)，香薷浸膏提纯醇洗液用量为05%(体积)，党参醇浸膏用量为030%(体积)，余量为可饮用水，但香薷挥发油、香薷浸膏、香薷浸膏提纯液、香薷浸膏提纯醇洗液不能同时为零。”中国专利植物病虫害天然防除剂石香薷的应用及其生产与加工(申请号00134980.5)，公开了“一种植物病虫害天然防除剂石香薷的应用及其生产与加工，其特征石香薷要通过人工栽培获得和提取其中的百里香酚和香荆芥酚并制成含有9.6%百里香酚的香薷精或含有59%百里香酚和0.13%香荆芥酚的香薷精油，再与500倍或3000倍水配制成水溶液，用于防治病虫害或抑制细菌类、酵母类、真菌类的生长发育。”中国专利一种治疗腹泻的香薷提取物胶囊制剂及其制备方法(申请号02153994.4)，公开了“一种香薷挥发油的胶囊制剂及其质量控制方法，其特征在于该挥发油含有百里香酚58.131%，香芹酚11.946%，对-聚伞花素10.274%，”有抗病毒、抗细菌、抗炎、止泻、止痛、退热的作用，并能抑制胃肠功能亢进。中国专利一种香薷提取物的制剂、质量控制方法以及其新用途(申请号02153995.2)，公开了“一种香薷挥发油的制剂、质量控制方法以及其新用途。其特征在于含有-99%的香薷挥发油和99%-1%的药用赋形剂或其它可组方的药物。有抗病毒、抗细菌、抗炎、止泻、止痛、退热的作用，并能抑制胃肠功能亢进。”中国专利一种香薷提取物的制剂、质量控制方法(申请号=200510004992.6)，公开了一种香薷挥发油的制剂、质量控制方法。本发明的药物制剂含有-99%的香薷挥发油和99%-1%的赋形剂(包括其它配用的药物)，优选含有30%-80%的香薷挥发油和70%-20%的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，本发明香薷及其挥发油制剂有抗病毒、抗细菌、抗炎、止泻、止痛、退热的作用，并能抑制胃肠功能亢进。中国专利镇痛、止血、消炎的中药组合物及制备方法(申请号200510020218.4)，公开了“一种镇痛、止血、消炎的中药组合物及其制备方法。其特征在于它基本上是用一种或多种唇形科香薷属植物的有机溶剂提取物作为活性组分与辅剂组成。”它可以制成任何一种常用内服剂型，也可以制成外用贴剂、膏剂、栓剂、酊剂等以治疗各类痔疮、外伤疼痛、止血。也适用治疗癌症患者恶性疼痛、腹痛、肌肉疼痛、肛门肿痛、痨伤吐血、痢泻等病症。中国专利由大叶香薷深加工制成的香薷品(申请号200510017576.X)，公开了“由大叶香薷深加工制成的香薷品，其特征在于，该制品是由大叶香薷生长至主花穗50%是籽、50%是花时的地上部分，缩去水份30-40%，在300-760毫米水银柱气压、71.5-94.5°C温度下，用减压或常压水蒸气蒸馏取得的大叶香薷油，再以体积百分比计香薷油15%、黄葵油3%、茉莉油2%、乙醇80%混合制成的香薷香水。”中国专利一种防治禽流感的药物及其制备方法(申请号=200410103987.6)，公开了“一种防治禽流感的药物，主要由以下方法制备而成将香薷、薄荷、连翘、金荞麦、茶叶、贯众、淫羊藿分别提取其活性成分，将所得的提取物经纯化后组方配制而得。”在香薷的研究方面，国内外有对香薷挥发油(百里香酚、香荆芥酚、丁香酚和对聚伞花素等)的研究很多，对香薷黄酮的研究也有，但还没有发现涉及对香薷三萜的研究和应用的报导，也没有发现涉及香薷三萜的专利公开。
发明内容发明目的本发明的目的是用天然植物制备防治猪免疫抑制性病毒感染的药物一香薷三萜，解决了目前猪免疫抑制性病毒感染无有效药物治疗的难题。控制疫情，减少直接经济损失，保障人体健康。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是1、提取香薷三萜①原料物的选择从天然植物香薷(MoslachinensisMaxim)、土尔其荆芥(w/w)、华芥芋(Orthodonfordii(Maxim)Hand-Mazz)中选择至少一种作为提取原料物。②除杂对提取原料物选去泥沙、杂草。③切段将原料切成长约15cm段④生物预处理纤维素酶+盐酸+水(PH2-5)，酶解3-9小时；⑤微波、超声波提取提取温度为30_75°C、时间为30-360分钟；⑥固一液分离；⑦液相浓缩、干燥，得香薷提取物；⑧香薷提取物经95%的甲醇溶解，过滤；⑨滤液浑发回收甲醇，即得本发明的香薷三萜；2、香薷三萜的生化组成包含3，25-环氧-20，3a，70-三羟基齐墩果-12-烯-28-酸(C31H4805)、23，33，23_三羟基齐墩果-12-烯-28-酸(C3(1H4(105)、33-当归酰基-23，23_二羟基齐墩果-12-烯-28-酸(C35H5406)、33-异当归酰基-23，23-二羟基齐墩果_12_烯-28-酸(C35H5406)、33-乙酰基齐墩果-12-烯-28-酸(C23H5Q04)、齐墩果酸(C3QH4803)、日-谷甾醇(C29H500)中的任意二种或二种以上组成；3、制备防治猪免疫抑制性病毒感染的散剂药物制备香薷三萜散剂药物将浓缩、干燥后的香薷三萜一粉碎至40-100目一称重包装一成品；4、制备防治猪免疫抑制性病毒感染的水剂药物制备香薷三萜水剂将浓缩、干燥后的香薷三萜一加等量溶剂(重量份)(溶剂可以是水或水+葡萄糖或水+葡萄糖+VC)—搅拌一过滤一称重包装一成品；5、与其他中药配伍制备防治猪免疫抑制性病毒感染的复方药物制备防治猪免疫抑制性病毒感染的中药复方将浓缩、干燥后的香薷三萜一加等量黄芪或党参或板兰根粉(重量份)一搅拌一过滤一称重包装一成品；6、与其他中药提取物配伍制备防治猪免疫抑制性病毒感染的复方药物制备防治猪免疫抑制性病毒感染的中药提取物复方将浓缩、干燥后的香薷三萜—加1/3量的黄芪或党参或板兰根提取物(重量份)一搅拌一过滤一称重包装一成品；7、用于防治猪免疫抑制性病毒一猪蓝耳病(PRRS)病毒感染<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明的技术效果在2007年至2009年，我们用香薷三萜(“高热灵”)治疗了1000多个中小猪场的80000多头感染病猪，在感染早期死亡率控制在10%以下，有效率90%以上，治愈率80%以上的显著效果。本发明的技术特征1、本发明所述的香薷三萜的技术特征在于包含3，25-环氧-23，3a，73-三羟基齐墩果-12-烯-28-酸(c31h4805)、23，33，23-三羟基齐墩果_12_烯-28-酸(c3qh4q05)、33-当归酰基-23，23-二羟基齐墩果-12-烯-28-酸(c35h5406)、33-异当归酰基_23，23-二羟基齐墩果-12-烯-28-酸(c35h5406)、33-乙酰基齐墩果-12-烯-28-酸(c23h5q04)、齐墩果酸(c3qh48o3)、谷甾醇(c29h5qo)中的任意二种或二种以上组成；2、本发明发现了香薷三萜对防治猪免疫抑制性病毒感染有关键性作用，猪在感染免疫抑制性病毒后，抑制了免疫巨噬细胞产生抑杀病毒的no细胞毒作用，香薷三萜能在免疫抑制状态下，显著提高巨噬细胞产生n0，毒杀病毒，而保护宿主细胞；本发明是首次利用香薷三萜为主要作用有效成份制备防治猪免疫抑制性病毒感染药物；国内外还没有发现涉及对香薷三萜的研发和应用的报导及专利公开；3、本发明所述的药物的特征在于可与药学上可接受的载体混合，用于制备防治猪免疫抑制性病毒感染的药物；4、本发明所述的药物的特征在于可单独或与其他中药及中药提取物组配，用于制备防治猪免疫抑制性病毒感染的药物；5、本发明所述的药物的特征在于可制备成包含香薷三萜的散剂或水剂；6、本发明所述的用途及应用的特征在于防治猪蓝耳病(PRRS)病毒、猪瘟(HCV)病毒、猪流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒感染引起的猪高热病；7、本发明的香薷三萜提高香薷的生物利用度10-15倍。国内外有对香薷挥发油(香酚部位百里香酚、香荆芥酚)的应用研发，其生物利用度为0sw；有对香薷黄酮部位(木犀草素、芹菜素)的应用研发(中国医学科学院药物研究所，专利申请号2007101217400)，但至今没有成型的产品，其实验室的生物利用度为0…〗…*5%，本发明的香薷三萜的香薷生物利用度为10-15%，提高了10-15倍；8、本发明提高效价10-20倍。香薷三萜部位、香薷黄酮部位、香薷挥发油部位都有抑杀病毒作用，但机制不同香薷挥发油(香酚)与脂质有良好的亲合性，能溶解病毒的脂质囊膜、增加囊膜的通透性，使囊膜内的成分渗出，病毒失去需要的生态环境而死亡，达到杀病毒作用；香薷黄酮能非特异性地与pam的核糖体结合，阻断病毒基因组rna与宿主细胞核糖体结合，阻止病毒基因复制和病毒蛋白质合成，使宿主细胞免受侵害，保护免疫力。香薷三萜对防治猪免疫抑制性病毒感染有关键性作用，猪在感染免疫抑制性病毒后，抑制了免疫巨噬细胞产生抑杀病毒的no细胞毒作用，香薷三萜能在免疫抑制状态下，显著提高巨噬细胞产生n0，毒杀病毒，而保护宿主细胞；香薷三萜还能提高免疫抑制状态下自然杀伤(nk)细胞活性；促进t细胞增值和cd4+和cd8+t细胞亚群分化成熟；刺激机体产生干扰素(ifn)和白细胞介素(il-2)等细胞因子；提高c3b受体花环率，提高免疫球蛋白含量，提高免疫力。本发明的应用方法中，通过组合三个不同机制的有效部位，完成多途径多靶点协同作用，达到高效防治免疫抑制性病毒感染的难题，提高效价10-20倍。9、本发明有显著的临床效果在2007年至2009年，我们用香薷三萜(“高热灵”)治疗了1000多个中小猪场的80000多头感染病猪，在感染早期死亡率控制在10%以下，有效率90%以上，治愈率80%以上的显著效果。10、本发明“天然、安全、高效、无残留、不产生耐药性”。具体实施例方式实施例1香薷三萜混合物的提取方法①称取100公斤的水，倒入1000立升的容器中，加入16公斤的盐酸，搅拌勻均(PH4)。再加入03公斤的纤维素酶，搅拌勻均。②称取100公斤的天然植物香薷(MoslachinensisMaxim)，选去泥沙、杂草；切成长约15cm段，倒入上述容器的酶解液中，搅拌酶解6小时；③将以上酶解处过的香薷倒入1000立升的微波、超声波提取釜中，在温度为60-70°C、提取80分钟；④用“固-液”分离装置将香薷和提取液分开。⑤提取液进行浓缩、干燥，即得10-16公斤的本发明的香薷三萜混合物(香薷三萜(30-70%)、香薷生物香酚(5-20%)、香薷生物黄酮(10-30%))。实施例2防治猪免疫抑制性病毒感染药物香薷三萜散剂的制备方法①称取10公斤的浓缩、干燥后的香薷三萜。②粉碎至80目③将粉碎好的香薷三萜按500克/包(或1000克/包)称重包装；④检验、封包；⑤香薷三萜散剂成品20包(或10包)。实施例3防治猪免疫抑制性病毒感染药物香薷三萜水剂的制备方法①称取10公斤的浓缩、干燥后的香薷三萜，倒入100立升的容器中。②加入9公斤水，1公斤葡萄糖，搅拌勻均，过滤。③将过滤的香薷三萜按500克/瓶(或1000克/瓶)称重包装；④检验、封盖；⑤香薷三萜水剂成品40瓶(或20瓶)。实施例4防治猪免疫抑制性病毒感染药物香薷三萜水剂的制备方法①称取10公斤的浓缩、干燥后的香薷三萜，倒入100立升的容器中。②加入8公斤水，1公斤葡萄糖，1公斤VC，搅拌勻均，过滤。③将过滤的香薷三萜按500克/瓶(或1000克/瓶)称重包装；④检验、封盖；⑤香薷三萜水剂成品40瓶(或20瓶)。实施例5防治猪免疫抑制性病毒感染药物香薷三萜针剂的制备方法①称取10公斤的浓缩、干燥后的香薷三萜，倒入100立升的容器中。②加入8公斤注射用水，1公斤注射用葡萄糖，1注射用公斤VC，搅拌勻均，过滤。③将过滤的香薷三萜按10ml/瓶称重、灭菌、封装；④检验、装盒；⑤香薷三萜针剂成品2000瓶(或20瓶)。实施例6香薷三萜散剂药物防治感染免疫抑制性病毒、还能进食的猪的应用方法①选取10-15公斤的患免疫抑制性病毒感染的、还能进食的仔猪50头。②第1-3天每天投喂二次，每次按前一天进食量的1/2称取饲料，加入香薷三萜散剂20克/头，搅拌勻均，投料饲喂。③第4-7天每天投喂二次，每次按前一天进食量的1/2称取饲料，加入香薷三萜散剂10克/头，搅拌勻均，投料饲喂。死亡率在5%以下，有效率95%以上，治愈率85%以上。实施例7香薷三萜水剂药物防治感染免疫抑制性病毒、废食或绝食的猪的应用方法①选取10-15公斤的患免疫抑制性病毒感染的、减食或废食的仔猪50头。②第1-5天每天灌服二次，每次按30_60ml/头香薷三萜水剂灌服。③第6-10天每天投喂二次，每次按前一天进食量的1/2称取饲料，加入香薷三萜散剂20克/头，搅拌勻均，投料饲喂。死亡率在15%以下，有效率90%以上，治愈率80%以上。实施例8香薷三萜针剂药物防治感染免疫抑制性病毒、废食或绝食的猪的应用方法①选取10-15公斤的患免疫抑制性病毒感染的、减食或废食的仔猪50头。②第1-5天每天肌肉注射二次，每次按IOml/头香薷三萜针剂药物。③第6-10天每天投喂二次，每次按前一天进食量的1/2称取饲料，加入香薷三萜散剂20克/头，搅拌勻均，投料饲喂。死亡率在15%以下，有效率90%以上，治愈率80%以上。实施例9香薷三萜混合物保护免疫能力的细胞实验采用猪肺泡巨噬细胞(PAM)感染蓝耳病毒模型，MTT法检测PAM细胞存活状况，DNA片断化分析观察PRRSV对猪肺泡巨噬细胞(PAM)DNA降解的影响，碘化丙啶染色流式细胞术检测细胞凋亡率，进行香薷三萜混合物(高热灵)保护免疫能力的细胞实验。1材料与方法1.1药物及试剂药物的制备取香薷三萜混合物(高热灵)100g，按常规煎煮，过滤，浓缩，制成100%浓度的药液。试剂MTT用PBS配成5g/l。碘化丙啶、RNaseA、蛋白酶K购自Sigma公司。FCS、DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司。TX.114购自美国Anlresco公司。苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇等为国产分析纯。1.2PRRSV病毒增殖与纯化MARC-145细胞长成单层后，将PRRSV病毒接种于长满单层的MARC-145细胞，37°C吸附lh。加入含2%FCS的DMEM营养液37°C培养3-4天，细胞病变(CPE)达80%时，收获病毒细胞。反复冻融3次，2000r/min离心30min(4°C)。取上清液于90，000Xg离心2h(4°C)。弃上清，加入1/100原体积PBS，4°C悬浮过夜；取出经30%-60%蔗糖密度梯度，120，000Xg离心3h，收获病毒带于_20°C保存备用。1,3细胞培养猪肺泡巨噬细胞系PAM自制。用含体积分数为10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640完全培养基，37°C、5%C02条件下培养。细胞呈单层生长铺满培养瓶后用0.25%的胰蛋白酶消化传代，选取对数生长期细胞做实验。1,4实验分组待细胞生长至80%时，换新培养基将细胞分为三组对照组(不含PRRSV的完全培养基)；PRRSV处理组(完全培养基+PRRSV)；香薷三萜混合物(高热灵)处理组(完全培养基+香薷三萜混合物(高热灵))；预处理24小时后力PRRSV处理96小时(完全培养基十香薷三萜混合物(高热灵)+PRRSV)。1.5MTT法检测细胞活力取对数生长期细胞.以2X104/孔接种于96孔培养板，200iiL/孔。在370C、5%C02条件下培养过夜后，按分组要求给以不同处理因素，每组设4个平行孔。培养24h后，每孔加5g/LMTT20uL，再培养4h，倾去培养液，加DMS0150uL/孔，待紫色结晶完全溶解后，用酶联免疫仪在波长570nm处读取吸光度(0D)。取4孔0D值的均数按公式计算细胞存活率。细胞存活率(％)=(实验组0D/对照组0D)X100%。重复3次。1.6细胞DNA片段化分析收集细胞，用冰冷的PBS洗2次，胰酶消化，培养基(含血清)中和，离心收集细胞(800rpm,5min)，再用PBS洗两次。加入500LDNA消化缓冲液，室温放置lOmin，再加2yL20mg/mL的RNaseA，37°C，lh；再加入L20mg/mL的蛋白酶K，55°C，lh；离心后加入等体积抽提液(酚氯仿异戊醇2524l)，9000rpm离心15min；取上清至另一EP管，加入1/10体积3mol/L的乙酸钠，再加入2.5倍体积100%乙醇_20°C沉淀过夜；12000rpm离心lOmin；30LTE溶解DNA。每样品取8yLDNA于1.8%琼脂糖凝胶电泳。1.7碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡药物处理24h后，用质量浓度为2.5g/l胰蛋白酶消化贴壁的PAM细胞，lOOOrpm离心lOmin，去上清，PBS漂洗2次，沉淀中加人体积分数为0.70的冰乙醇固定。lOOOrpm离心lOmin，去上清，PBS漂洗2次，调整细胞浓度为1X106/L。力卩50yLRNaseA(质量终浓度为lg)，37°C水浴30min。加PI至质量终浓度为50mg/L，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4°C避光染色30min后，上流式细胞仪检测(激发波长488nm；发射波长610nm)各期细胞DNA的含量。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA直方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞的多少。2结果2.1PRRSV的细胞毒性作用为了解猪蓝耳病毒(PRRSV)对猪肺泡巨噬细胞PAM活性的影响，分别用0.5、1.0、3.0、6.0、10、20mg/LPRRSV孵育猪肺泡巨噬细胞PAM96小时后，MTT法观察细胞生长的变化。结果显示随着药物浓度的增加，PRRSV抑制细胞生长的能力增强，存活率依次为90.50%士1.50%、85，00%士3.20%、61.66%士1.20%、48.45%士3.40%、19.85%士3.70%、12.60%士0.50%(n=12)。PRRSV在3.Omg/1时就对细胞活性产生明显的抑制作用(<0，01)，其1(5(1大约为6.011^/1。2.2不同浓度的香薷三萜混合物(高热灵)对猪蓝耳病毒(PRRSV)抑制猪肺泡巨噬细胞PAM生长的影响用100、200、300、400iimol/L香薷三萜混合物(高热灵)预处理细胞24h后，6.Omg/L猪生殖和呼吸系统综合征病毒(PRRSV)孵育96h，MTT法观察细胞生长的变10化情况。结果发现100-500μmol/L的香薷三萜混合物(高热灵)均可使6.Omg/L猪蓝耳病毒(PRRSV)抑制猪肺泡巨噬细胞PAM生长的作用下降(P<0.05或0.01)，其中300μmol/L的香薷三萜混合物(高热灵)作用效果最好。2.3香薷三萜混合物(高热灵)对猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导猪肺泡巨噬细胞PAM凋亡DNA的影响细胞凋亡时细胞内的核酸内切酶切割核小体，可形成180_200bp或成倍数的几个核小体长短的DNA片段。DNA片段化分析发现经猪蓝耳病毒(PRRSV)孵育96h可出现凋亡细胞特征性的梯状条带，而300μmol/L香薷三萜混合物(高热灵)预处理24小时后，未见凋亡特征性的梯状条带2.4香薷三萜混合物(高热灵)对猪蓝耳病毒(PRRSV)诱导猪肺泡巨噬细胞PAM凋亡的影响采用PI染色FCM检测细胞凋亡以观察香薷素混合物(高热灵)对谷氨酸诱导猪肺泡巨噬细胞RAW凋亡的影响。正常细胞组凋亡率为16.84%;香薷三萜混合物(高热灵)单独处理组24小时后，凋亡率为3.6%；6.Omg/L猪蓝耳病毒(PRRSV)作用96小时后，猪肺泡巨噬细胞PAM的凋亡率为88.43%；用300μmol/L香薷三萜混合物(高热灵)预处理24h，再加6.0mg/L猪蓝耳病毒(PRRSV)作用96小时后，猪肺泡巨噬细胞PAM的凋亡率下降至16.0%。香薷三萜混合物(高热灵)对猪肺泡巨噬细胞PAM有显著的保护作用。实施例10香薷三萜及香薷三萜混合物(高热灵)抑杀蓝耳病毒的细胞实验采用香薷三萜及香薷三萜混合物(高热灵)的小鼠含药血清，对Marc-145细胞感染蓝耳病毒模型，进行香薷三萜及香薷三萜混合物(高热灵)抑杀蓝耳病毒的细胞实验。1、小鼠血清对细胞无毒界限的测定吸除Marc-145细胞培养瓶中的生长液，取小鼠血清0.lml(l10,1100，11000稀释)加入维持液0.9ml，37°C孵育，96小时观察结果(每个浓度做8瓶)凡最高剂量不出现细胞破坏者即为该药的无毒界限。2、治疗法测定香薷三萜、香薷三萜混合物(高热灵)及三个部位的药效先用维持液将PRRSV作1000TCID50稀释。再用定量稀释后的PRRSV液对含香薷三萜、香薷三萜混合物(高热灵)及三个部位的小鼠血清进行稀释(浓度为0.25%)，然后加入到96孔细胞培养板上，每孔200uL，每个样做8孔。将倍比稀释后的药物与PRRSV混悬液混勻密封后于37°C、5%CO2培养箱作用lh，然后加入到另一块各孔长成单层Marc-145细胞的96孔板孔内，并设细胞对照、病毒对照。每孔加IOOuL，96h后记录细胞病变，出现25%以上病变记为+，无病变记为_。3、预防法测定香薷三萜和三个部位的药效先将无毒浓度的含香薷三萜、香薷三萜混合物(高热灵)及三个部位的小鼠血清(浓度为0.25%)加入到长成单层的Marc-145细胞96孔板上，每孔IOOuL,每个样做8孔，放入37°C、5%C02培养箱中作用2h，然后加入1000TCID50稀释的PRRSV，每孔IOOuL,并设细胞对照，病毒对照，96h后记录细胞病变，出现25%以上病变记为+，无病变记为_。4结果4.1TCID50测定将病毒接种细胞96h后，测得PRRSV的TCID50为1(T6·5°/0.ImL0小鼠血清对Marc-145细胞无毒浓度确定选择对未贴壁的Marc-145和单层Marc_145均无影响的最大浓度作为该药对Marc-145的无毒浓度。结果96h后测得小鼠血清对Marc-145细胞的无毒浓度为4mg/mL。4.2香薷三萜、香薷三萜混合物(高热灵)及三个部位的小鼠血清对PRRSV的直接杀灭作用由表1可知，含香薷三萜、香薷三萜混合物(高热灵)的小鼠血清与PRRSV作用后，PRRSV致Marl45细胞病变作用不明显；含香薷香酚的小鼠血清与PRRSV作用后，PRRSV致Marl45细胞病变作用明显减轻；含香薷黄酮部位的小鼠血清与PRRSV作用后，PRRSV致Marl45细胞病变作用有一定的效果。表1含香薷三萜、香薷三萜混合物(高热灵)及三个部位的小鼠血清对PRRSV的直接杀灭作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.3含香薷三萜、香薷三萜混合物(高热灵)及三个部位的小鼠血清对PRRSV的阻断作用由表2可知，含香薷三萜小鼠血清和含香薷三萜混合物(高热灵)的小鼠血清与Marc-145细胞作用后，PRRSV引起CPE不明显，对PRRSV具有很好的阻断作用；含香薷香酚的小鼠血清与与Marc-145细胞作用后，PRRSV只引起小量的CPE，具有明显的阻断作用；含香薷黄酮部位的小鼠血清与Marc-145细胞作用后，PRRSV引起CPE显著，有一定的的阻断作用。表2含香薷三萜、香薷三萜混合物(高热灵)及三个部位的小鼠血清对PRRSV的阻断作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求香薷三萜在制备防治猪免疫抑制性病毒感染药物的用途及应用；2.根据权利要求1所述的香薷三萜，其特征在于包含3，25-环氧-20，3a，70-三羟基齐墩果-12-烯-28-酸(C31H4805)、23，33，23-三羟基齐墩果_12_烯-28-酸(C3QH4Q05)、33-当归酰基-23，23-二羟基齐墩果-12-烯-28-酸(C35H5406)、33-异当归酰基_23，23-二羟基齐墩果-12-烯-28-酸(C35H5406)、33-乙酰基齐墩果-12-烯-28-酸(C23H5Q04)、齐墩果酸(c3QH48o3)、谷甾醇(c29h5Qo)中的任意二种或二种以上组成；3.根据权利要求1所述的药物，其特征在于香薷三萜单独或与等量的黄芪或等量的党参或等量的板兰根或1/3量的黄芪提取物或1/3量的党参提取物或1/3量的板兰根提取物配伍，制备防治猪免疫抑制性病毒感染的药物；4.根据权利要求1所述的药物，其特征在于香薷三萜与等量的碳酸钙粉或其它药学上可接受的固性载体混合，制备防治猪免疫抑制性病毒感染的散剂药物；5.根据权利要求1所述的药物，其特征在于香薷三萜与等量的纯净水或其它药学上可接受的液性载体混合，制备防治猪免疫抑制性病毒感染的水剂药物；6.根据权利要求1所述的药物，其特征在于香薷三萜与等量的注射用水或其它药学上可接受的液性载体混合，制备防治猪免疫抑制性病毒感染的针剂药物；7.根据权利要求1所述的用途及应用，其特征在于用权利要求3所制备的防治猪免疫抑制性病毒感染的药物，按每天每公斤猪重1克香薷三萜的效价计算所需的用药量，拌料饲喂(进食的猪)或灌服(废食或绝食的猪)或肌肉注射(废食或绝食的猪)感染猪蓝耳病(PRRS)病毒或猪瘟(HCV)病毒或猪流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒引起高热的病猪；8.根据权利要求1所述的用途及应用，其特征在于用权利要求4所制备的防治猪免疫抑制性病毒感染的散剂药物，按每天每公斤猪重1克香薷三萜的效价计算所需的用药量，拌料饲喂还能进食的、感染猪蓝耳病(PRRS)病毒或猪瘟(HCV)病毒或猪流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒引起高热的病猪；9.根据权利要求1所述的用途及应用，其特征在于用权利要求5所制备的防治猪免疫抑制性病毒感染的水剂或针剂药物，按每天每公斤猪重1克香薷三萜的效价计算所需的用药量，灌服已废食或绝食的、感染猪蓝耳病(PRRS)病毒或猪瘟(HCV)病毒或猪流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒引起高热的病猪；10.根据权利要求1所述的用途及应用，其特征在于用权利要求6所制备的防治猪免疫抑制性病毒感染的针剂药物，按每天每公斤猪重1克香薷三萜的效价计算所需的用药量，肌肉注射已废食或绝食的、感染猪蓝耳病(PRRS)病毒或猪瘟(HCV)病毒或猪流感(SIV)病毒等免疫抑制性病毒引起高热的病猪。全文摘要本发明公开了香薷三萜在制备防治猪免疫抑制性病毒感染药物的用途及应用。首次利用香薷三萜对免疫抑制性病毒感染引起的猪高热病有关键性的防治作用，制备以香薷三萜为主要作用成份的猪免疫抑制性病毒感染防治药物，达到感染早期死亡率控制在10％以下，有效率90％以上，治愈率80％以上的显著效果，解决了目前猪免疫抑制性病毒感染无有效药物治疗的难题。文档编号A61K36/315GK101829122SQ201010173419公开日2010年9月15日申请日期2010年4月28日优先权日2010年4月28日发明者杨浚申请人:杨浚