专利名称：一种用于原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的主动靶向脂质体载体系统的制作方法
技术领域：
本发明属药物制剂领域，涉及一种用于原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的主动靶向脂质体载体系统，具体涉及由含有LyP-I (氨基酸序列为CGNKRTRGC)序列的多肽修饰的主动靶向脂质体载体系统、制备方法及其医药用途。
背景技术：
随着人类生存环境的恶化，诱发癌症的因素越来越多，癌症的发病率呈明显的上升趋势。癌症已成为威胁人类健康和生命的主要疾病。淋巴转移是实体瘤转移的重要途径， 也是肿瘤导致患者死亡的重要原因。淋巴转移一般发生在肿瘤早期或中期，如不及时控制， 可能导致肿瘤细胞经淋巴回流至血流扩散，引发更广泛的肿瘤转移。据临床研究统计，60% 恶性肿瘤患者初诊时即已发生淋巴转移。目前临床上对肿瘤的常规治疗方法是切除原发瘤和淋巴清扫之后，进行全身化疗或放疗。但是，外科手术不能彻底清除肿瘤转移的淋巴结， 从而导致肿瘤复发；化疗药物静注后，药物到达肿瘤转移淋巴结的几率很小，目前尚无有效的手段加以控制和治疗。因此，对淋巴转移肿瘤进行靶向治疗具有重要的临床现实意义。鉴于机体组织间隙生理学特点(含众多有亲水性孔道(约IOOnm)，毛细淋巴管壁孔隙(30-120nm)大于毛细血管壁孔隙(< lOnm))，通过组织间隙注射一定纳米尺度(如 SOnm左右)的载药系统，可以将其靶向至淋巴系统。目前用于靶向淋巴系统递药的纳米载体包括活性炭、硅粒、高分子聚合物、脂质体、纳米粒、纳米乳和聚合物胶束等。在各种纳米载体中，脂质体以其天然结构特性、便于修饰、易于粒径控制和亲水亲脂性药物兼可包载等的优越性，被认为是最适合的淋巴系统靶向载体。但在脂质体具体实施淋巴系统靶向过程中普遍存在如下问题①脂质体经组织间隙注射后，淋巴吸收不完全，部分滞留于注射部位组织间隙，滞留量约为总给药剂量的10-40%，反复注射含抗肿瘤药物脂质体，会导致局部组织损伤甚至坏死；②进入淋巴系统的脂质体因机械截留或巨噬细胞吞噬而在正常淋巴结中蓄积，易造成正常淋巴组织损伤；③脂质体在淋巴结中蓄积是一个被动过程，对正常淋巴结和肿瘤转移淋巴结没有选择性，甚至会因肿瘤转移所致淋巴结结构破坏而无法截留或吞噬脂质体时，被肿瘤转移淋巴结摄取脂质体量反而低于正常淋巴结，影响其靶向治疗效果。 其中，前两个问题有研究已采用"压力补偿"和"饱和巨噬细胞"策略对其给予了较好的解决并获得中国发明专利(ZL2005100M046. 8)。但第三个问题-脂质体对肿瘤转移淋巴结的靶向递药问题仍未得到有效解决。近期研究发现，肿瘤诱导的淋巴管新生现象是促进肿瘤发生淋巴转移的重要因素，并发现淋巴管内皮细胞上的两种蛋白VEGFR-3和VEGFR-2是淋巴管新生过程中所需受体，故有研究者利用VEGFR-3和VEGFR-2的抑制剂来抑制肿瘤组织和淋巴结内的淋巴管新生，从而达到抑制肿瘤淋巴转移的目的。结果表明，这种治疗方法对前期肿瘤治疗效果良好，能有效抑制肿瘤转移，但对已发生淋巴管增生或者发生转移的肿瘤则基本无效。LyP-I是一种通过噬菌体展示技术筛选得到的环状九肽，其不仅对原位肿瘤具有靶向性，而且对淋巴转移肿瘤也具有靶向能力。LyP-I能靶向的肿瘤包括黑色素瘤(MDA-MB-435)、乳腺癌(MMTV-PyMT)、前列腺癌(TRAMP)、皮肤癌(K14-HPV16)、骨肉瘤 (KRIB)等；LyP-I对淋巴转移肿瘤的靶向性是基于其与肿瘤细胞和肿瘤内淋巴管内皮细胞的特异亲和性识别。现有研究者利用LyP-I修饰白蛋白纳米粒和叠氮纳米粒，还有研究者制备了能够表达LyP-I的病毒性载体，所有这些载药系统都表现出良好的主动靶向至原位肿瘤的效果。目前还未见将LyP-I用于修饰脂质体的报道，也未见将其用于原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的主动靶向脂质体载体系统。本发明构建了一种由含LyP_l(氨基酸序列为CGNKRTRGC)序列的多肽与脂质体组成载体系统，其中LyP-I序列多肽由两个半胱氨酸通过二硫键连接成环状结构。该脂质体载体系统可用于实现向原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的靶向递药。本发明提供的脂质体载体系统可通过皮下组织间隙注射或肌肉注射将脂质体被动引流至淋巴系统内，通过LyP-I的介导作用靶向至肿瘤转移淋巴结。所述的系统也可直接通过静脉注射给药，通过肿瘤EI5R效应和LyP-I介导作用将其靶向至原位肿瘤和淋巴转移肿瘤。所述的脂质体载体系统可用作原位肿瘤和淋巴转移肿瘤诊断或治疗的药物靶向递送。本发明中，含LyP-I序列的多肽通过固相合成法合成，HPLC(高效液相色谱法)和 MS (质谱法)表征其结构。对其进行荧光素FAM (羧基荧光素)标记考查其体外肿瘤细胞摄取和体内对原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的靶向性，结果证实LyP-I对体外肿瘤细胞和体内原位肿瘤和淋巴转移肿瘤具有特异靶向性。本发明中，脂质体载体系统的膜材料包括以下成分a:天然磷脂或合成磷脂， 和b 胆固醇，和c 甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物(甲氧基聚乙二醇的分子量为1000 5000)，和d 含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物(聚乙二醇的分子量为1000 8000)。各成分之间的摩尔比为a :b = 5:l l:2，a: c = 1000 1 1000 100， aid= 1000 1 1000 100。所述的天然磷脂或合成磷脂可以是蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、 二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂。所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物和含LyP-I序列多肽的多肽-聚乙二醇_磷脂复合物中的磷脂可以是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。所述的含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，通过以下两种方式合成1、含LyP-I序列的多肽提供一个游离巯基，聚乙二醇-磷脂提供一个马来酰亚胺基，两者发生特异性反应而连接成共价复合物，其反应式如下
权利要求
1.一种用于原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的主动靶向脂质体载体系统，其特征在于，由含 LyP-I序列的多肽与脂质体组成，其中LyP-I序列多肽由两个半胱氨酸通过二硫键连接成环状结构；所述的LyP-I氨基酸序列为CGNKRTRGC。
2.按权利要求1所述的用于原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的主动靶向脂质体载体系统，其特征在于，所述的脂质体其膜材料选自下述成分a 天然磷脂或合成磷脂，和b 胆固醇，和 c 甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物，和d 含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物；所述的脂质体膜材料成分的摩尔比为a b = 5 1 1 2，a C=IOOO 1 1000 100，aid= 1000 1 1000 100。
3.按权利要求2所述的脂质体载体系统，其特征在于，所述的天然磷脂或合成磷脂选自蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、I"棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。
4.按权利要求2所述的脂质体载体系统，其特征是，所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中甲氧基聚乙二醇分子量为1000 5000，所述的含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中聚乙二醇分子量为1000 8000。
5.按权利要求2所述的脂质体载体系统，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物或含LyP-I序列多肽的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
6.按权利要求2所述的脂质体载体系统，其特征是所述的含LyP-I序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物中，LyP-I序列多肽通过共价键形式与聚乙二醇-磷脂连接而成复合物。
7.按权利要求6所述的脂质体载体系统，其特征是所述的含LyP-I序列的多肽提供一个游离巯基，聚乙二醇-磷脂提供一个马来酰亚胺基，两者发生特异性反应而连接成共价复合物；或者含LyP-I序列的多肽提供一个游离氨基，聚乙二醇-磷脂提供一个N-羟基琥珀酰亚胺基，两者发生特异性反应而连接成共价复合物。
8.按权利要求1所述脂质体载体系统，其特征是所述的脂质体粒径范围为20 500nmo
9.权利要求1所述的脂质体载体系统在制备用于原位肿瘤或淋巴转移肿瘤靶向诊断或治疗药物中的用途。
10.按权利要求9所述的用途，所述的药物通过静脉注射、皮下注射或肌肉注射给药。
全文摘要
本发明属药物制剂领域，涉及一种用于原位肿瘤和淋巴转移肿瘤的主动靶向脂质体载体系统，该载体系统由含LyP-1氨基酸序列为CGNKRTRGC序列的多肽与脂质体组成，其中LyP-1序列多肽由两个半胱氨酸通过二硫键连接成环状结构。该脂质体载体系统可通过皮下组织间隙注射或肌肉注射将脂质体被动引流至淋巴系统内，通过LyP-1的介导作用靶向至肿瘤转移淋巴结。该系统也可直接通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应和LyP-1介导作用将其靶向至原位肿瘤和淋巴转移肿瘤。本发明脂质体载体系统可用作原位肿瘤和淋巴转移肿瘤诊断或治疗的药物靶向递送。
文档编号A61K49/14GK102266565SQ201010192398
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月3日 优先权日2010年6月3日
发明者占昌友, 孟庆刚, 王飞, 谢操, 闫志强, 陆伟跃, 顾炳 申请人:复旦大学