专利名称：在制备防治脂多糖诱导的急性肝损伤的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物的新应用，特别涉及G56976在制备防治脂多糖诱导的急性肝 损伤的药物中的应用。
背景技术：
蛋白激酶D(Pr0tein kinase D，PKD)是一个新近发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激 酶，具有独特的结构、酶学特性和调节特性。PKD可被多种刺激物激活，激活方式与其催化 结构域的激活环内丝氨酸744/748 (Ser-744/748)和丝氨酸916(Ser_916)的磷酸化有关。 研究显示PKD参与了氧化应激、信号转导、基因表达和细胞存活等多种细胞反应过程。新近 研究发现PKD在宿主防御反应过程中发挥了关键性作用。例如，PKD可以磷酸化Toll样受 体5(Toll like receptor 5，TLR5)第805位丝氨酸，这种磷酸化可能是炎症信号传导所 必须的，因为用药物抑制PKD或沉默PKD基因表达可以抑制p38细胞丝裂原活化蛋白激酶 (p38mitogen-activated protein kinase, p38MAPK)的激活、减少鞭毛素刺激细胞分泌白 细胞介素8(丨壯61~16111^11-8，11^-8)。有研究显示PKD还与Toll样受体2、4、9 (TLR2，4，9)介 导的下游信号通路的激活(如MAPKs)以及巨噬细胞分泌细胞因子有关。宿主对抗入侵的微生物病原体的防御反应通常是由模式识别受体 (patternrecognition receptor,PRR)和微生物病原体的保守分子模式结合启动的。脂多 糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的主要致病成分，革兰氏阴性细菌 感染大多数起源于肠道。肝脏由于能清除细菌及其毒性成分，因而成为机体对抗肠源性内 毒素血症的第一道防线。然而，肝脏同时也成了受害者，要遭受寄居于肝脏的巨噬细胞活化 引起的失调性炎症反应，后者可损害肝脏的防御功能，并且是不良预后的前兆。越来越多的 证据表明PKD是人体抵抗病原微生物感染的先天性防御反应中的一个关键的信号调节因 子。有研究进一步证实LPS可以激活PKD，活化的PKD是促炎因子基因转录所必须的。但至 今少有研究PKD是否及如何参与LPS诱导的炎症驱动的肝损伤过程。蛋白激酶C (Protein kinase C，PKC)家族分为3个亚型经典型(α，β和 Y)、新奇型(S，ε，η和Θ)和非典型(μ，ja和ξ )，PKD最初曾被称为非典型的 PKCy (Rozengurt E. J Biol Chem 2005 ；280 13205-8)。G06983是最常用的 PKC 抑制剂， 可以抑制大多数PKC亚型但不能抑制PKD，而G66976除了可以抑制部分PKC，还可以独特 的抑制PKD。Go6976Go698
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于确认PKD抑制剂G56976是否能够对抗LPS诱导的 急性肝损伤，从而确认G06976在制备防治LPS诱导的急性肝损伤的药物中的应用可能性。为实现上述目的，本发明进行了如下实验通过注射D-氨基半乳糖/脂多糖(LPS/D-GalN)构建小鼠急性肝损伤模型并分别 给予G66976和G66983治疗，同时进行如下检测①观察注射LPS/D-GalN后48小时内小 鼠的死亡率；②注射后0. 5小时，采用Western blot法检测小鼠肝组织中PKD (Ser744/748 和Ser 916)、ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平；③注射后1. 5小时，分别用ELISA法和 RT-PCR法测定小鼠血清和肝组织中肿瘤坏死因子α (TNF-α)水平；④注射后6小时，检 测小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性；并取小鼠肝组织作组织 学观察、Hoechst 33342染色检测肝细胞凋亡率、半胱天冬酶_3 (Caspase-3)和半胱天冬 BI-S(Caspase-S)活性检测、黏附分子测定、髓过氧化物酶(MPO)活性测定。结果显示: G66976对LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，能够显著降低LPS/D-GalN 诱导的PKD磷酸化水平、ALT和AST水平，明显提高LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤小鼠的 生存率，并能改善LPS/D-GalN诱导的炎症反应，抑制LPS/D-GalN活化MAPK信号通路，减少 LPS/D-GalN诱导的TNF-α产生，减少肝细胞凋亡，降低caspases活化及肝组织黏附分子表 达，显著降低LPS/D-GalN诱导的MPO活化水平。由此，本发明确认了 PKD抑制剂G66976能够对抗LPS诱导的急性肝损伤，从而提 供了G56976在制备防治LPS诱导的急性肝损伤的药物中的应用。进一步，所述防治脂多糖诱导的急性肝损伤的药物通过抑制蛋白激酶D的活性发 挥作用。本发明的有益效果在于本发明确认了 PKD抑制剂G66976能够对抗LPS诱导的 急性肝损伤，提供了G66976在制备防治LPS诱导的急性肝损伤的药物中的新应用，拓宽了 G36976的应用领域，并为LPS诱导的急性肝损伤的临床治疗提供了一种新的方案，具有积 极、显著的社会意义和经济意义。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述图1为用Western blot法检测PBS空白组、模型组、G06976治疗组及G66983治疗组小鼠肝组织中PKD磷酸化水平；图2为PBS空白组、模型组、G56976治疗组及G56983治疗组小鼠48小时内存活 率分析；图3为PBS空白组、模型组、G66976治疗组及G66983治疗组小鼠血清中ALT和 AST浓度分析；图4为PBS空白组㈧、模型组⑶、(3δ6976治疗组(c)及(3δ698:3治疗⑶小鼠 的组织病理切片；图5为用Western blot法检测PBS空白组、模型组、G66976治疗组及G66983治 疗组小鼠肝组织中ERK、JNK和P38MAPK磷酸化水平；图6为PBS空白组、模型组、G66976治疗组及G66983治疗组小鼠血清中TNF- α 蛋白水平；图7为PBS空白组、模型组、G56976治疗组及G66983治疗组小鼠肝组织中 TNF-α蛋白水平；图8为PBS空白组、模型组、G06976治疗组及G56983治疗组小鼠肝组织中 TNF- α mRNA 水平；图9为Hoechst 33342染色检测PBS空白组、模型组、G66976治疗组及G66983 治疗组小鼠的肝细胞凋亡数；图10为PBS空白组、模型组、G66976治疗组小鼠肝组织中caspase-3和 caspase-8 舌f生；图11为Western blot法检测PBS空白组、模型组、G66976治疗组及G66983治 疗组小鼠肝组织中ICAM-I、VCAM-I和ELAM-I蛋白表达；图12为PBS空白组、模型组、G56976治疗组及G56983治疗组小鼠肝组织中MPO活性。
具体实施例方式以下将参照附图，对PKD抑制剂G56976抗LPS诱导的急性肝损伤的作用进行详 细的描述。G56976 禾口 G66983,购自美国 Sigma 公司(No.G1171 禾口 NO-G1918)； LPS (Escherichia coli，0111 :B4)、D-GalN (D_ 氨基半乳糖)购自 Sigma 公司；磷酸化 PKD (Ser744/748和Ser916)抗体、磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracelIular signal-regulated kinase, p-ERK) > 舞酸 it c-Jun M 基末端激 Bl (phospho-c-Jun N-terminal kinase, p-JNK)、磷酸化 p38MAPK(p-p38MAPK)禾Π β -actin 抗体购自 Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)；细胞间粘附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞粘附分子-l(vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1)、内皮白细胞粘附分子-1 (endothelial leukocyte adhesion molecule-1, ELAM-1)抗体购自Abeam (Cambridge，UK)；辣根过氧化物酶结合的羊抗兔抗体、BCA蛋白检 测试剂盒和化学发光增强剂购自Pierce Biotechnology (Rockford，IL, USA) ；ALT、AST和 MPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，caspase-3和caspase-8比色测定试剂盒购自南京Beyotime生物技术研究所，小鼠TNF-α酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自 Bender MedSystems (Vienna, Austria) ；Balb/c 小鼠(2-8 周龄，体重 20_22g)购自第三军 医大学实验动物中心。一、实验方法将小鼠分为四组，分别为PBS空白组(腹腔注射PBS)、模型组(腹腔注射LPS/ D-GalN)、G66976治疗组(腹腔注射 LPS/D-GalN+2. 5mgGo6976)及G66983 ,治疗组(腹 腔注射 LPS/D-GalN+2. 5mg G56983 )。1、观察各组注射后48小时内小鼠死亡率(每组10只)。2、注射后0. 5小时取肝组织，采用Western blot法检测PKD (Ser744/748和 Ser916)、ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平(每组5只)。Western blot法蛋白提取试剂盒 抽提肝组织样本总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度，取40 μ g蛋白，用SDS-PAGE 电泳进行分离，再转移至硝酸纤维素膜上，用5% (w/v)的脱脂奶粉封闭，与兔抗多克隆抗 体(1 2000) 4°C孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1 10000)，采用 ECL化学发光系统显示抗体结合情况，并用X光片曝光(Kodak，Japan)。3、注射后1. 5小时采集小鼠血清和肝组织，分别用ELISA法和RT-PCR法测定小鼠 血清和肝组织中TNF- α水平(每组5只)。RT-PCR法利用Trizol试剂提取细胞总RNA， 每个样本各取总RNA 1 μ g进行逆转录，PCR扩增TNF- α反应总体系25 μ 1，条件94°C预变 性5分钟，94°C变性1分钟，58°C复性30秒，72°C延伸30秒，循环34次，最后72°C总延伸10 分钟。取5μ 1的PCR反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像仪紫外观察 结果并照相。引物序列和扩增片段长度如下TNF-α上游引物5:GGC AGG TCT ACT TTG GAGTCA TTG C_3~ (SEQ ID No. 1)；下游引物5~_ACA TTC GAG GCT CCA GTGMTTCG G_3~ (SEQ ID No. 2)；扩增片段300bp。内参 β-actin上游引物5~_TGG AATCCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3~ (SEQ ID No. 3)；下游引物5~-TMAAC GCAGCT CAG TAA CAG TCC G_3~ (SEQ ID No. 4)； 扩增片段349bp。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。4、注射后6小时取小鼠血清检测ALT和AST活性；取肝组织作组织学观察、 Hoechst 33342染色观察、Caspase-3/8蛋白酶活性检测、黏附分子测定、髓过氧化物酶 (MPO)活性测定(每组5只)。①组织学观察肝组织样本经10%福尔马林固定，常规脱水， 石蜡包埋，4 μ m切片，常规HE染色及光镜观察。②Hoechst 33342染色观察在石蜡包埋 的半薄切片上用荧光染料Hoechst 33342 (1 10，000)染色5 10分钟，荧光显微镜观察 并照相，随机观察100个细胞核，计算凋亡细胞百分比。③Caspase-3/8蛋白酶活性检测 用caspase-3和caspase-8比色测定试剂盒检测肝组织勻浆后，10，OOOg离心1分钟，取 上清(100g蛋白)分别与作用底物Ac-DEVD-pNA和Ac-IETD-pNA以及反应缓冲液37°C孵育 90分钟，测量405nm荧光吸光值。④MPO活性测定将冷冻的肝组织复溶并用含0. 5%十六 烷基三甲基铵溴化物(hexadecyltrimethylammonium bromide)的磷酸盐缓冲液勻浆，应用 MPO检测试剂盒在450nm处的吸光值，评估MPO活性，用同一样本的总蛋白浓度进行标准化 处理。实验结果以平均数士标准差表示，各组均数间的差异用Student's test或ANOVA 评估，生存率统计用Kaplan-Meier curve和log-rank test, P < 0. 05为差异显著。二、实验结果
1、LPS活化D-GalN致敏小鼠体内PKD为了分析PKD的活化状态，我们采用特异性识别磷酸化PKD的抗体来检测小鼠肝 组织PKD磷酸化水平。如图1所示，PBS空白组未检测到磷酸化PKD，而LPS可明显诱导PKD 磷酸化，提示PKD在这个病理过程中被激活。用PKD抑制剂G66976处理可显著降低LPS诱 导的PKD磷酸化水平，但PKC抑制剂G06983对PKD磷酸化仅有微弱影响。2、PKD抑制剂G56976降低LPS/D-GalN处理小鼠的死亡率和肝毒性LPS/D-GalN 处理几乎可导致24小时内所有小鼠死亡，G66976处理可明显降低死亡率，而G66983则 无此保护效应(图2)。LPS/D-GalN处理可引起小鼠血清ALT和AST水平显著升高，G56976 处理可明显降低ALT和AST水平(图3)。组织学观察发现LPS/D-GalN处理6小时后小鼠 肝组织可见弥漫坏死、炎细胞浸润和出血等改变。G66976处理组小鼠肝组织仅见肝细胞 点状坏死和轻微的炎症反应，而PKC抑制剂G66983对肝损害则无明显保护作用(图4)。3、PKD抑制剂G56976抑制LPS/D-GalN活化MAPK信号通路LPS通过TLR4的识别可启动细胞内信号通路，引起各种促炎相关基因的转录。 MAPKs家族是一个有代表性的主要的信号通路，它们可被许多炎性刺激激活，并在机体防御 反应和炎性损伤过程中发挥关键作用。检测结果显示，LPS/D-GalN处理30分钟后小鼠肝 组织ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平显著升高，用PKD抑制剂G66976处理可明显降低 其磷酸化(图5)，提示PKD是由TLR配体刺激所致的MyD88依赖性MAPKs活化所必需的。4、PKD 抑制剂G66976减少 LPS/D-GalN 诱导产生 TNF- αTNF-α是LPS/D_GalN诱导小鼠急性肝损伤模型的关键性炎症介质，具有直接 的细胞毒性和启动炎症级联反应的功能，在肝损伤的发生发展过程中有重要作用。LPS/ D-GalN处理可诱导小鼠血清和肝组织TNF-α蛋白水平显著升高，G66976处理可明显降低 TNF- α蛋白水平(图6和图7) ；LPS/D-GalN处理可诱导小鼠血清和肝组织TNF- α mRNA水 平显著升高，G66976处理可明显降低肝组织TNF- α mRNA水平(图8)。G56976显著降低 TNF-α水平可能是其具有保肝效应的主要原因。5、PKD抑制剂G66976减少肝细胞凋亡和caspases-3/8的活化TNF- α可以通过55—kDa的月中瘤坏死因子受体1 (tumor necrosis factor receptorLTNF-R1)的死亡结构域激活多种凋亡信号通路。该死亡结构域可诱导和活化前 caspase-8 (procaspase-8) ^τ^ψ Μ^ caspase-3, j^sJji'Jltfg'-^illi^o caspase-3 i—f 中枢性效应蛋白酶，可以催化许多关键的凋亡相关细胞蛋白的特异性酶切反应。利用Hoechst 33342染色来检测凋亡的肝细胞，发现LPS/D-GalN处理可诱 导大量的肝细胞凋亡(34. 7士5. 6/100个细胞核)，G66976处理可使凋亡率显著降低 (10. 4士3. 4/100个细胞核)，详见图9。与此一致的是G56976处理组肝组织caspase-3和 caspase-8的活性也明显降低(图10)，提示PKD抑制剂处理组小鼠肝组织的凋亡信号通路 被有效阻断。6、PKD抑制剂减少肝组织黏附分子表达和降低MPO活化除了直接的肝毒性，TNF-α还具有加重炎症反应的作用。在炎症反应的早期 TNF-α即可激活枯否氏细胞(Kupffer cells)、中性粒细胞、内皮细胞和肝细胞，导致许多 促炎因子的转录激活和肝组织中性粒细胞的浸润。在肝实质浸润的中性粒细胞可以通过启 动呼吸爆发和中性粒细胞脱颗粒作用介导肝细胞的氧化损伤。
中性粒细胞的募集是炎症的典型特征，这种募集作用受到一系列粘附分子的密切 调控。粘附分子和中性粒细胞及内皮细胞的复杂的交互作用控制着中性粒细胞的停驻、粘 附和游走。细胞间粘附分子-ι是一个极其关键的粘附分子，介导着中性粒细胞和内皮细胞 的相互作用。通过western blotting检测了肝组织ICAM_1、VCAM_1和ELAM-1的表达。结 果显示LPS/D-GalN处理可显著提高小鼠肝组织ICAM-I、VCAM-I和ELAM-I蛋白的诱导表 达，G56976处理可明显减少这些蛋白的表达(图11)。与这些结果相一致的是，利用MPO 活性测定法分析发现PKD抑制剂处理组小鼠肝组织内MPO活性明显降低(图12)，提示PKD 抑制剂可以负性调控小鼠肝组织的炎症反应。结果显示PKD活化并参与了 LPS/D-GalN诱导的小鼠急性肝损伤病理发展过程， 提示PKD可能是炎症性肝病的一个新的潜在有价值的治疗靶点。应用PKD抑制剂G06976 处理可明显减轻肝损伤的程度，包括降低血清转氨酶水平和缓解了肝脏组织病理学改变； 抑制肝组织MAPKs信号通路的激活、下调TNF- α和黏附分子的表达，降低凋亡和降低MPO 活性，并可显著提高LPS/D-GalN处理小鼠存活率。结果表明PKD抑制剂G06976对LPS/ D-GalN诱导小鼠急性肝损伤具有保护效应，从而确认了G56976在制备D-氨基半乳糖/脂 多糖诱导的急性肝损伤中的药物的应用。本专利在实验方案设计时同时联合应用和G06983两种抑制剂，以便鉴 定起关键作用的是PKD，而不是其它PKC亚型。根据上述设计的实验结果显示，应用PKD抑 制剂G66976处理可明显抑制LPS/D-GalN诱导的PKD活化、减轻肝损伤的程度、抑制MAPKs 信号通路的激活、下调TNF-α并可显著提高小鼠存活率。而PKC抑制剂G66983则没有上 述保护效应。因G56983可抑制PKC但不能抑制PKD，而G66976既可抑制PKC，又可抑制 PKD,所以推断出是PKD而不是PKC在LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤中起了关键作用，也只 有其抑制剂G66976具有明显的保护效应。另外，本发明构建的D-GalN/LPS所诱发的动物肝损伤模型被公认为与临床上急 性重症肝炎(急性肝坏死)病情相似，其中，D-GalN为特异性肝细胞损伤药物，可耗竭肝细 胞内三磷酸尿嘧啶核苷，抑制RNA合成；促使肥大细胞脱颗粒，释放组胺，引发结肠水肿，肠 源性内毒素吸收增加，从而增强机体对LPS的敏感性。因此，D-GalN充当了 LPS诱导的急 性肝损伤的增敏剂。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
在制备防治脂多糖诱导的急性肝损伤的药物中的应用。FSA00000160100700011.tif
2.根据权利要求1所述的G66976的应用，其特征在于所述防治脂多糖诱导的急性 肝损伤的药物通过抑制蛋白激酶D的活性发挥作用。
全文摘要
本发明涉及化合物的新应用，特别涉及在制备防治脂多糖(LPS)诱导的急性肝损伤的药物中的应用，蛋白激酶D(PKD)抑制剂对脂多糖所诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，能显著降低LPS诱导的PKD磷酸化水平，降低死亡率、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平；并能改善炎症反应，抑制LPS活化p38细胞丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路，降低LPS诱导产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，减少肝细胞的凋亡数量及半胱天冬酶(caspases)的活化及肝组织黏附分子表达水平，同时降低髓过氧化物酶抗体(MPO)活化水平。
文档编号A61K31/407GK101897699SQ20101020116
公开日2010年12月1日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者刘友生, 徐小明, 朱江, 段光杰, 许成燕 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院