维生素c转运体产生促进剂的制作方法

专利名称：维生素c转运体产生促进剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有维生素C转运体产生促进作用的化合物和植物。此外，涉及利用 该化合物和植物的维生素C吸收促进用组合物、含该维生素C吸收促进用组合物的美白用 组合物或胶原合成促进用组合物。
背景技术：
维生素C作为生物体中的水溶性抗氧化物质，对超氧阴离子和其他的活性氧物种 具有优异的抗氧化作用，预防细胞内的脂质成分的氧化。此外，通过控制已知作为胶原合成 中的脯氨酸残基的羟基化和黑素合成的限速酶的酪氨酸酶、维生素C的螯合作用带来的铁 运送的调整、进而调节氧化和还原来参与各种酶反应。虽然为具有多功能的维生素C，但土 拨鼠和包括人类在内的灵长类由于欠缺L-古洛糖酸内酯氧化酶而没有维生素C合成能力， 进而认为维生素C由于具有水溶性的性质、与其他脂溶性维生素相比生物体保持时间短， 因而容易导致维生素C的功能不足。作为由维生素C的缺乏而引起的疾病，列举坏血病、创伤治愈能力的降低、骨和结 缔组织的障碍、血管运动的不稳定化等。进而，维生素C对于包括心疾病、癌、白内障、感冒 等各种疾病而作为予防或治疗目的使用(非专利文献1)。此外，除了疾病以外，还大量提供 以对肌肤美白和肌肤的滋润强化、以及抗老化作用为目的的维生素C制剂。另一方面，尽管大量报导了关于维生素C的功能和其有效性的见解，但关于维生 素C向各组织的摄入原理，不明确的点仍然很多。1999年Tsukaguchi等人成功从大鼠克隆 了承担维生素C的摄入的膜蛋白质，并发现以钠离子维生素C = 2 1的比例向细胞内 输送的钠依赖性维生素C转运体(SVCT)(非专利文献2)。在其后的研究中，明确了人类也 存在维生素C转运体，此外，明确了维生素C转运体中存在1型(SVCTl)和2型(SVCT2)2 种亚型。SVCTl主要分布于小肠、肝脏、肾脏、大肠、子宫、前列腺等的上皮组织，SVCT2广泛 分布于肺、骨格肌肉、眼、骨、脑等内皮组织。虽然均为特异性输送维生素C，但通过动力学分 析可知SVCT2比SVCTl特异性优异(非专利文献3)。Alexander等人研究了伴随年龄增长的维生素C保有量与维生素C转运体的表达 量的关系，报导了大鼠肝脏中维生素C转运体(SVCTl)的表达量降低和维生素C保有量的 减少(非专利文献4)。作为维生素C保有量降低的予防或改善的方法，列举了维生素C的 继续摄取，MacDonald等人使用人类肠道模型推测过剩的维生素C的摄取会降低维生素C转 运体(SVCTl)的表达、进而降低维生素C的摄入能力(非专利文献5)。从这些见解认为，维 生素C转运体产生促进剂对关于起因于维生素C保有量降低的维生素C的功能降低的予防 或改善来说是有效的方法。目前为止，关于提高SVCTl和SVCT2的表达的化合物或植物的报导极少。Fujita 等人报导了使用小鼠成骨细胞，地塞米松(dexamethazone)提高了 SVCT2的表达，使维生素 C的摄入量上升(非专利文献6)。但是，地塞米松由于显示荷尔蒙用作用，因而从副作用的 观点出发，在使用时受到很大制约。此外，尚未有关于使SVCTl的表达增强的化合物或植物
3的报导。非专利文献 1 =Molecular Membrane Biology, 2001, Vol. 18，87-95非专利文献2 =Nature, 1999，Vol. 399，70-75非专利文献3 =FEBS Letter, 1999，Vol. 460，480-484# # ^lJ ； K 4 =Archives of Biochemistry and Biophysics, 2003, Vol. 410, 112-120非专利文献5 British Journal of Nutrition, 2002, Vol. 87,97-100非专利文献6 British Journal of Nutrition, 2001, Vol. 86,145-149

发明内容
发明要解决的问题本发明的课题在于提供促进维生素C向目标组织摄入的维生素C转运体产生促进 剂。进而，另一课题为提供含这样的促进剂的美白用组合物或胶原合成促进用组合物。解决问题的方法本发明人等为了解决上述各个课题而进行了深入研究，结果发现了具有维生素C 转运体产生促进作用的化合物和植物等，作为维生素C吸收促进用组合物、美白用组合物、 胶原合成促进用组合物是极其有用的，从此观点出发直至完成了本发明。即，这里所提出的 解决方法为如下方案。(1)维生素C转运体产生促进剂，其特征在于，含有选自夏至草素、胆留醇苯甲酸 酯、ugaferine、lapiferine、乙酸香叶酯、橙花叔醇、二氢茉莉酮、香芹基乙酸(Carvacryl acetate)、愈创木奧、二氢松柏醇、甜菊甙、DL-α -菔烯、马鞭草苷、1-二十七烷醇、4-羟基 香豆素、胆酸、胆留醇油酸酯、白蜡树甙、佛手酚所组成的化合物组中的至少1种以上。(2)维生素C转运体产生促进剂，其包含含前述(1)所述的任一化合物的植物、动 物、矿物、微生物的粉碎物、其提取物、或提取物的水解物。(3)维生素C吸收促进用组合物，其将前述(1)或(2)所述的维生素C转运体产生 促进剂与维生素C或维生素C衍生物组合而成。(4)前述(3)所述的维生素C吸收促进用组合物，维生素C衍生物为2-0- α -D-吡
喃葡糖基-抗坏血酸。(5)美白用组合物，其包含前述(3)或(4)所述的维生素C吸收促进用组合物。(6)胶原合成促进用组合物，其包含前述(3)或(4)所述的维生素C吸收促进用组 合物。(7)维生素C转运体产生促进剂，其特征在于，含有选自日本厚朴木兰(Japanese big-leaf magnolia)、杏仁、甘茶、葡萄柚、麦冬、常春藤、肥皂草、鱼腥草、母菊、棕儿茶、金 缕梅、桑、米糠、问荆所组成的组中的至少1种以上的粉碎物、其提取物、或提取物的水解 物。(8)维生素C吸收促进用组合物，其将前述(7)所述的维生素C转运体产生促进剂 与维生素C或维生素C衍生物组合而成。(9)前述⑶所述的维生素C吸收促进用组合物，维生素C衍生物为2-0- α -D-吡
喃葡糖基-抗坏血酸。
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(10)美白用组合物，其特征在于，其包含前述⑶或(9)所述的维生素C吸收促进 用组合物。(11)胶原合成促进用组合物，其特征在于，包含前述⑶或(9)所述的维生素C吸 收促进用组合物。(12)美白用组合物，其特征在于，含有前述(3)、(4)、⑶或(9)所述的维生素C 吸收促进用组合物和葡萄糖苷酶剂。(13)前述(12)所述的美白用组合物，葡萄糖苷酶剂为选自紫锥花、酵母、双歧菌、 乳酸菌所组成的组中的至少1种以上的粉碎物、其提取物、或提取水解物。发明效果根据由本发明发现的包含特定的化合物和植物的维生素C转运体产生促进剂，在 使用了细胞的分析中，可确认显著促进了 SVCTl和/或SVCT2的mRNA的表达。本发明的维 生素C转运体产生促进剂可作为美白用组合物、胶原合成促进用组合物使用，作为其使用 形态，列举为经口用、皮肤外用、注射、化妆品、医药等。


图1为显示三维皮肤模型的黑素生成抑制试验的结果的图表。图2为显示炎症的抑制效果的图表。图3为显示色素沉积的改善效果的图表。图4为显示葡萄柚提取物的SVCT产生促进效果的图。图5为显示三维皮肤模型的显微镜照片的图。图6为显示三维皮肤模型的Fontana-Masson染色图像的图。图7为显示使用HPLC的抗坏血酸(0. 5mM)的分析图表的图。图8为显示使用HPLC的细胞内的抗坏血酸的分析图表的图。图9为显示小鼠黑色素瘤B16-F10细胞中的葡萄柚提取物的维生素C吸收促进效 果的测定结果的图。图10为显示源自人类大肠癌的Caco2细胞中的葡萄柚提取物的维生素C吸收促 进效果的测定结果的图。
具体实施例方式以下，详细说明本发明。作为本发明的维生素C转运体产生促进剂所含的化合物， 可使用夏至草素、胆留醇苯甲酸酯、ugaferine、Iapiferine、乙酸香叶酯、橙花叔醇、二氢茉 莉酮、香芹基乙酸、愈创木奧、二氢松柏醇、甜菊甙、DL-α -菔烯、马鞭草苷、1-二十七烷醇、 4_羟基香豆素、胆酸、胆留醇油酸酯、白蜡树甙、佛手酚等。这些化合物可单独使用1种，此 外，还可组合2种以上使用。此外，还可使用含有这些化合物的植物、动物、矿物、微生物的 粉碎物、其提取物、或提取水解物。作为含夏至草素(CAS 465-92-9)的植物，列举出紫苏科夏至草属的Marrubium acetabulosum> Marrubium adfine> Marrubium aellenii> Marrubium affine> Marrubium africanum> Marrubium album、Marrubium alternidens> Marrubium alyssoides>
S M ^ft (Marrubium alysson) > Marrubium angustifolium> Marrubium anisodon>
5Marrubium apulum、Marrubium aquaticum、Marrubium aschersoni、Marrubium astracanicum、Marrubium atlanticum、Marrubium ayardii、Marrubium ballota、 Marrubium ballotaeforme、Marrubium ballotoides、Marrubium bastetanum、 Marrubium bornmuelleri、Marrubium bourgaei、Marrubium brachyodon、Marrubium candidissimum、Marrubium catariaefolium、Marrubium cephalanthum、Marrubium cinerascens、Marrubium cinereum、Marrubium circinnatum、Marrubium civice、 Marrubium coerulescens、Marrubium condensatum、Marrubium cor datum、Marrubium crassidens、Marrubium creticum、Marrubium crispum、Marrumbium cuneatum、 Marrubium cylleneum、Marrubium depauperatum、Marrubium deserti、Marrubium duabense、Marrubium echinatum、Marrubium eriocephalum、Marrubium eriostachyum、 Marrubium faucidensΛMarrubium f1avumΛMarrubium f1exuosumΛMarrubium fontianum、 Marrubium friwaldskyanum、Marrubium gamodon、Marrubium germanicum、Marrubium glechomaefolium、Marrubium globosum、Marrubium goktschaicum、Marrubium guilliermondiiλ Marrubium hamatum、Marrubium hermonis、Marrubium heterocladum、 Marrubium heterodon、Marrubium hierapolitanum、Marrubium hirsutum、Marrubium hispanicum、Marrubium humbeftii、Marrubium humile、Marrubium hyperleucum、 Marrubium incanum、Marrubium incisum、Marrubium indicum、Marrubium kotschyi、 Marrubium kurdicum、Marrubium kusnezowii、Marrubium lamioides、Marrubium lanatum、 Marrubium laricum、Marrubium laurifolium、Marrubium leonuroides、Marrubium libanoticum、Marrubium litardierei、Marrubium lutescens、Marrubium macrodon、 Marrubium ma1cο1mianumΛ Marrubium marrubiastrumΛ Marrubium micranthum、Marrubium microphyllum、Marrubium mollissimum、Marrubium montenegrinum、Marrubium multibracteatum、Marrubium nanum、Marrubium nigrum、Marrubium noeanum、Marrubium odoratissimum、Marrubium orientale、Marrubium pallidum、Marrubium paniculatum、 Marrubium pannonicum、Marrubium parnassicum、Marrubium parviflorum、Marrubium pauciflorum、Marrubium peregrinum、Marrubium persicum、Marrubium pestalozzae、 Marrubium plicatum、Marrubium ρIumosumΛ Marrubium polyodon、Marrubium praecox、 Marrubium procerum、Marrubium propinquum、Marrubium pseudo—alyssum、Marrubium pseudo —dictamnus、Marrubium purpureum、Marrubium radiatum、Marrubium remotum、 Marrubium rotundifolium、Marrubium rubrum、Marrubium rugosum、Marrubium scrophu lariaefol ium λ Marrubium segobricense、Marrubium sericeum、Marrubium setaceum、Marrubium sewerzowi、Marrubium suffuticosum、Marrubium supinum、 Marrubium thessalum、Marrubium thouini、Marrubium trachyticum、Marrubium turkeviczii、Marrubium uncinatum、Marrubium undulalum、Marrubium vaillantii、 Marrubium vanense、Marrubium velutinum、Marrubium virescens、Marrubium vulcanicum、苦薄另 U 名欧 至胃(Marrmbium vulgare)、Marrubium werner Marrubium wilkommi、紫苏科益母草属的欧益母草(Leonurus cardiaca)、紫苏科狮子耳属 的狮耳花(Leonotis leonurus)等。 作为含胆留醇苯甲酸酯(CAS 604-32-0)的动物，列举海龙科的海龙(Syngnathusacus)等。作为含ugaferine (CAS :63026-58_4)的植物，列举伞形科茴香属的Ferula arrigonii、阿魏草(Ferula assafoetida)、茴香(Ferula communis)、Ferula involucrata、Ferula kuhistanica、Ferula lapidosa、Ferula Iatipinna、Ferula leucographa、林克阿魏(Ferula linkii)、Ferula sinaica、准葛尔阿魏(Ferula soongarcia)、Ferula tenuiesta、Ferula ugamica 等。作为含lapiferine (CAS :86992-41_8)的植物，列举伞形科茴香属的 Ferula arrigonii、阿魏草(Ferula assafoetida)、茴香(Ferula communis)、Ferula involucrata、Ferula kuhistanica、Ferula lapidosa、Ferula latipinna、Ferula leucographa、林克阿魏(Ferula linkii)、Ferula sinaica、准葛尔阿魏(Ferula soongarcia)、Ferula tenuiesta、Ferula ugamica 等。作为含乙酸香叶酯(CAS: 105-87-3)的植物，列举松科冷杉属的马氏冷杉 (Abies mariesii)、菊科藿香蓟属的熊耳草(Ageratum houstonianum)、菊科仓术属的苍 术(Atractylodes lancea)、菊禾斗酒神菊属的酒神菊树(Baccharis dracunculifolia) > Baccharis latifolia> Baccharis(Bellis perennis) > 菊科金盏花属的金盏菊(Calendula officinalis)、伞形科葛缕子属的葛缕子(Carum carvi)、蕨藻科蕨藻属的总状蕨藻(Caulerpa racemosa)、茄科夜香树属的夜香树(Cestrum nocturnum)、伞形科明党参属的明党参(Changium smyrnioides)、柑橘科柑橘属的来 W. (Citrus aurantifolia) > ■ (Citrus aurantium) > 弗·^ ttt (Citrus bergamia) > JC J=L (Citrus grandis) > A 5 (Citrus hassaku)、伊予 ttt (Citrus iyo) > (Citrus junos)、纪州tt橘(Citrus kinokuni) (Citrus limon)、香才缘(Citrus medica)、夏 (Citrus natsudaidai) > ^f (Citrus paradise) ^ -ψ· il (Citrus reticulate) > (Citrus sinensis)、臭 (Citrus sphaerocarpa) > Stffi (Citrus sudachi) > HiSttt (Citrus sulcata) ^iEffi (Citrus tachibana) >iUj'HttfIil (Citrus unshiu)、7jC丰公禾斗水 松属的软毛松藻(Codium tomentosum)、伞形科孜然芹属的孜然芹(Cuminum cyminum)、 禾本禾斗香茅属的青香茅(Cymbopogon caesius)、梓檬草(Cymbopogon citratus)、卡西 香茅(Cymbopogon khasianus)、枫茅(Cymbopogon winterianus)、伞形禾斗古月萝卜属的 Daucus carota、紫苏科青兰属的Dracoc^phalum kotschyi、桃金娘科桉树属的尾叶桉 (Eucalyptus urophylla)、菊科蜡菊属的蜡菊(Helichrysum bracteatum)、鱼腥草科鱼腥 草属的鱼腥草(Houttuynia cordata)、八角科八角属的藏八角(Illicium griffithii)、 MMA^ (Illicium merri 11 ianum) > ft^lJttM W^lJtt (Juniperus formosana) > Ihfev (Juniperus rigida)、桃金娘科澳洲茶树属的I^ptospermum javanicum、伞形科藁本属的 Ligusticum mutellina、马鞭草科过江藤属的辛巴威(Lippia javanica)、紫苏科夏至草属 的欧夏至草(Marrubium vulgare)、紫苏科牛至属的圆叶牛至(Origanum rotundifolium)、 牛儿苗科天竺葵属的香叶天竺葵(Pelargonium graveolens)、楠科台湾桢楠属的巴西楠木 (Phoebe porosa)、杜鹃花科杜鹃花属的樱草杜鹃(Rhododendron primulaef lorum)、蔷薇 科蔷薇属的百叶蔷薇(Rosa centifolia)、紫苏科鼠尾草属的Salvia clevelandii,Salvia fructicosa、凤梨鼠尾草(Salvia officinalis)、香紫苏(Salvia sclarea)、菊禾斗万寿菊 属的孔雀草(Tagetes erecta)、使君子科榄仁属的Te rminalia bentzoe、柏科崖柏属的卓月§羊崖丰白(Thuja koraiensis)、紫苏禾斗百Jl香属白勺 Thymus sipyleus> Thymus thracicus、 百里香(Thymus vulgaris)、麝香草(Thymus zygis)、芸香科花椒属的凤椒(Zanthoxylum bungeanum)、翼柄花椒(Zanthoxylum schinifolium)等。 作为含橙花叔醇(CAS 7212-44-4)的植物，列举菊科菊科蓍属的高山蓍 (Achillea alpine)、黄花蓍草(Achillea filipendulina)、Achillea ligustica、千叶蓍 草(Achillea milleifolium)、Achillea moschata、珠蓍(Achillea ptarmica)、毛叶耆 草(Achillea tomentosa)、菊科藿香蓟属的藿香蓟(Ageratum conyzoides)、紫花藿香蓟 (Ageratum houstonianum)、姜禾斗豆蔻属的香豆蔻(Amomum aromaticum)、白豆蔻(Amomum cardamomum)、香豆蔻(Amomum subulatum)、缩砂(Amomum xanthioides)、姜(Amomum zingiber)、豆科紫穗槐属的紫穗槐(Amorpha fruticosa)、山荼科山荼属的荼(Camellia sinensis)、豆禾斗刀豆属的白凤豆(Canavalia ensiformis)、刀豆(Canavalia gladiata)、 海刀豆(Canavalia maritima)、前禾斗夜香树属的黄瓶子花(Cestrum aurantiacum)、夜 来香(Cestrum nocturnum)、芬芳紫花夜丁香(Cestrumpurpureum)、柑橘科柑橘属的来 ■ (Citrus aurantifolia) λΜ (Citrus aurantium) λ j^^ffl" (Citrus bergamia) (Citrus grarndis)、乂V朔(Citrus hassaku)、伊予相(Citrus iyo)、丰由(Citrus junos)、 乳橘(Citrus kinokuni)、梓樣(Citrus limon)、香稼(Citrus medica)、夏禮(Citrus natsudaidai)、葡萄 |由(Citrus paradise)、早红(Citrus reticulate)、舌甘 (Citrus sinensis) Λ Mt (Citrus sphaerocarpa) Λ 酸 t面(Citrus sudachi)、三宝 ttf (Citrus sulcata)、立花橘(Citrus tachibma)、温州柑橘(Citrus unshiu)、大戟科巴豆属的 Croton aubrevillei、H 度苦香 对(Croton eluteria)、赤芽Hf (Croton japonicum)、 南京黄才卢(Croton sebiferus)、巴豆(Croton tiglium)、Croton zambesicus、伞形禾斗人 参属的人参(Daucus carota)、木棉科榴莲属的榴莲(Durio zibethinus)、紫苏科香薷属 的香薷(Elsholtzia ciliata)、野把子(Elsholtzia rugulosa)、无患子科龙眼属的龙 眼(Euphoria longm)、银杏科银杏属的银杏(Ginkgo biloba)、桕科剌桕属的西洋杜松 (Juniperus communis)、海滨桧(Juniperus conferta)、朿Ij丰公(Juniperus formosana)、杜 松(Juniperus rigida)、伞形科藁本属的Ligusticum mutellina、马鞭草科过江藤属的白 朿丨J 枝(Lippia alba)、梓檬过江藤(Lippia citriodora)、辛巴威(Lippia javanica)、过江 B (Lippia nodiflora) ^Lippia maltuflora^^^f^^M(Mentha aquatica) Λ 薄荷(Mentha arvensis)、滇产薄荷(Mentha canadensis)、欧薄荷(Mentha longifolia)、 古月(Mentha piperita) ,MWM^ (Mentha pulegium)、(Mentha spicata) Λ 紫苏科姜味草属的Micromeria carminea、山榄科子弹木属的香榄(Mimusops elengi)、紫 苏禾斗罗勒属的罗勒(Ocimum basilicum)、Ocimum kilimandoscharicum、小冠薰(Ocimum tenuiflorum)、伞形科水芹属的水芹(Oenanthe jaranica)、山羊百科山羊百属(Pandanus boninensis) λΜ^Μ (Pandanus tectorius)、古月椒禾斗古月椒属白勺丰对古月椒(Piper aduncum)、 蒌叶(Piper betle)、风藤(Piper kadsura)、假药(Piper longum)、卡瓦胡椒(Piper methysticum)、古月椒(Piper nigrum)、假荜拔(Piper retrofractum)、马齿觅禾斗马齿觅属 的半支莲(Portulaca grmdifIora)、马齿苋(Portulaca oleracea)、紫苏科鼠尾草属的 Salvia clevelandii、胃胃胃(Salvia cryptantha)、Salvia fructicosa、M_g·胃 (Salvia officinalis)、香紫苏(Salvia sclarea)、以及作为精油的原料的植物等。
8
作为含二氢茉莉酮(CAS 1128-08-01)的植物，列举柑橘科柑橘属的来檬(Citrus aurantifolia) > ■ (Citrus aurantium) > 弗·^ ttt (Citrus bergamia) > JC J=L (Cirus grandis)、八朔(Citrus hassaku)、伊予相(Citrus iyo)、袖(Citrus junos)、乳橘(Citrus kinokuni) > τ (Citrus limon)、香|缘(Citrus medica) >S (Citrus natsudaidai) > 葡萄 t由(Citrus paradise)、早红(Citrus reticulate) > Stf (Citrus sinensis)、臭 (Citrus sphaerocarpa) > (Citrus sudachi) > HiSttt (Citrus sulcata) > AL^M (Citrus tachibana)、温州柑橘(Citrus unshiu)、夹竹桃科假虎刺属的假虎刺(Carissa carandas)、卡利撒(Carissa grandiflora)、以及、作为精油的原料的植物等。作为含香芹基乙酸(CAS :6380-28_5)的植物，列举伞形科孜然芹属的孜然芹 (Cuminum cyminum)、马鞭草科过江藤属的柠檬过江藤(Lippia citriodora)、辛巴威 (Lippia javanica) > Γ ^ (Lippia nodiflora) > Lippia maltuf lora> M ^h ^iP M 香草属白勺 Thymus decassatus> Thymus sipyleus、Thymus thracicus、百 Jl 香(Thymus vulgaris)、麝香草(Thymus zygis)、败酱科缬草属的北缬草(Valeriana fauriei)、嫩茎缬 草(Valeriana flaccidissima)、缴草(Valeriana officinalis)等。 作为含愈创木奧(CAS 489-84-9)的植物，列举菊科蒿属的洋艾(Artemisia absinthium)、青蒿(Artemisia apiacea)、茵陈蒿(Artemisia capillaris)、龙蒿 (Artemisia dracunculus)、Artemisia maritime、艾草(Artemisia princeps)、柏禾斗丝柏 MWiJlttt (Callitris calcarata)(Callitris cupressiformis)、阴| (Cinnamomum
burmarmi)、t章(Cinnamomum camphora)、肉t圭(Cinnamomum cassia)(Cinnamomum
japonica)、黄t章(Cinnamomum parthenoxylon)、肉|圭(Cinnamomum seiboldii)、f易兰肉|圭 (Cinnamomum verum)、桃金娘科丁香属的Eugenia banderensis、栊牛儿苗科老鹳草属的椰 香天竺葵(Geranium macrorrhizum)、尼泊尔老鹳草(Geranium nepalense)、隶松节藻科凹 顶藻属的Laurencia obtuse、菊科洋甘菊属的母菊(Matricaria chamomilla)、锦葵科木槿 属的香孔雀花(Pavonia odorata)等。作为含二氢松柏醇(CAS 2305-13-7)的植物，列举松科松属的赤松(Pinus densiflora)、红松(Pinus koraiensis)、偃松(Pinus pumila)、欧洲赤松(Pinus sylvestris)、松科金钱松属的金钱松(Pseudolarix amabilis)等。作为含甜菊甙(CAS 57817-89-7)的植物，列举菊科斯台比亚属的甜菊(Stevia rebaudiana)等。作为含DL- α -菔烯(CAS 2437-95-8)的植物，列举桃金娘科桉属杏仁桉 (Eucalyptus amygdalina)(Eucalyptus cinera)(Eucalyptus globulus)、白 藓叶桉(Eucalyptus leucoxylon) ,Eucalyptus regnans、以及、作为精油的原料的植物等。马鞭草苷(CAS 548-37-8)是别名称为Cornin的化合物。作为含马鞭草苷的 植物，列举山茱萸科山茱萸属的头状四照花(Cornus capitata)、加拿大红瑞木(Cornus canadensis) > lll^lC (Cornus controversa) > JFitlll^IC (Cornus florida)、东■四照# (Cornus kousa)、株木(Cornus macrophylla)、西洋山莱 IC (Cornus mas)、山 IC 肉(Cornus ofTicinalis)、|#=禾勺.中才卯M白勺f勺.中才卯(Pentstemon frutescens)、f勺.中才卯(Pentstemon gloxinioides)、Pentstemon nitidus、马鞭草科马鞭草属的美女樱(Verbena hybrida)、 马鞭草(Verbena officinalis) > Verbena peruviana、糖叶美女樱(Verbena rigida)、
9Verbena stricta、细叶美女樱(Verbena tenera)等。作为含1-二十七烷醇(CAS 2004-39-9)的植物，列举山羊百科山羊百属的龙舌 ^ (Agave americana)(Agave cantala)(Agave filifera) ^1Jfli (Agave fourcroydes)、雷神(Agave potatorum)、琼麻(Agave sisalana)、笹之雪(Agave victoriae—reginae)、瓜禾斗西瓜属白勺药西瓜(Citrullus colocynthis)、西瓜(Citrullus lanatus)、豆科山蚂蝗属的大叶拿身(Desmodium laxiflorum)、羽叶山马幢(Desmodium οldhamii)、Desmodium paniculatum、Desmodium padocarpum、桑禾斗无花果属的木瓜格 (Ficus auriculata)、爱玉子(Ficus awkeotsang)、印度格树(Ficus bengalensis)、垂 叶格(Ficus benjamina)、无花果(Ficus carica)、三角格(Ficus diversifolia)、印度 橡胶树(Ficus elastoca)、矮小天仙果(Ficus erecta)、琴叶橡皮树(Ficus lyrata)、 格树(Ficus microcarpa)、Ficus oxyphylla、薜荡(Ficus pumila)、菩提树(Ficus religiosa)、雀格(Ficus superba)、西克莫无花果(Ficus sycomorus)、菊禾斗豨莶属的毛梗 稀苍(Siegesbeckia glabrescens)、稀苍(Siegesbeckia orientalis)等。作为含4-羟基香豆素(CAS 1076-38-6)的微生物，列举青霉属的卡门柏青霉 (Penicillium camembertii)、青霉菌(Penicillium jensenii)、点青霉(Penicillium notatum)、奶酪真菌(Penicillium roquefortii)等。作为含4_羟基香豆素的植物，列 举牛栓藤科栗豆藤属的 Agelaea nitida、Agelea obligua、Agelea trifolia、牛栓藤科 Byrsocarpus 属白勺 Byrsocarpus coccineus、牛检藤禾斗蠻毛果属白勺 Cnestis corniculatus、 Cnestis ferruginea、序禾斗茴香属的 Ferula arrigonii、阿魏草(Ferula assafoetida)、 茴香(Ferula communis)、Ferula involucrata、Ferula kuhistanica、多石阿魏(Ferula lapidosa)、Ferula latipinna、Ferula leucographa、林克阿魏(Ferula linkii)、Ferula sinaica、准葛尔阿魏(Ferula soongarcia)、Ferula tenuiesta、Ferula ugamica、芸香禾斗 芸香属的叙利亚芸香(Ruta chal印ensis)、芸香(Ruta graveolens)等。胆酸(CAS 81-25-4)被含于多数的哺乳类的胆汁中。作为含胆甾醇油酸酯(CAS 303-43-5)的微生物，列举安德森皮剌蜱 (Dermacentor andersoni)等0作为含白蜡树甙(CAS :524-30-1)的植物，列举槭树科槭树属的Acer aidzuense. 大红叶械(Acer amoenum)、锐齿械(Acer argutum)、台湾三角枫(Acer buergerianum)、 台湾三角枫(Acer campestre)、枥叶枫(Acer carpinifolium)、维奇山楂叶槭(Acer crataegifolium)、鬼械(Acer diabolicum)、二 柱械(Acer distylum)、荼条械(Acer girmala)、日本贝占梗海棠(Acer j aponica)、械木(Acer mono)、|$口十牛风(Acer negundo)、 漂枫(Acer nigrum)、毛果槭(Acer nikoense)、日本槭(Acer nipponicum)、鸡爪槭 (Acer palmatum)、挪威枫(Acer platanoides)、岩枫(Acer pseudoplatanus)、密花械 (Acer pycnanthum)、褐脉械(Acer ruf inerve)、糖械(Acer saccharum)、小叶施械(Acer sieboldianum)、小偕槭(Acer tschonoskii)、花偕槭(Acer ukurunduense)、七叶树禾斗 七叶树属的七叶树(Aesculus chinensis)、欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)、 ^OfW (Aesculus turbinate)S ^hWM W^H Sli (Fraxinus americana) Λ 白錯(Fraxinus chinensis)、金叶欧洲栲树(Fraxinus excelsior)、白鸡油(Fraxinus griffithii)、大叶錯树(Fraxinus hynchophylla)、日本白錯木(Fraxinus japonica)、
10Fraxinus lanuginose、水曲柳(Fraxinus mandshurica)、花白腊木(Fraxinus ornus)、 Fraxinus oxyphylla、臼本本州白錯木(Fraxinus spaethiana)、Fraxinus sieboldiana、 杜鹃花科越橘属的狭叶越桔(Vaccinium angustifolium)、野生兔眼越橘(Vaccinium ashei)、Vaccinium australe、乌饭树(Vaccinium bracteatum)、红果越桔(Vaccinium hirtum)、扁枝越桔(Vaccinium japonicum)、大果越桔(Vaccinium macrocarpon)、欧洲 越桔(Vaccinium myrtillus)、腺齿越桔(Vaccinium oldhami)、红莓苔子(Vaccinium oxycoccus)、樱桃越橘(Vaccinium praestans)、Vaccinium smallii、笃斯越橘(Vaccinium uliginosumu)、越桔(Vaccinium vitis-idaea)、忍冬禾斗锦带属的锦带花(Weigela florida)等。作为含佛手酚(CAS :486-60-2)的植物，列举柑橘科柑橘属的来檬(Citrus aurantifolia)、■ (Citrus aurantium)、f弗·^ ffl" (Citrus bergamia)Λ JC K (Citrus grandis)、八朔(Citrus hassaku)、伊予相(Citrus iyo)、袖(Citrus junos)、乳橘(Citrus kinokuni)、梓樣(Citrus limon)、香稼(Citrus medica)、夏禮(Citrus natsudaidai)、 葡萄柚(Citrus paradise)、早红(Citrus reticulate)、舌甘禮(Citrus sinensis)、臭 (Citrus sphaerocarpa) ΛMIS (Citrus sudachi) λ^^^ (Citrus sulcata) Λ^^ζ (Citrus tachibma)、温州柑橘(Citrus unshiu)、桑科臭桑属的厚叶盘花木(Dorstenia contrajerva)、Dorstenia elliptica、桑禾斗无花果属的木瓜格(Ficus auriculata)、爱玉 子(Ficus awkeotsang)、印度格树(Ficus bengalensis)、垂叶格(Ficus benjamina)、无 花果(Ficus carica)、三角格(Ficus diversifolia)、印度橡胶树(Ficus elastoca)、矮 小天仙果(Ficus erecta)、琴叶橡皮树(Ficus lyrata)、格树(Ficus microcarpa)、Ficus oxyphylla、薜蒸(Ficus pumila)、菩提树(Ficus religiosa)、雀格(Ficus superba)、西克 莫无花果(Ficus sycomorus)、伞形科宪活属的宽叶宪活(notopterygium franchetii)、植 物宪活(notopterygium incisium)、宪活(notopterygium rhizomes)等。本发明的维生素C转运体产生促进剂可使用日本厚朴木兰、杏仁、甘茶、葡萄柚、 麦冬、常春藤、肥皂草、鱼腥草、母菊、棕儿茶、金缕梅、桑、米糠、问荆等。这些可单独使用1 种，此外，还可组合2种以上使用。此外，这些植物可使用其粉碎物、其提取物、或提取水解 物的任一种。日本厚朴木兰(Magnolia obovata)是指如下植物木兰科木兰属的落叶乔木，分 布于从北海道到九州和中国，生长于山地，被栽种成庭园树、公园树建筑材等。也指学名为 Magnolia hypoleuca.药用部位的树皮中含有生物碱的厚朴碱、木兰花碱、木酚素类的厚朴 酚、厚朴酚等，用于腹痛、腹泻、呕吐等症状缓和。扁桃(Primus dulcis)是指如下的植物蔷薇科李属的落叶乔木，生长在夏季 雨少的地域且适于温暖的水土，现在，地中海沿岸各国和美国加州为主产地。也指学名为 Prunus amygdalus、Prunus communis、_Amygdalus dulcis、_Amygdalus communisΛAmygdalus Sativus0压榨种子得到的油用于乳化剂、按摩油、香料、利口酒的制造、制造糕点等。甜杏 仁由于不含作为生氰糖苷的苦杏仁甙，因而可以生食，以黄油、盐等调味来作为坚果使用。甘茶(Hydrangea macrophylla)是指如下的植物虎耳草科绣球属的落叶灌木， 作为庭木或药用而栽培。植物体中有甜味，作为替代砂糖用途使用。甜味成分已知为叶甜 素、异叶甜素，干燥叶被作为甘茶饮用。
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葡萄柚(Citrus paradise)是指柑橘科柑橘属的植物，为在温暖的地方栽培的 常绿乔木。果肉柔软、多汁，含1 2%柠檬酸、酸味稍强、因柠檬苦素而有苦味，大小与夏橙 相当。肉色因品种而异，为黄色至红色。红色由番茄红素产生。用于生食或果汁等，但大部 分被加工成冷冻浓缩果汁。麦冬(Ophiopogonjponicus)是指如下植物瓶尔小草科(Ophiogrossaceae)瓶 尔小草属(Ophiogrossum)的羊齿植物，分布于从北海道至九州和中国、朝鲜半岛。别名也 被称为龙须，根的膨大部被称为麦门冬，麦门冬被用于滋养强壮、镇咳、祛痰等。常春藤(Hedera helix)是指如下的植物为五加科常春藤属，广泛分布于欧洲、 北非的蔓生植物。别名也被称为洋常春藤(English ivy)等。叶被用于治疗结石症、黄症寸。肥皂草(Saponiria officinalis)是指为石竹科肥皂草属的植物，原产自欧洲 的多年草。别名也被称为common Soapwort。此外,学名也表示为Silence saponalia。作 为药用，使用叶和根茎结合使用于湿疹等皮肤病。在欧洲自古以来代替肥皂来使用。鱼腥草(Houttuynia cordata)是指鱼腥草科鱼腥草属的植物，分布于本州、四 国、九州、冲绳、以及台湾、中国、喜马拉雅、爪哇等的多年草。鱼腥草的地上部的干燥物作为 解热、解毒、利尿、湿疹、消炎药使用。已知，特有的臭气来自于月桂醛或癸醛等醛类。在亚 洲被用于药用，但在欧美还作为观赏用而栽培。母菊(Matricaria chamomilla)是指原产自欧洲的菊科洋甘菊属的1年草生植 物。别名也称为日耳曼母菊、德国母菊、春黄菊。以药用为目的而在以欧洲各地为首的温暖 地带栽培，药用部位的头状花序被用于发汗、驱虫的目的，此外从母菊提取的精油被用于利 口酒、香烟的赋香剂、香水、洗发精。棕儿茶(uncaria gambir)为茜草科钩藤属的植物，分布于马来半岛、苏门答腊、文 莱等，为在东南亚洲各地栽培的蔓性常绿低木。作为药用部位使用叶和小枝，以缓和便血、 尿血、血痢为目的使用。此外，还作为口内清凉剂的原料使用。作为同样的目的，还使用儿 茶(Acacia catechu)的心材。美国金缕梅(Hamamelis virginiana)是指原产自北美东部至南部的金缕梅科 金缕梅属的植物。叶具有作为药用茶被印第安人使用的历史，用于泻药、痔疮。已知叶和树 皮中含金缕梅丹宁。桑(Morus alba)是指东亚原产的桑科桑属的植物，还被称别名为唐桑、白桑、白实 桑。中医中将幼枝称为柔枝、叶称为柔叶、果实称为柔椹子、根的皮称为柔白皮。柔枝用于 风湿病和神经痛等，柔叶用于解热，柔椹子用于滋养强壮、贫血、养毛，柔白皮用于消炎性利 尿、镇咳、高血压。米糠(Oryza sativa)是指禾本科禾本属的植物，作为日本的主食的米的糠。问荆(Equisetum arvense)是木贼科木贼属的羊齿植物，营养茎被称为问荆，胞子 茎被称为问荆草。问荆和问荆草从同一地下茎而生出，早春首先问荆草伸出，然后问荆展 开。问荆作为药用而被服用于利尿、止血、镇咳、解热，此外，作为外用而用于皮肤疾病、漆疮寸。包含由上述列举的本发明发现的化合物的植物和本发明的植物可使用叶、茎、芽、 花、木质部、木皮部(树皮)等地上部，以及根、块茎等地下部、种子、树脂等所有部位。此外，包含由上述列举的本发明发现的化合物的微生物可使用例如液体培养物、固体培养物， 在菌类的情形中可用于菌系体、子实体等任一种。上述列举的包含由本发明发现的化合物的植物、矿物、微生物、动物，可作为原体、 原体的水解物、提取物、提取物的水解物使用。此外，这些化合物即便为化学合成的物质也
可使用。作为用于从植物、矿物、微生物、动物得到本发明的化合物的提取方法，例如在葡 萄柚的情况下，列举如下方法用适当的溶剂提取将葡萄柚干燥的干燥物、其粉碎物、压榨 葡萄柚得到的榨汁等，根据情况而实施水解处理，通过过滤等去除不溶部分，在从该液体除 去溶剂之后，使用柱层析法等通常的提纯方案得到目标化合物的方法。作为用于提取的溶剂，列举甲醇、乙醇、丙醇、1，3_ 丁二醇等醇类，醚、丙酮、醋酸乙 酯、己烷、环己烷、二氯甲烷、氯仿等有机溶剂、水等。这些溶剂可单独使用、还可混合2种以 上使用。提取条件没有特别限制，例如温度为5 95°C，优选为15 85°C，在常温下也可 适当提取。压力可以为常压、加压、减压的任一种。提取时间因选定的溶剂而不同，为数分 钟 数小时，可通过反复提取、振荡提取、提取时间的延长等提高提取效率。此外，进行水解 时，列举酯酶这样的酶进行的分解、乳酸菌和酵母等微生物进行的分解、盐酸、硫酸、醋酸、 磷酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、富马酸、苹果酸等酸进行的分解、氢氧化钠、氢氧化钾等碱进行 的分解等。水解的条件没有特别限制，在使用酶或微生物时，根据所使用的酶或微生物的最 适温度、最适PH，通常在10 55°C、pH3 8，进行5 24小时左右水解。使用酸或碱进行 水解时，通常在2 15重量％的浓度下在常温 60°C进行0. 5 24小时左右水解。这些提取物或提取物的水解物在根据需要调整pH之后，可通过冷冻干燥、减压蒸 馏、减压 真空干燥、喷雾干燥等公知的方法得到浓缩干燥物。提纯处理的方法没有特别限 制，例如可将通过正相和反相柱层析法进行的提纯、重结晶、再沉淀、脱色处理、脱臭处理等 组合来提纯。通过上述方法提取的含葡萄柚的提取物、本发明所列举的植物的提取物和本发明 所列举的化合物，在使用细胞的分析中，可确认显著促进了维生素C转运体的表达。由此可 知，本发明的维生素C转运体产生促进剂作为维生素C吸收用组合物、美白用组合物、以及 胶原产生用组合物是有用的。本发明中的“维生素C转运体产生促进剂”提高了钠依赖性维生素C转运体1型 (SVCTl)或2型(SVCT2)的任一者或两者的表达，换句话说，提高了作为SLC23A1或SLC23A2 基因的任一者或两者所表达的的产物的表达。本发明中的“维生素C吸收促进用组合物”是指维生素C转运体产生促进剂与维 生素C或其衍生物的至少1种以上组合的物质，通过经口或涂布而摄取的维生素C、或其衍 生物在目标脏器中的维生素C浓度高的组合物。作为本发明中的“维生素C衍生物”，除了 2-0- α -D-吡喃葡糖基-抗坏血酸以外， 还可列举L-抗坏血酸单硬脂酸酯、L-抗坏血酸单棕榈酸酯、L-抗坏血酸单油酸酯等抗坏血 酸单烷基酯类；L-抗坏血酸单磷酸酯、L-抗坏血酸-2-硫酸等抗坏血酸单酯衍生物；L-抗 坏血酸二硬脂酸酯、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸二油酸酯等抗坏血酸二烷基酯 类；L-抗坏血酸二磷酸酯等抗坏血酸二酯衍生物、L-抗坏血酸三硬脂酸酯、L-抗坏血酸三 棕榈酸酯、L-抗坏血酸三油酸酯等抗坏血酸三烷基酯类；L-抗坏血酸三磷酸酯等抗坏血酸
13三酯衍生物等，但并不限于这些。作为盐，可列举抗坏血酸与各种盐基的盐。例如碱金属盐 (例如钠盐等)、碱土类金属盐(例如钙盐、镁盐等)等，但并不限于这些。本发明中的“美白用组合物”是指对原有的色素斑、雀斑显示淡化作用的组合 物。色素斑、雀斑是由于黑素生成过量并沉积而发生的结果，维生素C为与黑素生成有很 大关系的酪氨酸酶的阻碍物质，还已知其增进从氧化型浓色黑素变成还原型淡色黑素的作 用。临床上报导了改善现有的色素斑、雀斑等的色素沉积(非专利文献7:臨皮1967. Vol 21 (7). 725-729)。本发明的美白用组合物是指通过提高皮肤细胞中的维生素C浓度而增强 维生素C的美白作用的组合物。本发明的美白用组合物只要包含本发明的维生素C吸收促 进用组合物即可，进而，只要不阻碍维生素C吸收促进作用则还可另行添加添加物来调整。本发明中的“胶原产生用组合物”是指通过提高维生素C浓度而增强维生素C具 有的胶原产生促进作用的组合物。例如，胶原产生细胞为皮肤细胞时，指的是提高肌肤润泽 的组合物，胶原产生细胞为骨母细胞时，指的是增强骨强度的组合物。本发明的胶原产生用 组合物包含本发明的维生素C吸收促进用组合物即可，进而，只要不阻碍胶原产生促进作 用则还可以另行添加添加物来调整。本发明中的“葡萄糖苷酶剂”是指其自身具有葡萄糖苷酶活性的物质、或使葡萄 糖苷酶活性活化的物质。作为其自身具有葡萄糖苷酶活性的物质，列举例如酵母、双歧菌、 乳酸菌，进而，还可以使用源自链球菌属、曲霉菌属、链霉菌属、根霉属、梭杆菌属、链霉菌属 等的微生物的葡萄糖苷酶，这些并没有限制。此外，作为使葡萄糖苷酶活性活化的物质，可
(Echinacea purpurea、Echinacea 已ngustifolia、Echinacea palIiEchinacea simul&t&、Echin&ce已 ρΒΓΒ οχΒΛEchinacea atrorubens)等(I禾lit 献ι 日本特开2005-029546号公报)，但并不限于此。本发明的葡萄糖苷酶剂可将上述原 材料直接粉碎使用，此外，可以使用上述原材料的提取物、提取水解物。本发明的剂或者组合物可作为食品、医药品、化妆品等使用。作为食品，除了通常 的食品以外，还可作为营养辅助食品、功能性食品、健康食品、特定保健用食品等使用，还可 配合到例如果汁这样的饮料中。医药品中，关于给药，在将有效成分经口给药、非经口摄取时，可与适于直肠内给 药、注射等给药方法的固体或液体的医药用无毒性载体混合，以惯用的医药制剂的形态给 药。作为形态，列举例如粉末、散剂、颗粒、片剂、胶囊等固形剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂等的液 剂、冷冻干燥制剂等，这些制剂可通过常规方案来调制。作为上述的医药品用无毒性载体， 列举例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙烯淀粉、乙 二醇、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、氨基酸、明胶、清蛋白、水、生理食盐水等。还可根据需要 适当添加稳定化剂、湿润剂、乳化剂、结合剂、张度剂等添加剂。本发明的剂或者组合物中，被选定的化合物的有效给药量根据对象者的年龄、体 重、症状、给药路径、给药日程、制剂形态等来适当选择决定，例如经口用的情况下，甜菊甙 的给药量优选为每1日1 5000mg，特别优选为10 lOOOmg。此外，维生素C优选为每1 日10 2000mg，特别优选为100 lOOOmg。可将其按1日分数次给药。本发明的剂或者组合物中，被选定的植物、动物、矿物、微生物的粉碎物、干燥物、 提取物、提取水解物的有效给药量根据对象者的年龄、体宜、症状、给药路径、给药日程、制 剂形态、原材料的活性强度等来适当选择决定，例如在经口用时，鱼腥草提取物的给药量优
14选为每1日1 50000mg，特别优选为10 lOOOmg。此外，维生素C优选为每1日10 2000mg，特别优选为100 lOOOmg。可将其按1日分数次给药。此外，本发明的剂或者组合物作为皮肤外用可制成药事法中所谓的化妆品、医药 部外品、医药品中等所含产品。用于乳液、乳油、洗剂这样的护肤产品、软膏等。虽然并没有 特别限定，但该剂型可得到水溶液系、增溶系、乳化系、粉末系、油液系、凝胶系、软膏系、溶 胶系、水-油2层系、水-油-粉末3层系等广泛的剂型。本发明的剂或者组合物中，被选定的化合物的皮肤外用中的含量根据症状的不同 而适当选择，例如为夏至草素时，为总重量的0. 001 10重量％左右、优选为0. 01 2重 量％。此外，维生素C衍生物使用2-0- α -D-卩比喃葡糖基-抗坏血酸时，为总重量的0. 001 50重量％左右、优选为0. 1 10重量％。将其按1 4次/日涂布当然也无妨。本发明的剂或者组合物中，被选定的植物的皮肤外用中含量根据症状的不同而适 当选择，例如为葡萄柚提取物时，为总重量的0. 001 50重量％左右、优选为0. 01 10重 量％。此外，维生素C衍生物使用2-0- α -D-吡喃葡糖基-抗坏血酸时，为总重量的0. 001 50重量％左右、优选为0.1 10重量％。将其按1 4次/日涂布当然也无妨。以下列举实施例具体说明，但并不限于此。实施例1(植物的提取)在曰本厚朴木兰(Magnolia obovata)、杏仁(Prunus dulcis)、甘茶(Hydrangea macrophylla)> 葡萄 t由(Citrus paradise)> 麦冬(Ophiopogon jponicus)、常 藤 (Hedera helix)、月巴阜草(Saponiria officinalis)、鱼月星草(Houttuynia cordata)、母菊 (Matricaria chamomilla)、掠儿茶(uncalia gambir)、金缕梅(Hamamelis virginiana)、 桑(Morus alba)、米糖(Oryza sativa)、问荆(Equisetum arvense)的干燥物 IOOOg 中力口 入90%乙醇液12L(升)，40°C下搅拌5小时，用滤纸回收滤液。重复2次该操作，用蒸发 器对滤液减压浓缩，除去乙醇溶剂。其结果，得到日本厚朴木兰提取物120. 6g、杏仁提取 物150. 4g、甘茶提取物170. 9g、葡萄柚提取物127. 3g、麦冬提取物115. 3g、常春藤提取物 204. Sg、肥皂草提取物143. 7g、鱼腥草提取物133. 9g、母菊提取物193. 2g、棕儿茶提取物 168. 2g、金缕梅提取物112. 0g、桑袖山物103. Sg、米糠提取物184. 7g、问荆提取物102. 7g的 干燥重量。实施例2(肝细胞中的维生素C转运体(SVCT)的产生促进活性的测定)将源自人类肝癌的!fepG2细胞(大日本制药株式会社制)种到直径3.5cm的培 养皿(7 7 > - >社制)使得成为5X 103cells，在含有10%的灭活胎牛血清(FBS)的 DMEM培养液7 二社制)中，在37°C、5% 二氧化碳存在下培养3天。3天后置换成新 的培养液，并作为被验物质添加用的细胞。作为被验物质的夏至草素、胆留醇苯甲酸酯、 ugaferine, lapiferine、乙酸香叶酯、橙花叔醇、二氢茉莉酮、香芹基乙酸、愈创木奧、二氢 松柏醇、甜菊甙、DL-α -菔烯、马鞭草苷、1-二十七烷醇、4-羟基香豆素、胆酸、胆留醇油酸 酯、白蜡树甙、佛手酚从7 t 二〉社买入。被验物质溶解于二甲亚砜(DMSO)中，添加到被验 物质添加用的细胞中使得最终浓度为100μΜ，6小时后，使用TRIZOL试剂(4 > e卜α夕 工乂社制)，通过常规方法回收全RNA。回收的全RNA使用First-StrandcDNAstrandcDNA
15Synthesis kit ( 7 * \ Λ K 4才寸4工 > 义社制)变换成cDNA，供于实时PCR。实时PCR 根据QuantiTectSYBRGreen PCR Kit (今了 ” >社制)来调制模板，使用实时PCR装置(MJ 1J寸一 +社制)测定促进SVCTl、SVCT2和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的表达的活 性。已知GAPDH基因作为看家基因，在全部细胞中恒定地表达，因此，作为内部标准的对照 基因被广泛使用。此外，将被验物质无添加(DMS00. 1%)作为对照组。PCR用引物和PCR 条件如下所示。〈引物〉SVCTl 用5，-TTC TGA TTGTGC TGC TGACC-3，(序列表序列号 1)5，-ATG TCA CTGTTG GCA TGAGC-3，(序列表序列号 2)SVCT2 用5，-GGA ACC TCTTTG TGC TTGGA-3，(序列表序列号 3)5，-CCT GGG ATGGTG TTA TC CAG-3，(序列表序列号 4)GAPDH 用5，-CGA CCA CTTTGT CAA GCTCA-3，(序列表序列号 5)5，-TTC CTC TTGTGC TCT TGCTG-3，(序列表序列号 6)<PCR的反应条件〉关于SVCTl 和 SVCT2以(i)95°C、15 分钟一(ii)94°C、15 秒一(iii) 55°C、30 秒一(iv) 72°C、30 秒为 1 循环，进而重复35次(ii) (iv)后，在4°C下保存。关于GAPDH以(i)95°C、15 分种一(ii)94°C、15 秒一(iii) 58°C、30 秒一(iv) 72°C、30 秒为 1 循环，进而重复35次(ii) (iv)后，在4°C下保存。PCR引物的校正通过PCR产物的溶解曲线和RT-PCR产物的电泳来确认。目标 基因的表达量如下计算并评价在PCR产物的指数函数扩增区域的适当位置设定阈值 (threshold)，并算出从阈值与PCR产物扩增曲线的交点得到的循环数(thresholdcycle Ct值)。各被验物质间的表达量的评价如下进行将作为对照组的被验物质无添加 (DMS00. 1 % )的SVCTl或SVCT2的mRNA的Ct值除以GAPDH的Ct值而得到值设为1，与被 验物质添加时的表达量相比较研究。结果示于表1和表2。其结果可知，与对照组相比，促进SVCTl和SVCT2两者表达的化合物为夏至草素和 胆甾醇苯甲酸酯，仅促进SVCTl表达的化合物为甜菊甙、DL-α -菔烯、马鞭草苷、1-二十七 烷醇、4-羟基香豆素、胆酸、胆留醇油酸酯、白蜡树甙、以及佛手酚，仅促进SVCT2表达的化 合物为ugaferine、lapiferine、乙酸香叶酯、橙花叔醇、二氢茉莉酮、香芹基乙酸、愈创木 奧、以及二氢松柏醇。此外，在成骨细胞中使用公知具有促进SVCT2表达的作用的地塞米松来尝试进行 与本发明的化合物的活性比较评价，地塞米松在肝细胞中完全看不到促进SVCT2表达的作用。表1肝细胞中的维生素C转运体(SVCTl)的产生促进活性的测定
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表2肝细胞中的维生素C转运体(SVCT2)的产生促进活性的测定 实施例3(黑素细胞中的维生素C转运体(SVCT)的产生促进活性的测定)将源自人类正常黑素细胞的NHEM细胞(夕，#々社制)种到直径3. 5cm的培养 皿(7 7 > - >社制)使得成为5X 103cells，在含有特定添加剂的254S培养液(夕，# 々社制)中，在37°C、5% 二氧化碳存在下培养8天。8天后，置换成新的培养液并作为被验 物质添加用的细胞。作为被验物质，使用从实施例1提取的植物、日本厚朴木兰(Magnolia obovata) > {Ζ (Prunus duicis)、1ξ[" ^ (Hydrangea macrophylla) > 罾 t由(Citrus paradise)、麦冬(Ophiopogon jponicus)、常春藤(Hedera helix)、月巴阜草(Saponiria officinalis)、鱼月星草(Houttuynia cordata)、母菊(Matricaria chamomilla)、掠儿 茶(uncalia gambir)、金缕梅(Hamamelis virginiana)、桑(Morus alba)、米糖(Oryza sativa)、问荆(Equisetum arvense)。被验物质再溶解到50% 1，3_ 丁二醇水中使得成为
固体成分，添加到被验物质添加用的细胞中使得该溶液的最终浓度为0. 5%,6小时后， 使用TRIZOL试剂(4 > Ii卜α夕工 > 社制)，通过常规方法回收全RNA。使用了 SVCT1、 SVCT2和GAPDH的实时PCR的表达评价通过与实施例2同样的评价方法实施。结果示于表 3。其结果，与对照组相比，可知从实施例1提取的植物提取物促进了 SVCT2的表达。 此外，已知在成骨细胞中具有促进SVCT2表达作用的地塞米松，在黑素细胞中完全看不到 促进SVCT2表达的作用。另外，本实施例中使用的源自人类正常黑素细胞的NHEM细胞由于 看不到SVCTl的表达，因而无法对促进SVCTl表达的活性实施评价。表3黑素细胞中的维生素C转运体(SVCT2)的产生促进活性的测定
常春藤提取物2. 0肥皂草提取物2. 3鱼腥草提取物1. 5母菊提取物2. 4棕儿茶提取物3. 9金缕梅提取物2. 3桑提取物2. 2米糠提取物2. 4问荆提取物2. 5实施例4(黑素生成抑制试验)为了评价结合使用本发明中得到的植物与维生素C对美白作用的效果而通过以 下的试验测定黑素生成抑制活性。作为生成黑素的细胞，使用源自小鼠的B16-F10黑色素 瘤细胞，种到48孔板的各孔中使得成为2X 103cells，在添加FBS以使最终浓度为10%的 含氨基葡萄糖的最小必须培养液(MEM)中培养5天。其后，将培养液交换为含10%FBS、茶 碱的MEM，并作为被验物质添加用的细胞。被验物质使用如下物质在50% 1，3- 丁二醇水 中再溶解实施例1中得到的日本厚朴木兰、杏仁、甘茶、葡萄柚、麦冬、常春藤、肥皂草、鱼腥 草，使得固体成分为1 %。添加浓度按照被验物质的最终浓度为0. 5%、以及同时维生素C的 最终浓度为100μ g/ml来添加到被验物质添加用的细胞中，培养3天，作为黑素生成抑制评 价用的试样。黑素量通过如下求得通过刮刀处理将细胞剥离、离心后，通过十二烷基 硫酸钠(SDS)增溶，测定475nm、260nm的吸光度而求得。黑素生成抑制率通过如下算出将 475nm、260nm的吸光度的在添加了被验物质的培养液中培养的细胞的吸光度作为S475、S260， 将475nm、260nm的吸光度的在不添加被验物质的培养液中培养的细胞的吸光度作为C475、 C26tl，通过下式1算出。该结果示于表4。如表4所示可知，单独添加被验物质时，看不到黑 素生成抑制效果，但通过与维生素C同时添加，则与维生素C单独相比明显抑制黑素生成。 由此可知，含有这些被验物质和维生素C的组合物具有黑素生成抑制功能，具有美白作用。式1黑素生成抑制率(%) = i-[(S475/S260)/(C475/C260)] X 100表 4黑素生成抑制试验
19 实施例5(三维皮肤模型的黑素生成抑制试验)为了评价结合使用本发明中得到的葡萄柚提取物、作为维生素C衍生物的 2-0- α -D-吡喃葡糖基_抗坏血酸(AA2G)、以及作为葡萄糖苷酶活化剂使用的紫锥花提取 物对美白作用的效果，通过以下的试验测定黑素生成抑制活性。作为评价体系，使用” 7 #々社销售的包含源自正常人类的黑素细胞的三维皮肤 模型(MEL-300试剂盒)。按照试剂盒的说明而开始培养，培养液和被验物质每2天交换为新 的物质，进行10天培养。10天后，在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤组织后，回收到1. 5ml管中， 添加蒸馏水100 μ 1，进行超声波破碎。进而，加入900 μ 1 Soluene-350 (和光纯药社制)， 在100°C静置45分钟，使组织和黑素增溶，不溶组分通过离心分离(10000rpm、10分钟)除 去。黑素的测定通过合成黑素(》- ^ K V , ★社制)做成标准曲线并通过500nm的 吸光度算出。被验物质使用在50% 1，3-丁二醇水中再溶解实施例1中得到的葡萄柚以使固体 成分为的物质(Gr)、2-0-α -D-批喃葡糖基-抗坏血酸(AA2G)、用30%乙醇水提取紫锥 花的叶的干燥物的紫锥花提取液(Ech)(含有0.3%紫锥花提取物(固体成分))。向三维 皮肤模型中添加的浓度按照Gr的最终浓度为0. 5%、或者同时AA2G的最终浓度为2%、或 者同时Ech为0. 2%来添加，分别评价单独、结合使用时的黑素生成抑制活性。其结果示于图1。如图1所示可知，葡萄柚提取液(Gr)、2-0- α -D-吡喃葡糖基-抗坏血酸(AA2G)、 紫锥花提取液(Ech)均在单独时与无添加的对照组相比看不到显著性的差异，通过将3者 结合使用而看到显著性的黑素生成抑制活性。实施例6(人类皮肤经紫外线照射的炎症的抑制、色素沉积的改善试验)1.被验者使用健康成人男性10名(27 35岁)的背部进行实验。2.验体使用作为维生素C衍生物的2-0- α -D-吡喃葡糖基-抗坏血酸(AA2G)和 作为维生素C转运体产生促进剂的葡萄柚提取物(GFE)，按下述表5所示的组成调制验体。以下，使用下述组成的验体进行评价试验。表 5
AA2GGFE1,3-BG提纯水实施例62. 0%0. 003%0. 247%剩余比较例12. 0%0. 0%0. 247%剩余比较例20. 0%0. 003%0. 247%剩余比较例30. 0%0. 0%0. 247%剩余AA2G 林原制2_0_ α -D-吡喃葡糖基-抗坏血酸CFE:—丸7 了瓜二 7制葡萄柚果实提取物7 ^ ；^ l· ^ 7葡萄柚B中的固体 成分1，3_BG :1，3_ 丁二醇3.试验方法3. 1炎症的抑制效果的评价在背部将各验体设定4X 4cm的涂布区域，涂布8周验体。涂布量每1次涂布3mL， 1周约4次、8周约32次(28 35次)。8周后，测定该部位的LW表色系的f值，进而， 照射MED的1. 2倍的太阳紫外线，2天后，测定同部位的a*值。紫外线照射2天后的a*值 减去紫外线照射前的f值，求出Δ 值。Δ 值越小，炎症的抑制效果越高。3. 2色素沉积的改善效果的评价在背部将各验体设定4X4cm的涂布区域，测定验体涂布前的LW表色系的L* 值。接着，照射MED的1.2倍的太阳紫外线，2天后，测定同部位的L*值。从测定2天后的
值后开始涂布验体。涂布量每1次涂布3mL、l周约4次、8周约32次(28 35次)。紫 外线照射2、4、8周后测定同部位的L*值。紫外线照射2天后和紫外线照射2、4、8周后的 L*值减去验体涂布前(紫外线照射前)的L*值，求出ΔΙ；值。ΔΙ；值的负的值越小，色素 沉积越得到改善。3. 3测定机器
测色MIN0LTA制分光测色计CM-800D紫外线照射S0LARLIGHT CO.制 MODEL XPS 2004.测定结果4. 1炎症的抑制效果各验体涂布部位的Δ 值示于表6、图2。表6
验体Δ a*值实施例60. 82比较例11. 33比较例22. 25比较例32. 10仅配合作为维生素C转运体产生促进剂的GFE的比较例2的Δ 值与任何也未配 合的比较例3的Af值为几乎相同的值。因此可知，仅GFE则无法得到抗炎症效果。另一 方面，结合使用GFE与维生素C衍生物的AA2G的实施例6与比较例3相比显示显著性的抗 炎症效果。而且，实施例6的Δ 值降低至仅配合AA2G的比较例1的Δ 值的60%。由 于看不到GFE自身的抗炎症效果，因而结合使用GFE与AA2G的实施例6与单独配合AA2G 的比较例1相比，显示优异的抗炎症效果，这可以说是无法预测的显著的效果。4. 2色素沉积的改善效果各验体涂布部位的Δ L*值示于表7、图3。表7
验体UV照射 、‘- mUV照射 2天后UV照射 2周后UV照射 4周后UV照射 8周后实施例60- 2. 17-0. 95-0. 500. 44比较例10-2. 07-1. 57-1. 25-0. 09比较例20-2. 06-2. 23-1. 75- 0. 15比较例30-2. 02-1. 98-1. 92-0. 99 在紫外线照射2周后，作为仅配合维生素C转运体产生促进剂的GFE的比较例2的 Δ L*值与未配合任何物质的比较例3的ΔΙ；值相比负的值变大。因此可知，仅GFE则看不 到色素沉积改善效果。另一方面，将GFE与作为维生素C衍生物的AA2G结合使用的实施例 6与比较例3相比，显示显著性的色素沉积改善效果。而且，实施例6的ΔΙ；值降低至仅配 合AA2G的比较例1的ΔΙ；值的负的值的60%，与比较例1相比，显示显著性的色素沉积改 善效果。由于看不到GFE自身的色素沉积改善效果，因而结合使用GFE与AA2G的实施例6
22与单独配合AA2G的比较例1相比显示优异的色素沉积改善效果，这可以说是无法预测的显 著的效果。在紫外线照射4周后，也得到与紫外线照射2周后几乎同样的效果。在紫外线 照射8周后，实施例6的色素沉积改善效果也最优异。以下举出配方例具体说明，但并不限 于此。实施例7(葡萄柚提取物的维生素C转运体(SVCT)的产生促进活性的测定)将小鼠黑色素瘤B16-F10细胞(大日本制药株式会社制)种到直径3. 5cm的培 养皿(7 TAzr >社制)中使得成为5X103cells，在含有10%的灭活胎牛血清(FB S)的 DMEM培养液(二社制)中、在37°C、5% 二氧化碳存在下培养。培养3天后，置换成新 的培养基并添加作为被验物质的葡萄柚(Citrus paradise)提取物，使得培养基中的最终 浓度为0.6、1.8、6、18、60、18(^8/!111，6小时后使用11 12(^试剂(4 卜口夕工 >社制) 通过常规方法回收全RNA。作为葡萄柚提取物，添加实施例6中使用的一丸7 τ ；^ 7制葡 萄柚果实提取物7 r ^^ W > ζ葡萄柚B。该葡萄柚提取物为如下得到的物质在葡萄 袖 citrus paradise Macfadyen (Rutaceae)的新鲜果实 5kg 中力口入 1,3- 丁二醇，浸淸，过 滤，向该滤液20kg中加入提纯水20kg混合、过滤，从而得到。葡萄柚提取物的浓度换算为 固体成分浓度时为葡萄柚提取液中0. 6% (6mg/mL)。回收的全 RNA供于实时定量 one step RT-PCR。根据 QuantiTect SYBR Green PCR Kit( * 7 >社制)调制模板，使用PCR装置(MJ V寸一 ★社制)，测定促进SVCT2和甘油 醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH) mRNA的表达活性。PCR用引物和PCR条件如下所示。〈引物〉SVCT2 用Mm_Slc23a2_l_SG QuantiTect Primer Assay (、7 V >社制)GAPDH 用5，-AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG-3，(序列表序列号 7)5，-ACA CAT TGG GGG TAG GAA CA-3，(序列表序列号 8)<PCR的反应条件〉以(i) 50"C、30 分钟一(ii)95"C、15 分钟一(iii)94°C、15 秒一(iv) 55"C、30 秒 —(v)72°C、30秒为1循环，进而重复40次(ii) (ν)后，在4°C下保存。PCR引物的校正通过PCR产物的溶解曲线和RT-PCR产物的电泳来确认。目标基 因的表达量如下表示在PCR产物的指数函数扩增区域的适当位置设定阈值，并从阈值与 PCR产物扩增曲线的交点得到循环数(Ct值)，通过以下式算出，以相对于作为内部标准的 GAPDH的表达量的数值表示。式2RNA 表达量 Y = 2-(ct)式3SVCT2 的表达量=Y(SVCT2)/Y(GAPDH)表达量的比较评价将被验物质无添加的对照组的SVCT2的表达量作为1并通过相 对值进行比较。结果示于图4。其结果可知，SVCT2的表达的促进依赖于葡萄柚提取物的 浓度。考虑到由PCR的原理上Ct值的计测值产生的误差，进而实施例3中SVCT产生促进
23效果为1. 4倍以上的植物提取物通过在实施例4中的黑素生成抑制试验中与维生素C同时 添加从而与维生素C单独相比具有黑素抑制效果的增强作用，因此，把SVCT的表达量与对 照组相比增加1.4倍以上的物质，判断为有SVCT促进效果。其结果，可知在小鼠黑色素瘤 B16-F10细胞中，葡萄柚提取物18μ g/ml以上具有促进SVCT2表达的效果。实施例8(化合物的维生素C转运体(SVCT)的产生促进活性的测定)将源自人类大肠癌的Caco2细胞(大日本制药株式会社制)种到直径3.5cm的培 养皿使得成为5X 103cells，在含有10%的灭活胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中、在37°C、 5%二氧化碳存在下培养。培养3天后，置换成新的培养基并添加作为被验物质的甜菊甙 (CAS 57817-89-7)、乙酸香叶酯(CAS 105-87-3)、橙花叔醇(CAS :7212-44_4)、二氢茉莉 酮(CAS :1128-08-01)、夏至草素(CAS :465_92_9)、马鞭草苷(CAS :548_37_8)、白蜡树甙 (CAS :524-30-1))、佛手酚(CAS :486-60_2)，使得培养基中的最终浓度为100 μ M。从被验物 质添加起6小时后使用TRIZOL试剂通过常规方法回收全RNA。回收的全RNA供于实时定量 one StepRT-PCR0 根据 QuantiTectSYBR Green PCR Kit ( ^f 7 y > 社制)调制模板，使用 PCR装置(MJ 'J寸一 f社制)测定促进SVCTl、SVCT2和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA 的表达活性。PCR用引物使用与实施例2中使用的物质同样的物质。PCR条件如下所示。<PCR的反应条件〉关于SVCTl 和 SVCT2以(i) 50"C、30 分钟一(ii)95"C、15 分钟一(iii)94°C、15 秒一(iv) 55"C、30 秒 —(v)72°C、30秒为1循环，进而重复40次(ii) (ν)后，在4°C下保存。关于GAPDH(i)50 °C、30 分钟一(ii)95 °C、15 分钟一(iii)94 °C、15 秒一(iv)58°C、30 秒 —(v)72°C、30秒为1循环，进而重复35次(ii) (iv)后，在4°C下保存。PCR引物的校正通过PCR产物的溶解曲线和RT-PCR产物的电泳来确认，通过与实 施例7同样的算出方法进行目的基因的表达量的比较。结果示于表8。与实施例7同样，将 与对照组相比增加了 1. 4倍以上SVCT的表达量的物质作为具有SVCT促进效果时，仅促进 SVCTl表达的化合物为甜菊甙、乙酸香叶酯、二氢茉莉酮、马鞭草苷、白蜡树甙、佛手酚，仅促 进SVCT2表达的化合物为夏至草素。可知橙花叔醇促进SVCT1、SVCT2这两者表达。表8被验物质/GAPDH (相对对照比)SVCTlSVCT2甜菊甙1.561.09乙酸香叶酯1.571.12橙花叔醇1.821.97二氢茉莉酮2.031.33夏至草素1.391.62马鞭草苷1.521.00白蜡树甙2.281.17佛手酚2.191.28实施例9(使用三维肝细胞模型的化合物的维生素C转运体(SVCT)的产生促进活性的测 定)为了在接近于生物体内的环境中进行评价，使用在中空纤维内将人类肝细胞三维 培养的人类三维肝细胞模型TESTLIVER (东洋纺社制)。人类三维肝细胞模型在12孔板 中人类肝细胞无血清培养基(东洋纺社制)中、在37°C、5%二氧化碳存在下、在设置的振荡 机上进行振荡培养。振荡培养3天后，置换成新的培养基并添加作为被验物质的甜菊甙、乙 酸香叶酯、橙花叔醇、二氢茉莉酮、夏至草素、马鞭草苷、白蜡树甙、佛手酚，使得培养基中的 最终浓度为100 μ M。每24小时进行培养基的交换，每次都要添加被验物质。从被验物质 添加起3天后使用TRIZOL试剂通过常规方法回收全RNA。使用SVCT2和GAPDH的实时PCR 的表达评价通过与实施例8同样的评价方法实施。结果示于表9。与实施例7同样，将与对照组相比增加1. 4倍以上SVCT的表达量的物质作为具有 SVCT促进效果时，仅促进SVCTl表达的化合物为乙酸香叶酯、马鞭草苷，仅促进SVCT2表达 的化合物为橙花叔醇。可知促进SVCT1、SVCT2两者表达的化合物为甜菊甙、二氢茉莉酮、夏 至草素、白蜡树甙、佛手酚。表9
25被验物质/GAPDH (相对对照比)SVCTlSYCT2甜菊甙1.601.74乙酸香叶酯1.761.30橙花叔醇1.371.54二氢茉莉酮2.781.66夏至草素1.531.70马鞭草苷2.731.00白蜡树甙1.801.51佛手酚1.771.43实施例10(三维皮肤模型的黑素生成抑制试验(Fontana-Masson染色))三维皮肤模型Melan0Derm(夕，#々社制)中，为了进行同时添加葡萄柚提 取物和维生素C时的黑素生成抑制效果的评价以及黑素细胞的形态观察，进行借助 Fontana-Masson染色的黑素的染色。此外，对于具有使α -葡萄糖苷酶的活性上升、并将 2-0- α -D-吡喃葡糖基_抗坏血酸迅速变换为活性型L-抗坏血酸的作用的紫锥花提取物结 合使用时也进行了评价。三维皮肤模型根据试剂盒的说明开始培养，培养基和被验物质每 2天交换为新的物质，被验物质以与实施例5使用的物质同样的结合使用。其中，葡萄柚提 取物使用实施例7中使用的提取物。培养第10天通过显微镜进行形态观察，用PBS洗涤组 织后，通过常规方法进行Fontana-Masson染色。结果示于图5、6。其结果可知，30 μ g/mL的葡萄柚提取物(GFE)、6 μ g/mL的紫锥花提取物(ECE)的 单独和两者的组合时，黑素细胞活化，但通过加入2质量％的2-0- α -D-吡喃葡糖基-抗坏 血酸(AA2G)，则黑素细胞收缩、失去活性。进而可知，通过结合使用30 μ g/mL的葡萄柚提取 物(GFE)，黑素产生抑制活性得到促进。此外可知，通过结合使用2质量％的2-0- α -D-吡 喃葡糖基_抗坏血酸(AA2G)、30 μ g/mL的葡萄柚提取物(GFE)、6 μ g/mL的紫锥花提取物 (ECE)这三种，黑素生成抑制活性最高。葡萄柚提取物(GFE)使用实施例7中记载的葡萄柚 提取液来添加。紫锥花提取物使用实施例5中记载的紫锥花提取液来添加。实施例11(维生素C的细胞内摄入量的测定)将小鼠黑色素瘤B16-F10细胞和源自人类大肠癌的Caco2细胞分别种到直径IOcm 的培养皿使得成为IX IO6Cells,在含有10%的灭活胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中、在 37°C、5%二氧化碳存在下培养。小鼠黑色素瘤B16-F10细胞将培养3天后的细胞作为维生
26素C摄入试验用的细胞，源自人类大肠癌的Caco2细胞将培养1周后的细胞作为维生素C 摄入试验用的细胞。使用实施例7所记载的葡萄柚提取液，添加葡萄柚提取物使得培养液 中的最终浓度为30μ g/ml并将24小时后的细胞用于维生素C摄入试验。将培养液在培 养用缓冲液(15mM Hepes、135mM NaCl、5mM KClU. 8mM CaCl2,0. 8mM MgCl2)中进行 2 次洗 涤，然后在37°C、5%二氧化碳存在下进行1小时预培养。置换成新的培养用缓冲液、作为 维生素C添加抗坏血酸()^ ι社制)5mM、小鼠黑色素瘤B16-F10细胞培养3小时、源自 人类大肠癌的Caco2细胞培养1小时，然后用冰冷的PBS洗涤3次，使反应停止。在包含 ImM EDTA的70% MeOH Iml中溶出抗坏血酸，然后加入IOmM 二硫苏糖醇(和光纯药工业株 式会社制)作为还原剂反应10分钟，变换成还原型抗坏血酸，将用0. 2 μ m过滤器(了 F 〃、巧、”社制)过滤的物质用于分析。分析使用高效液相色谱仪(HPLC)，柱使用L-柱 ODS (4. 6mmX 250mm)(化学物质评价研究机构制)，流动相使用A相(IOmM四丁基氢氧化铵 溶液/IOmM磷酸二氢钾/0.5%甲醇PH = 6)和B相(50%甲醇)。作为洗脱条件，施加0 15分钟仅A相、15 25分钟从A相至B相、25 35分钟从B相至A相的梯度，35 60分 钟仅A相。在该条件下的还原型抗坏血酸的洗脱时间为21分钟。从此时的峰高度，使用 标准曲线算出细胞内的抗坏血酸浓度，作为维生素C的细胞内摄入量。同时使用细胞用蛋 白质提取试剂(PIERCE社制)从细胞提取蛋白质。通过使用作为蛋白质定量试剂盒的DC Protein Assay(BIO-RAD)用Lowry法计测的蛋白质量，对抗坏血酸向细胞内的摄入量进行 补正，以抗坏血酸量(ymol)/蛋白质量(mg protein)来表示。结果示于图7 10。其 结果可知，通过添加30 μ g/ml葡萄柚提取物，维生素C向细胞内的摄入量在小鼠黑色素瘤 B16-F10细胞中增加至约2. 4倍、在源自人类大肠癌的Caco2细胞中增加至约1. 5倍。实施例12(葡萄柚提取物中的佛手酚的定量分析)通过HPLC法分析实施例6、7、10、11中使用的葡萄柚提取物(一丸7 7 > 二义制 葡萄柚果实提取物7 r ^^ W > ζ葡萄柚Β中的固体成分)所含的佛手酚的浓度。其结 果，葡萄柚提取物中的佛手酚为0. 015质量％。HPLC分析条件(柱Capcell pak C18 4. 6mm Φ X 250mm(SHISEID0)柱温度40°C检测器UV315nm洗脱液(A) 5%醋酸水溶液(B)乙腈=75 25流速l.OmL/分钟、注入量20yL、试样稀释溶剂DMS0/乙醇=2 18(V/V))。佛手酚溶出时间9. 6分钟实施例13(化合物组的黑素生成抑制试验)为了评价结合使用本发明中得到的化合物与维生素C对美白作用的效果，通过以 下的试验，测定黑素生成抑制活性。作为生成黑素的细胞，使用源自小鼠的B16-F10黑色素瘤细胞，在6孔板的各孔按照1 X IO5Cells播种，在DMEM+10% FBS的培养液(年二社制)中培养24小时，使细 胞粘连。其后，用DMEM+10% FBS置换培养液、添加IOOnM的[Nle4，D_Phe7] α -MSH( ν ”-r ^ K 'J ,子社制)，诱导黑素产生。同时，作为被验物质，添加ugaferine25yM(含 有 0. DMS0)、夏至草素、Iapiferine 50 μ M(含有 0. 1% DMS0)、白蜡树甙 100 μ M(含有 0. 1% DMS0)、对照添加0. 1% DMS0。被验物质单独组在其后48小时培养，进行黑素生成抑 制评价。被验物质与维生素C的结合使用组在其后每24小时添加维生素C( ν ^F
'J , +社制)至最终浓度4mM，添加2次(总计添加8mM)，进行黑素生成抑制评价。黑素量的测定通过如下进行通过胰蛋白酶处理将细胞剥离，重复2次PBS洗涤， 通过TritonX(和光纯药社制)将细胞增溶，吸光度为475nm。使用合成黑素(〉^、 -r ^ Y 'J ” 社制)制成标准曲线并算出黑素量。被验物质与维生素C带来的结合使用效 果通过下式4的黑素生成抑制率计算出。〔式4〕结合使用效果带来的黑素生成抑制率(％ ) = (1-维生素C结合使用时的黑素量 /被验物质单独时的黑素量)X100其中，对照的被验物质单独时的黑素量值是指添加最终浓度0. 的用于被验物 质的溶解的溶剂、即DMSO时的黑素量，对照的维生素C结合使用时的黑素量值是指结合使 用0. DMSO和维生素C时的黑素量。此外，对照的结合使用效果带来的生成抑制率是指 0. 1 % DMSO与维生素C结合使用添加时的黑素量相对于单独添加0. 1 % DMSO时的黑素量作 为黑素生成抑制率来表示的值。将该结果示于表10。在0. DMSO与维生素C结合使用添加时，相对于0. 1%DMS0 单独添加时的黑素量的黑素生成抑制率为61.4%，将夏至草素、ugaferine, lapiferine, 白蜡树甙和维生素C结合使用时，黑素生成抑制率分别提高至69. 7%、64. 6%、68. 1%, 68.4%。这是从0. DMSO与维生素C结合使用添加的数据和夏至草素、ugaferine、 Iapiferine、白蜡树甙单独的数据无法预测的显著的协同效果。该协同效果可推测为由夏至草素、ugaferine、lapiferine,白蜡树甙的SVCT产生 促进效果带来的。表10夏至草素、ugaferine, lapiferine,白蜡树甙的黑素生成抑制试验
28被验物质黑素生成抑制效果被验物质单 独时 (pg黑素 /IO6Cells)维生素C结合 使用时 (Mg黑素 /IO6Cells)维生素C结合 使用效果带 来的黑素生 成抑制率(％)对照 (0.1%DMSO)23.39.061.4夏至草素 (50μΜ)15.74.869.7ugaferine (25 μΜ)15.85.664.6lapiferine (50μΜ)15.14.868.1白蜡树甙 (ΙΟΟμΜ)22.27.068.4实施例14(化合物组的胶原产生评价试验)为了评价关于本发明中得到的化合物与维生素C的胶原产生能力(也称为胶原合 成促进能力)的结合使用效果而进行以下的试验，从而测定胶原产生促进作用。将源自正 常人类皮肤的纤维芽细胞、即NHDF细胞(Cambrex Bio Science Walkersville社制)种 到24孔多孔板{7 r a >社制)使得成为5X 104cells/well，在DMEM+10% FB S的培 养液(￥7、社制)中，在37°C、5%二氧化碳存在下培养3天。置换成FBM(serum free, 无血清)的培养液(三光纯药会社制)，作为被验物质添加夏至草素50 μ Μ、甜菊甙、佛手酚 100 μ Μ,对照添加0. 1 % DMS0,进行24小时的预培养。预培养后，用FBM培养液洗涤细胞， 置换成FBM培养液后，将维生素C( ν “了 ；ι F 'J、y ★社制)添加到培养液中使得最终 浓度为10 μ M，处理1小时，将维生素C摄入细胞内。其后，用FBM培养液洗涤细胞，置换成 FBM培养液，24小时后，对各孔均回收Iml的条件培养液(conditioned medium (CM))，制成 I型胶原测定的试样。对于前述回收的CM，用typel collagenC-p印tide (PIP) EIA kit(夕 力7社制)测定胶原量(检测极限浓度10ng/ml)。在抗PIP单克隆抗体板(96孔)的各 孔中加入过氧化物酶标记的抗PIP单克隆抗体100 μ 1，接着，添加预先以含1 %牛血清白蛋
29白的PBS稀释20倍的CM各20 μ 1，在37°C培养3小时。其后，丢掉反应液，以200 μ 1 PBS 洗涤4次后，加入各100 μ 1基质TMBZ (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺)，在室温下使其反应15 分钟。反应结束时加入IN硫酸100 μ 1，测定波长450mm的吸光度。将夏至草素的测定结果示于表11。夏至草素在维生素C结合使用时与对照相比看 到了胶原产生促进作用。甜菊甙、佛手酚的结果示于表12。甜菊甙、佛手酚在维生素C结合使用时与对照相 比看到了胶原产生促进作用。表11夏至草素的胶原产生促进作用
被验物质单 独时 (ng胶原 /IO5Cells)维生素C结合 使用时 (ng胶原 /IO5Cells)比率(维生素 C结合使用时 /被验物质单 独时)对照 (0.1% DMS0)144022421. 56夏至草素 (50 μ Μ)151025671. 70表 12甜菊甙、佛手酚的胶原产生促进作用
被验物质单独时 (ng胶原 /IO5Cells)维生素C结合使用 时 (ng 胶原 /IO5Cells比率(维生素 C结合使用时/ 被验物质单独 时)对照 (0. 1 % DMS0)161023611. 47甜菊甙 (100 μ M)155327241. 75
30
配方例1 [片剂的制造]
使用鱼腥草提取物和维生素C，通过常规方法制造下述组成的片剂。
(组成) 鱼腥草提取物
(配方重量％) 14. 39橄榄叶提取水解物4. 66
胱氨酸16. 00
烟酰胺1. 2
维生素C24. 45
纤维素26. 80
淀粉4. 00
食用蛋壳粉6. 00
蔗糖酯2. 50
配方例2
[果汁的制造]
使用含甜菊甙的甜菊提取物和维生素C，通过常规方法制造下述组成的果汁。
(组成)(配方重量％)
果糖葡萄糖液糖15. 00
柠檬酸10. 40
维生素C0. 50
香料0. 02
色素0. 10
甜菊提取物10. 00
提纯水63. 98
配方例3
[软膏的制造]
使用夏至草素和维生素C，通过常规方法制造下述组成的软膏。
(组成)(配方重量％)
白色凡士林24. 00
丙二醇12. 00
硬脂醇20. 00
对羟基苯甲酸甲酯0. 05
维生素C2. 00
夏至草素2. 00
香料0. 10
31
提纯水39. 85
配方例4
[化妆水的制造]
使用葡萄柚提取物、2-0-α -D-吡喃葡糖基_抗坏血·过常规方法制造下述组成的化妆水。
(组成)(配方重量％)
1，3_ 丁二醇5. 00
乙醇4. 50
甘油10. 00
紫锥花提取物0. 50
AA2G2. 00
葡萄柚提取物0. 50
二丙二醇2. 00
甘草酸二钾盐0. 10
氢氧化钾0. 40
提纯水75. 0
配方例5
[面膜的制造]
使用葡萄柚提取物、2-0-α -D-吡喃葡糖基_抗坏血·过常规方法制造下述组成的面膜。
(组成)(配方:重量％ )
1，3_ 丁二醇6. 00
乙醇3. 50
甘油5. 00
AA2G2. 00
菌类植物胶(sclerotium gum) 0. 30
橄榄叶提取水解物1. 00
紫锥花提取物0. 20
柠檬酸钠0. 20
柠檬酸0. 02
葡萄柚提取物0. 5
胱氨酸0. 08
羧甲基纤维素0. 30
氢氧化钾0. 40
提纯水80. 50
配方例6
[乳液的制造]
使用葡萄柚提取物、2-0-α -D-吡喃葡糖基_抗坏血·
过常规方法制造下述组成的乳液t
32
工业上的可利用性根据本发明的维生素C转运体产生促进剂，在使用细胞的分析中，可显著促进 SVCTl和/或SVCT2的mRNA的表达，可将其作为美白用组合物或胶原合成促进用组合物使用。
权利要求
维生素C转运体产生促进剂，其特征在于，含有葡萄柚的粉碎物、其提取物、或提取物的水解物。
2.维生素C吸收促进用组合物，其特征在于，将权利要求1所述的维生素C转运体产生 促进剂与维生素C或维生素C衍生物组合而成。
3.根据权利要求2所述的维生素C吸收促进用组合物，维生素C衍生物为2-0-α-D-批 喃葡糖基-抗坏血酸。
4.美白用组合物，其特征在于，其包含权利要求2或3所述的维生素C吸收促进用组合物。
5.胶原合成促进用组合物，其特征在于，其包含权利要求2或3所述的维生素C吸收促 进用组合物。
6.美白用组合物，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的维生素C吸收促进用组合 物和葡萄糖苷酶剂。
7.根据权利要求6所述的美白用组合物，葡萄糖苷酶剂为选自紫锥花、酵母、双歧菌、 乳酸菌所组成的组中的至少1种以上的粉碎物、其提取物、或提取水解物。
全文摘要
本发明提供具有维生素C转运体产生促进作用的物质。维生素C转运体产生促进剂，其有效成分为夏至草素、胆甾醇苯甲酸酯、ugaferine、lapiferine、乙酸香叶酯、橙花叔醇、二氢茉莉酮、香芹基乙酸、愈创木薁、二氢松柏醇、甜菊甙、DL-α-蒎烯、马鞭草苷、1-二十七烷醇、4-羟基香豆素、胆酸、胆甾醇油酸酯、白蜡树甙、佛手酚的化合物，或者，日本厚朴木兰、杏仁、甘茶、葡萄柚、麦冬、常春藤、肥皂草、鱼腥草、母菊、棕儿茶、金缕梅、桑、米糠、问荆的提取物。
文档编号A61K8/67GK101912352SQ20101022129
公开日2010年12月15日 申请日期2007年2月13日 优先权日2006年2月14日
发明者人见高正, 千场智寻, 宿里充穗, 山崎奈穗子, 樱井哲人, 相部香 申请人:株式会社芳珂