专利名称：一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体为一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分 含量的方法。
背景技术：
雷公藤药材系卫矛科雷公藤属Hook. f.)植物的根，具有抗炎、抗 菌、免疫调节、抗肿瘤及抗生育等多种药理作用，其原生药及其各类制剂的临床应用极为广 泛，用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾脏病和多种皮肤病，均取得良好的疗效， 尤其是治疗各种免疫亢进性疾病的首选药物。通常雷公藤制剂多是雷公藤根心部分用水(乙醇)和氯仿(乙酸乙酯)提取、经柱色 谱分离得到的一种有效部位，系极性较大的脂溶性成分的混合物，其主要活性成分是二萜 内酯类及生物碱类化合物，但其中的主要活性成分同时又是毒性成分，治疗安全范围比较 窄，临床使用的不良反应时有报道。有资料统计，雷公藤的毒副作用在传统药物中居第三 位，仅次于洋金花和乌头。因此，严格控制雷公藤制剂的质量是当前雷公藤应用最关键的问 题，而药材质量的控制是首要的环节。目前，对于雷公藤药材的质量评价多集中于主要有效 成分雷公藤甲素在生药、粗提物以及各种制剂中的含量测定等方面，但是单一化学成分不 能全面地反映药材质量。建立一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，为雷 公藤药材的质量控制提供参考，为最终实现雷公藤药材质量的稳定可控奠定基础。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种同时测定雷公 藤药材中多个活性成分含量的方法的技术方案，可同时测定二萜内酯类化合物与生物碱类 成分，精确度高，稳定性好，为科学评价和有效控制雷公藤药材的内在质量提供可靠方法。所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征在于采用高 效液相色谱法进行含量测定，以乙腈-水溶剂为流动相进行梯度洗脱，乙腈的体积分数为 55-65%，洗脱时间为155-165 min，流速为0. 70-0. 80mL/min，二极管阵列检测器设定扫描波 长为220-230 nm，柱温为2446°C，进样量为18-22 μ 。所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征在于乙腈的 体积分数为60-63%，洗脱时间为160-163 min，流速为0. 70-0. 80mL/min。所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征在于二极管 阵列检测器设定扫描波长为225-228 nm。所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征在于柱温为 25 °C。所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征在于进样量 为 19-20 μ 。上述一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，可同时测定雷公藤药材中雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、雷公藤植碱、雷公藤新碱、雷酚内酯、雷公藤吉碱、雷公藤 次碱等多个活性成分，其精确度高，稳定性好，解决了目前药材质量评价不能全面地反映药 材质量的问题，为科学评价和有效控制雷公藤药材的内在质量提供可靠方法，为最终实现 雷公藤药材质量的稳定可控奠定基础。本申请文件中涉及的百分比除另有说明外，固体物质为质量比，液体物质为体积 比。
图1为7个对照品的HPLC色谱图(图中峰序号1_雷公藤内酯酮；2_雷公藤内酯 醇；3-雷公藤植碱；4-雷公藤新碱；9-雷酚内酯；12-雷公藤吉碱；13-雷公藤次碱)；图2为不同产地雷公藤药材根皮HPLC指纹图谱(由上向下排列顺序为98-2，96-2， 75-2，71-2，63-2，54-2,46-2, 43-2, 33-2, 20-2, 193-2);图3为不同产地雷公藤药材木质部HPLC指纹图谱(由上向下排列顺序为193-1， 96-1,75-1,71-1, 63-1, 54-1, 46-1, 43-1, 33-1, 20-1, 98-1)； 图4-10分别为7个对照化合物色谱峰的紫外吸收光谱。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。本发明所述的同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，采用高效液相色 谱法进行含量测定，以乙腈-水溶剂为流动相进行梯度洗脱，乙腈的体积分数为阳-65%， 洗脱时间为155-165 min，流速为0. 70-0. SOmL/min，二极管阵列检测器设定扫描波长为 220-230 nm，柱温为M-26°C，进样量为18-22 μ 。乙腈的体积分数优选为60_63%，洗脱时 间优选为160-163 min，流速优选为0. 70-0. SOmL/min，二极管阵列检测器设定扫描波长优 选为225-228 nm，柱温优选为25°C，进样量优选为19-20 μ 。并通过下述相应试验筛选出该测定方法的最佳色谱条件，以进一步说明本发明的 有益效果。1.仪器、试剂与药材1. 1仪器Waters-高效液相色谱仪Waters 600型泵，996型二极管阵列检测器，Waters Empower色谱工作站。1.2 试剂乙腈为色谱纯(Fisher公司)，重蒸水，其它提取用有机溶剂为分析纯。二萜内酯类化合物雷公藤内酯醇(tripto 1 ide )、雷公藤内酯酮(triptonide ) 和雷酚内酯(triptophenolide)；生物碱类成分雷公藤新碱(wilformine)、雷公藤次碱 (wilforine)、雷公藤吉碱(wilforgine)和雷公藤植碱(wilfordsuine)等对照品由作者从 雷公藤植物根中提取、分离得到，其光谱和熔点测定结果与文献报道一致。1.3 药材试验所用雷公藤药材的根分属于雷公藤、昆明山海棠及其中间类型，采自浙江遂昌、苍 南、武义、江山、云和、乐清、开化、缙云、庆元、丽水，以及湖南新宁、江西萍乡等省市县的12个居群的个体样品(见表1)，采集时间为2002年和2003年的10-12月。由于雷公藤药材根 的根皮和木质部所含的成分种类和含量以及所具有的毒性有较大差别，本文均将每一个个 体样品分为两个部位测定，取粗细基本一致的根进行雷公藤药材HPLC指纹图谱研究。
2.试验方法2.1色谱条件色谱柱Merck 公司的 Lichrospher 100 RP_18e 柱(250 mmX4. 6 mm, 5 Mm),预柱 Lichrospher 100 RP_18e柱(IOmmX 4. 6mm，5 Mm)。流动相乙腈一水溶剂系统梯度洗脱， 乙腈的体积分数为55-65%，洗脱时间为155-165 min，流速为0. 70-0. 80mL/min，二极管阵 列检测器设定扫描波长为190 300 nm，柱温为M_26°C，进样量为18-22 μ ，指纹图谱检 测波长为225 nm。2. 2对照品溶液的制备用微量分析天平精密称取对照品雷公藤内酯醇、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次 碱、雷公藤吉碱和雷公藤植碱5-10g，用甲醇-水(6 4)溶解并定容得9. 156Pg/mL溶液， 作为对照品溶液。 2. 3供试品溶液的制备将每一个样本先刮去植物根的栓皮，然后将其韧皮部与木质部分开，分别粉碎过40 目筛，备用。称取样品粉末0.27g，置磨口三角瓶中，加醋酸乙酯25mL，浸泡过夜(1他)， 超声提取45min，静置，过中性氧化铝柱(含2. 5g中性氧化铝，玻璃柱d= 1. Ocm)，然后 用15mL醋酸乙酯冲洗柱子，合并流出液和洗脱液，减压回收醋酸乙酯至干，放置过夜后， 用甲醇-水(6 4)溶液溶解并定容至2mL容量瓶中，摇勻，过0. 45Mm微孔滤膜，取续 滤液为进样液。3.结果和讨论3.1色谱条件的优化在实验过程中，利用多个不同样品(样品编号为98-1，98-2，96-1，96-2，75-1, 75-2,563-1,63-2，54-1，54-2,46-1,46-2, 43-1, 43-2, 33-1, 33-2, 20-1, 20-2, 193-1， 193-2，71-1，71-2共22个)，采用甲醇-水、乙腈-水等溶剂系统，不同比例的等度、梯度 以及不同的梯度曲线进行试验，记录不同条件下的色谱图，并用二极管阵列检测器(DVD)进 行色谱峰的纯度检测，对洗脱溶剂梯度进一步优化。结果表明，以乙腈一水溶液，梯度洗脱程序为0-12 min,乙腈的体积分数(下同)由 20%线性增加至23% ;12-13min,乙腈由23%上升到32% ； 13-30min,乙腈由32%线性增加至 36% ； 30-70min,乙腈为 36% ；70-100min,乙腈由 36% 线性增加至 40%, 100_125min，乙腈由 40%上升到50% ;125-145min,乙腈由50%线性增加至60% ； 145-160min,乙腈为60%的洗脱 条件较好，供试样品中各色谱峰基本达到基线分离。温度对色谱峰分离的影响，在15 °C、20°C、25 °C、30°C等不同温度条件下的试验结 果表明以25°C的温度条件为佳。3. 2检测波长的选择二萜内酯类化合物和倍半萜类生物碱是雷公藤药材中主要有效成分，其中二萜内酯类 化合物因其结构中含有a，b-不饱和内酯环，在紫外光谱中，在225nm附近有最大的吸光 值；而雷公藤倍半萜生物碱的紫外光谱显示在225nm和有其特征性的类似吸收。并 且通过对样品在190-390nm的三维色谱图和7个对照品最大吸收波长的分析，再对不同波 长下检测的色谱图进行比较，发现225nm波长下检测的色图谱将能最大程度地反映出雷 公藤药材中所含的主要有效成分的化学信息(如图1-3所示)，因此，最后选择225nm作为指 纹图谱检测波长。3. 3对照化合物色谱峰的鉴定根据供试22个样品的HPLC图谱所给出的相关参数，应用HPLC-DVD的分析结果对雷公 藤药材中7个对照化合物色谱峰保留时间(tK)和紫外光谱(UV)与对照品分别对应确证，其 中峰1为雷公藤内酯酮，峰2为雷公藤甲素，峰3为雷公藤植碱，峰4为雷公藤新碱，峰9为 雷酚内酯，峰12为雷公藤吉碱，峰13为雷公藤次碱，所鉴定的色谱峰对应之化合物名称见 表2，7个对照化合物色谱峰的紫外吸收光谱见图4-10。3. 4共有特征峰的选择认定以及特征指纹图谱的建立雷公藤中所含的化合物种类极多，经本发明建立的方法将7个对照化合物充分分离 后，获得的雷公藤指纹图谱，每一图谱均有100个以上可以辨认出的色谱峰，但很少有峰面 积大于10%的峰。药材根皮和木质部差别大，不同的样本间差别也很大，因此，从中选择共 有峰和特征峰比较困难。将所有色谱峰叠加，可见20个主要色谱峰和共有峰，它们在全部 22个样品中至少19个或以上样品中出现，在至少3个或以上的样品中峰面积占总面积的 5%。经统计，对于根皮药材20个共有峰的面积总和占总面积的51. 8 77. 2% (其中样品 M占32.3%，是由于指纹图谱中10分钟以内出的不纯的2个色谱峰面积达到37%)，而对 于木质部药材，20个共有峰总面积的29. 4 - 56. 8%，是由于木质部含量高的成分较少，使得 共有峰面积占总面积比下降。其中7个对照品色谱峰是所有样品的共有峰，而且在大多数 样品中含量较高，为主要色谱峰，仅样品98号的根皮的雷公藤吉碱相对含量很低，较难以 辨认。雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分，也是目前较常用于雷公藤药材质量控制的 指标成分，而且也是雷公藤中相对含量较为稳定的成分，故选择雷公藤甲素(峰2)为参考峰(S)，以其相对保留时间为1、相对峰面积为1，对所有指纹色谱图中各共有峰进行相对保留 时间(RtR)及相对峰面积αΑ)的计算(见表2 4)，所有色谱指纹
权利要求
1.一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征在于采用高效液相 色谱法进行含量测定，以乙腈-水溶剂为流动相进行梯度洗脱，乙腈的体积分数为阳-65%， 洗脱时间为155-165 min，流速为0.70-0. 80 mL/min，二极管阵列检测器设定扫描波长为 220-230 nm，柱温为 M-26 °C，进样量为 18-22 μ 。
2.如权利要求1所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征 在于乙腈的体积分数为60-63 %，洗脱时间为160-163 min，流速为0. 70-0. 80 mL/min。
3.如权利要求1所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征 在于二极管阵列检测器设定扫描波长为225-228 nm。
4.如权利要求1所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特征 在于柱温为25 0C。
5..如权利要求1所述的一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，其特 征在于进样量为19-20 μ 。
全文摘要
一种同时测定雷公藤药材中多个活性成分含量的方法，属于生物工程技术领域。其特征在于采用高效液相色谱法进行含量测定，以乙腈-水溶剂为流动相进行梯度洗脱，乙腈的体积分数为55-65%，洗脱时间为155-165min，流速为0.70-0.80mL/min，二极管阵列检测器设定扫描波长为220-230nm，柱温为24-26℃，进样量为18-22μL。可同时测定雷公藤药材中多个活性成分，其精确度高，稳定性好，解决了目前药材质量评价不能全面地反映药材质量的问题，为科学评价和有效控制雷公藤药材的内在质量提供可靠方法，为最终实现雷公藤药材质量的稳定可控奠定基础。
文档编号A61K36/37GK102048795SQ201010606278
公开日2011年5月11日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者斯金平, 郭宝林, 黄文华 申请人:浙江农林大学