专利名称：含有叶黄素的组合物在改善记忆的某些方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有叶黄素和/或玉米黄质的新颖的营养药物组合物或食品组合物，其用于改善某些选择性记忆功能，例如联想学习、联想记忆、压力下的学习和记忆、以及空间(方位)学习。
背景技术：
人们对可用于改善老年人和年轻人的学习、记忆和警觉性的营养药物组合物的开发越来越感兴趣。叶黄素已被描述为具有改善认知能力下降的能力。参见例如 US2006/0205826 (Romero等人)，其中提出，由于叶黄素充当抗氧化剂，所以其可以保护糖尿病小鼠的海马体。WO 2006/116755 (Trustees of Tufts College)报道了在长期治疗(4 个月)后二十二碳六烯酸(DHA)对叶黄素吸收及转运至脑部的协同效应。这种组合可用于预防或治疗认知功能障碍或痴呆，用于预防如通过语言流畅性、词汇表和MIR(现实记忆)Apartment 测试所测的记忆丧失。叶黄素的单独施用仅使得语言流畅性测试明显改善，没有使得所实施的其他认知能力测试或情绪评估测试中的任意一项得到改善。对于类胡萝卜素或作为潜在的认知增强剂的其他天然产物的大部分研究涉及防止已经至少具有痴呆的第一阶段(例如短期记忆障碍)或更后阶段(例如阿尔茨海默病 Alzheimer' s Disease)的人的认知功能降低。有关叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合在增强健康人群的记忆的一些选择性方面的能力知道的很少。
发明内容
业已发现，根据本发明，不管是作为唯一的活性成分施用还是与玉米黄质组合施用的叶黄素都可以促进记忆的某些方面，例如联想学习和记忆、压力下的学习和记忆、以及空间学习和记忆。因而，本发明的一个方面是一种增强健康个体的记忆的方面的方法，其中所述记忆的方面选自由联想记忆、空间记忆和压力下的记忆组成的组，所述方法包括施用由a)有效量的叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合和b)适当的载体组成的组合物；以及观察增强的联想记忆、空间记忆或压力下的记忆。本发明的另一方面是一种增强压力下的学习和记忆的方法，所述方法包括施用由a)增强与压力有关的学习和记忆的有效量的叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合和b)适当的载体组成的组合物；以及观察增强的压力下的学习和记忆。本发明的另一方面是一种增强空间学习和记忆的方法，所述方法包括施用由a)增强与空间有关的学习和记忆的有效量的叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合和b)适当的载体组成的组合物；以及观察增强的空间学习和记忆。本发明的另一方面是叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合作为唯一的活性化合物在增强a)联想学习和记忆、b)压力下的学习和记忆、或c)空间学习和记忆中的用途。本发明的另一方面是叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合作为唯一的活性化合物(在增强记忆方面是活性的)在制备用于增强a)联想学习和记忆、b)压力下的学习和记忆和/或c) 空间学习和记忆的营养药物或功能性食品中的用途。本发明的另一方面是由期望增强其联想学习或记忆、其在压力下的学习或记忆、 或其空间学习或记忆的人使用的试剂盒。该试剂盒包含叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合的剂型以及任选的使用说明。此外任选地，可以存在其他活性成分的单独剂型。
图I是说明叶黄素在谷氨酸神经毒性模式中的神经保护作用的图表。图2是IntelliCage及其功能特征的示意图。图3示出了位置错误率(访问错误角落的百分比)。从模块的开始观察该效应并在第一个12小时(活跃期)中保持观察，结果证明，用叶黄素处治产生较高的注意力水平和改善的记忆表现。图4示出了侧面错误率(在正确角落的错误侧面上探鼻的百分比)。与赋形剂对照组相比，叶黄素产生明显较低的百分比错误率。图5示出了与对照组的小鼠的相比用叶黄素处治的小鼠在有压力的条件下解决寻找获取水的正确位置的任务时表现明显较好。图6示出了向动物饲料中补充叶黄素使得小鼠通过使用空间提示来学习寻找并记住水的位置的能力显著改善。定义叶黄素表示任何可摄取形式的叶黄素，例如植物提取物或油性树脂 (oleoresin)。其包括全-E和Z异构体。优选的是FloraGLO Lutein,这是一种包含约98% 的叶黄素(全-E和Z异构体)和约2%的其他类胡萝卜素(其中约O. 5-1. 5%的玉米黄质)的金盏花(Marigold)提取物。叶黄素可以作为在各种油(红花油、玉米油)中的悬浮液使用，或者可以被配制成生物利用度高的珠粒形式，例如Actilease FloraGLO Lutein。玉米黄质表示玉米黄质和/或其异构体，包括全-E和Z异构体以及SS’、SR(内消旋玉米黄质)和RR’立体异构体。玉米黄质可以作为在各种油(红花油、玉米油)中的悬浮液使用，或者可以被配制成生物利用度高的珠粒形式，例如Actilease formulated Optisharp ο玉米黄质表示玉米黄质和/或通常所用的玉米黄质的衍生物(例如内消旋玉米黄质)。“改善/增强联想学习”表示在训练环境下学习信号、符号、规则的意义以及如何对刺激作出反应的能力得到改善。“改善/增强压力下的学习”表示当新任务发生在压力条件(例如作为日常生活 /工作压力的一部分所经历的压力条件)下时，受试者学习新本领或新信息的能力得到改業
口 O“改善/增强压力下的记忆”表示当经历有压力的环境或日常生活时，受试者回忆信息的能力得到改善。一个实例是在考试情况下回忆答案。“改善/增强空间学习或记忆”表示受试者学习目标相对于环境的其他部分在何处的能力得到增强。例如，一个人可能更容易地学会购物中心周围的路。另一个实例是一个人能更好地记住其停车或放钥匙的位置。“唯一的增强学习的化合物”表示该组合物中不包含有助于认知的其他成分。具体排除的成分的实例包括银杏(提取物或单独的活性成分)、乙酰左旋肉碱、维生素C和 E、维生素B、胞磷胆碱、CoQlO (辅酶-Q10)、人参、石杉碱甲Α、Ω -3脂肪酸(例如DHA/EPA)、 磷脂酰丝氨酸、松树树皮提取物(Pycnogenol碧萝]E )或Bacopa monieri植物提取物。“观察”增强的认知方面能力表示观察者注意到受试者有改善或受试者本身注意到其有改善。这些改善可以通过使用标准化的测量方法来量化，但不需要这样做，可以仅根据主观感受或经验。“处治”包括共处治和预防。“预防”并不限于未来完全不存在这些症状，而是意指包括减少个体或群体表现症状的风险，减轻与特定病症有关的症状，减少特定病症的发病时间，减轻病症的严重性，减少无症状的个体在未来显示出病症的可能性。为了实现这些改善，建议连续几天施用(例如至少6天或10天)，通常优选在数周内每天施用。在优选的实施方式中，叶黄素或叶黄素和玉米黄质被健康的受试者摄取。“健康的”表示受试者没有遭受任何危害其心理健康的病症的影响，即，没有遭受特征为记忆恶化 (例如痴呆、阿尔茨海默病等)、抑郁的病症或影响记忆和学习的其他精神病症(例如精神分裂症)的影响。因而，本发明的另一方面将涉及叶黄素或叶黄素和玉米黄质在改善联想记忆中的用途。本发明的另一方面将涉及叶黄素或叶黄素和玉米黄质在改善受试者处于压力下时的记忆的用途。具有改善的处于压力下的记忆的受试者将观察到下列中的至少一项 在工作中不会忘记执行分配的任务(当几项任务待解决时)； 在演讲中记住事实等； 在考试条件或需要快速回忆的条件下表现更好。本发明的另一方面将涉及叶黄素或叶黄素和玉米黄质在改善空间记忆中的用途。 具有改善的空间记忆的受试者将观察到下列中的至少一项 较少“放错的”项，例如某人的钥匙、眼镜、移动电话或电视遥控器； 在周围环境(例如在房子里)中和驾驶时容易确定自己的方向的能力，或者能够简单地记住某人将汽车停放在大的停车场的何处。除了可用于人类之外，本发明的组合物在兽医界具有额外的用途。动物将受益的状况具体为特定目的的训练过程和培养，例如对于猎犬、导盲犬、警犬、或电影业中所用的动物。可以从增强的认知功能中受益的动物包括那些经受压力条件的动物。这些条件出现在例如捕获或运输之后，或者可能是由于居住条件(例如住所或主人的改变)，当动物产生类似的失调或变得痛苦或具有攻击性时，或者表现出刻板行为(stereotypic behaviou)、或焦虑和强迫行为时。经受压力的动物也包括那些赛跑的动物(例如狗、马、骆驼)或各种运动中所用的动物、表演动物(例如马戏团的动物以及舞台、电视或电影中出现的那些动物)和表演盛装舞步和其他高度纪律性成套动作的马。优选的“动物”是宠物或伴侣动物(companion animals)以及农场动物。宠物的例子为狗、猫、鸟、观赏鱼、豚鼠(guinea pigs)、(长腿)兔((jack) rabbit)、野兔和雪貂、 农场动物的例子为水产养殖的鱼、猪、马、反刍动物(牛、绵羊和山羊)和家禽。营养药物的用途/制剂/剂暈在本文中使用时，术语“营养药物”表示在营养和医药应用领域均可用。因而，新颖的营养药物组合物可用作食品/饲料和饮料的补充物，和可以作为肠内或肠胃外应用的药物制剂，其可以为固体制剂，例如胶囊或药片，或者为液体制剂，例如溶液或悬浮液。根据本发明的营养药物组合物可以进一步包含保护性水胶体(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘结剂、成膜剂、成胶囊剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、 表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、腊、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填料、复合物(co-compound)、 分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动改性剂、掩味剂、增重剂、凝结剂(jeI Iyfying agent)、凝胶剂、抗氧化剂和抗微生物剂。此外，多维生素和矿物质补充剂可以被添加到本发明的营养药物组合物中以得到足够量的某些膳食中缺少的必需营养。多维生素和矿物质补充剂还可以用于疾病预防和保护免受因生活方式而导致的营养损失和缺乏的影响。根据本发明的营养药物组合物可以是含有常规载体材料的、适于施用至身体的任何盖仑形式(galenic form)，特别是常用于口服施用的任何形式，例如固体形式，诸如食品或饲料(用于食品或饲料的添加剂/或补充剂)、食品或饲料预混料、强化食品或饲料、药片、药丸、颗粒、糖衣丸、胶囊和泡腾片剂型(例如粉末和片剂)；或者液体形式，例如溶液、 乳液或悬浮液，诸如饮料、糊和油悬浮液。所述糊可以包在硬壳或软壳胶囊中，其中该胶囊具有例如(鱼、猪、家禽、奶牛)明胶、植物蛋白或木素磺酸盐的基质。其他应用形式的例子是用于经皮施用、肠胃外施用或注射施用的那些。膳食和药物组合物可以是受控(延缓) 释放制剂的形式。食品的例子为乳制品，包括例如人造奶油、涂抹酱(spread)、黄油、芝士、酸奶或奶饮料。强化食品的例子为面包、谷物棒、烘烤食品(例如蛋糕和曲奇饼干)以及薯条或油炸马铃薯片。宠物食品的例子为湿的罐头食品、零食和压缩饲料(pellets)。饮料包括非酒精饮料和酒精性饮料以及添加到饮用水和液体食品中的液体制剂。 非酒精饮料为例如软饮料、运动饮料、果汁、柠檬饮料、茶和奶饮料。液体食品为例如汤和乳制品。含有叶黄素或叶黄素和玉米黄质的营养药物组合物可以被添加到软饮料、能量棒或糖果中，从而使成年人消耗每天每kg体重至多2mg。如果营养药物组合物是药物制剂，该组合物进一步包含药物可接受的赋形剂、稀释剂或佐剂。其配制可以使用标准技术，如例如Remington' sPharmaceutical Sciences, 20th edition Williams&Wilkins,PA,USA中公开的。对于口服施用来说,优选使用药片和胶囊，其含有适当的粘结剂(例如明胶或聚乙烯基吡咯烷酮)、适当的填料(例如乳糖或淀粉)、适当的润滑剂(例如硬脂酸镁)以及任选的其他添加剂。为了本发明的目的，对于动物(包括人类)来说，叶黄素或叶黄素和玉米黄质的合适的每日剂量可以在每天每kg体重0. 15mg到约每天每kg体重IOmg的范围内。下面所示的非限制性实施例将更好地说明本发明。实施例I
_0] 叶黄素在体外神经毒性模型中的作用谷氨酸是中枢神经系统中一种主要的兴奋性氨基酸，并且在正常的生理机能中起到关键作用。谷氨酸功能的正常调节机制中的扰动可能导致大脑中的谷氨酸受体过度的神经毒性活化，这可能不利于正常脑和老化的脑中的学习和记忆表现。使用神经元的原代培养物，可以通过谷氨酸中毒再现这些状态。对培养的神经元的影响通过神经元的神经丝细胞骨架网络的形态变化来示明。单一化合物或化合物的组合的神经保护作用通过使用特异于成熟神经元神经突的抗神经丝抗体(重链200kD)标记来分析网络密度而评估。利鲁唑(Riluzole，一种药物神经保护剂)和MK801被用作抵消谷氨酸的神经毒性作用(导致神经突过生长)的抑制化合物。抑制性的MK801(对NMDA型谷氨酸受体完全阻滞)很有效，导致中毒之后的100%恢复。使用下面所示的时间安排来测试叶黄素的神经保护功能
第0天细胞播种第I天添加介质第2天更换介质第5天更换介质并添加化合物第7天更换介质并添加化合物第9天更换介质并添加化合物第12天谷氨酸中毒第12天+6小时分析在第5天，用对照的培养介质或含叶黄素的介质(在生理范围中的3个浓度，每个浓度下n = 6)来替换培养介质。每2-3天更换一半的介质。在第12天，用250 PM的谷氨酸使细胞中毒6小时。对照培养物(谷氨酸中毒且没有任何附加的化合物)的神经突长度被设定为 100%。这些实验表明，用叶黄素预处治(所有使用的浓度，P <0.05且<0.01)明显保护了神经元，使其免受兴奋毒性的谷氨酸神经毒性(参见图I)。实施例2叶黄素和/玉米黄质在新的、完全自动的、啮齿动物学习和记忆的模型中的作用
在IntelliCage 中，用叶黄素和/或玉米黄质处治的小鼠的认知表现与用赋形剂处治的、年龄相当的对照组相比较，所述IntelliCage 是一个能在与笼屋(homecage) 类似的环境下自动监测小鼠的自发的学习行为的系统(NewBehavior AG, Ziirich, Switzerland, www. newbehavior. com ；Galsworthy et al. 2005, Behav Brain Res 157 211-217 ；Onishchenko et al. 2007, Toxicol Sci97 :428-437 ；Mechan et al. 2009， J. Neurosci. Methods, 180 :43-51)。各小鼠通过IntelliCage角落内的传感器读取转发器 (参考识别标签)来识别，其中，所述转发器植入小鼠的颈部的颈背中。每个IntelliCage 基本上是一个大的笼子(37. 5X55X20. 5cm)，其中放置了包含四个记录(操作)室的金属框。记录室安放在笼子的四个角落中，每一个均占据 15x15x21cm的直角三角形的占地面积。笼中天线能自动监测每一只老鼠的角落访问；每一个角落内的照片光束能自动记录每一次探鼻和水瓶喷头舔舐。4个三角形的老鼠躲避处被放置在笼子的中间，其上有食物漏斗，使小鼠能随意获取食物。每一个记录室均包括(I) 一个塑料环(内径为30mm),其充当进入记录室的入口并容纳登记角落访问的环形天线；(2)格子地板，小鼠一旦进入记录室内便坐在其上；(3) 两个圆形开口(直径为13_)，其能接近水瓶喷头；各开口均被登记探鼻的照片光束横穿；
(4)两个监测门，其允许(门打开)或禁止(门关闭)接近水瓶喷头；(5)两个水瓶；(6)管子，通过该管子可以输送空气喷气作为厌恶性刺激；(7)不同颜色的发光二极管，其可用于条件反射实验(Mechan 等人，2009 J Neurosci Methods 180 :43-51) 参见图 2。实验阶段:本研究包括两个测试组(每一个组n = 12-14):赋形剂(对照)、叶黄素(9mg/kg Bff) ( BP FloraGLO Lutein，包含约98%的叶黄素(全-E和Z异构体)和约2%的其他类胡萝卜素(其中约0.5-1. 5%的玉米黄质)的金盏花提取物)。叶黄素包含在正常的动物饲料中。在IntelliCage研究之前的12天以及贯穿4 周的研究期间将测试物质或空白对照剂以饲料(50mg/kg饲料)施用给所有的小鼠。在最初的适应阶段(9天)，小鼠能自由接近所有的角落、水和饲料，并且能自由地探索笼子。随后，小鼠必须学习使用探鼻(探鼻适应模块，2天)；所有的门最初都是关闭的 (禁止接近水)，小鼠为了打开门并够到水瓶喷头必须执行探鼻。所采集的数据包括几个参数，例如每个个体小鼠最不偏好的角落，其被记下用于编程下一个模块。在探鼻适应之后，执行下列任务-侧面辨别力模式联想学习和记忆以及记忆和注意力的测试；-联想记忆模式利用负强化(压力)的联想学习和记忆的测试；-方位学习模式空间学习和记忆以及方向性的测试。侧面辨别力模式该模块被设计用于测试注意力和联想记忆。为每只老鼠指定一个正确的角落。在该角落中只有一个侧面(两个侧面中的一个)被指定为正确的，并通过绿色LED向动物指示。动物可以在正确的侧面上探鼻，随后从水瓶中喝水。在该模块中，记录位置错误率(访问错误角落的百分比)和侧面错误率(在正确角落的错误侧面上探鼻的百分比)。这些数据表明，用叶黄素长期处治之后，注意力得到改善，因为在测试活跃期期间，其位置错误率(图3)和侧面错误率(图4)明显低于赋形剂对照组。
概括地说，自动IntelliCage 研究的结果表明，与用赋形剂处治的同窝出生者相比，用叶黄素处治使得小鼠为了获得水而将短时间(2秒)存在的光信号与正确角落和正确的角落侧面联系在一起的学习和记忆得到明显改善。联想记忆樽式在该模块中，为每只老鼠指定一个正确的角落，并通过3秒的灯光显示来指示。因而，在正确角落的探鼻将打开门，小鼠在该特定的角落中能够获得水，而每一次访问任何错误的角落均将导致空气喷气的惩罚(压力)。结果显示在图5中，表明与用赋形剂处治的同窝出生者相比，用叶黄素处治的小鼠学习和记忆得到水(因而避免惩罚)的位置的表现明显较好。方位学习樽式在这个学习任务中，小鼠必须进入正确的角落，并且为了得到水必须在角落的任一侧面上进行探鼻。根据之前的探鼻适应模块中动物的访问行为来指定角落，如果合适的话，最不偏好的角落被指定为各老鼠的正确角落。不提供额外的信号(例如灯光)，从而指导小鼠基于其环境和/或笼子的空间提示来尝试学习并记住能获取水的角落的位置。图6 总结出，该测试的结果表明，与用空白对照剂喂养的同窝出生者相比，用叶黄素处治的小鼠的表现明显较好。概括地说，自动IntelliCage 研究的结果证实，与用赋形剂处治的同窝出生者相比，用叶黄素处治数周使得小鼠各种学习和记忆得到明显改善。在第二组实验中，在上述学习和记忆模式中测试不同剂量的叶黄素(8mg/kg/d、 16mg/kg/d和30mg/kg/d)或叶黄素与玉米黄质的组合(分别为15和16mg/kg/d)。与对照组相比，用中间的叶黄素剂量补充的动物在联想记忆任务中在位置错误率和侧面错误率方面的表现显示出明显的改善。此外，用叶黄素和玉米黄质喂养的动物在侧面错误率方面的表现更优异。在比第一组实验的动物小2-3个月的动物中进行这些实验，结果表明，根据所使用的年龄和认知模式，叶黄素的有利效果可能不同。实施例3软明胶胶囊的制备可以制备包含下列成分的软明胶胶囊
权利要求
1.一种增强健康个体的记忆方面的方法，其中所述记忆方面选自由下列组成的组联想记忆、空间记忆和压力下的记忆，所述方法包括施用由a)有效量的叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合和b)适当的载体组成的组合物；以及观察所述增强的联想记忆、空间记忆或压力下的记忆。
2.一种增强压力下的学习和记忆的方法，所述方法包括施用由a)增强与压力有关的学习和记忆的有效量的叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合和b)适当的载体组成的组合物；以及观察所述增强的压力下的学习和记忆。
3.一种增强空间学习和记忆的方法，所述方法包括施用由a)增强与空间有关的学习和记忆的有效量的叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合和b)适当的载体组成的组合物；以及观察所述增强的空间学习和记忆。
4.叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合作为唯一的活性化合物用于增强a)联想学习和记忆、b)压力下的学习和记忆、或c)空间学习和记忆中的用途。
5.叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合作为对于增强记忆起作用的唯一的活性化合物在制备用于增强a)联想学习和记忆、b)压力下的学习和记忆和/或c)空间学习和记忆的营养药物或功能性食品中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种增强健康个体的记忆方面的方法，其中所述记忆方面选自由下列组成的组联想记忆、空间记忆和压力下的记忆，所述方法包括将由a)有效量的叶黄素或叶黄素与玉米黄质的组合和b)适当的载体组成的组合物给药；并且观察增强的联想记忆、空间记忆或压力下的记忆。
文档编号A61K31/07GK102612364SQ201080050833
公开日2012年7月25日 申请日期2010年11月5日 优先权日2009年11月9日
发明者哈桑·莫哈杰瑞, 安尼斯·奥利维亚·麦尼-莫肯, 瑞吉娜·格拉洁克 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司