专利名称：氟维司群在制备抗微管类化疗药物耐药逆转剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及氟维司群在制备抗微管类化疗药物耐药逆转剂中的新用途。 背景技术：
恶性肿瘤是目前包括中国在内的世界上许多国家最主要的致死原因之一(CA Cancer J Clin. 2005,55 :74-108.)。世界卫生组织(WHO)在美国亚特兰大召开的2008年国际肿瘤学年会上提出警告，到2010年癌症将取代心血管病成为世界死亡人数最多的疾病。 我国卫生部统计资料显示，我国每年新增肿瘤患者160 170万，现有肿瘤患者总数约450 万，居致死疾病的首位，而乳腺癌也成为当今女性健康的第一 “杀手”。微管参与有丝分裂过程。它是由两种微管蛋白(α亚基和β亚基)紧密连接形成异源二聚体。正常情况下，微管和微管蛋白异源二聚体之间存在动态平衡，其平衡与有丝分裂和细胞增殖相关，而平衡的方向受到多种因素调控。抗微管类化疗药物主要包括紫杉醇、泰素帝、长春碱和长春新碱等，其中，紫杉醇是一种来源于红豆杉树皮内的新型抗微管类化疗药物，紫杉醇可促进微管蛋白形成微管，抑制微管的解聚，促进微管双聚体形成、阻止其多聚化，导致纺锤体异常并抑制有丝分裂而使细胞阻滞于&/Μ期，进而诱导细胞凋亡。 另一类抗微管类化疗药物如长春类生物碱，能在受体部位与纺锤微小管蛋白的结合，形成高度规则的结晶体从而影响微管蛋白装配，使细胞阻滞于(VM期。目前，抗微管类药物被广泛应用于治愈性和姑息性化疗方案治疗乳腺癌。但是，在临床治疗过程中，恶性肿瘤获得对抗微管类化疗药物的耐药性导致最终治疗失败。Fulvestrant (氟维司群)是一种新型的
雌激素受体调节剂，其结构式如下(7a，17b)，4，5，5，5-五氟戊亚磺酰基)壬烷基]-雌甾 _1，3，5_(10)-三烯-3，17-二醇目前发现，氟维司群只有雌激素受体的拮抗作用而没有激动作用，能更有效降低乳腺癌细胞的ER水平，其作用效果好于他莫昔酚，但副作用少，且与其它雌激素受体调节剂少有交叉耐药。2003年美国FDA批准氟维司群应用于激素受体阳性的绝经后晚期乳腺癌，其在内分泌治疗中有着广泛的应用前景。但未有文献公开表明氟维司群在逆转乳腺癌多药耐药中有任何应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供新型雌激素受体氟维司群作为乳腺癌抗微管类化疗药物耐药逆转剂的应用。本发明采用的技术方案是氟维司群在制备抗微管类化疗药物耐药逆转剂中的应用。具体的，氟维司群可用于制备乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药逆转剂，可与化疗药物联合治疗雌激素受体阳性或阴性的耐药乳腺癌患者。具体的，氟维司群可用于制备下列之一的抗微管类化疗药物的耐药逆转剂紫杉醇，多西紫杉醇，长春瑞滨。氟维司群在制备乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药逆转剂药中的应用，具体表现在氟维司群逆转乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药不依赖于雌激素受体表达与否，也不依赖于抑制P-糖蛋白的功能与否。氟维司群与抗肿瘤药物同时使用可促进肿瘤药物诱导雌激素受体阴性的乳腺癌耐药细胞凋亡。进一步分析发现氟维司群与抗肿瘤药物同时使用可既能促进肿瘤药物诱导P-糖蛋白阳性乳腺癌耐药细胞凋亡，也能促进肿瘤药物诱导P-糖蛋白阴性的乳腺癌耐药细胞凋亡。本发明的有益效果如下1)氟维司维已被批准用于临床使用，且具有副作用少， 患者耐受好，与其它雌激素受体调节剂或化疗药物少有交叉耐药等优势，与临床乳腺癌治疗常用化疗药物如紫杉醇，阿霉素，长春瑞滨等联合用药具有临床可操作性。2、临床上，氟维司群主要针对雌激素阳性乳腺癌患者进行内分泌治疗。本发明证实氟维司群与化疗药物联合用药不仅可以针对雌激素阳性耐药乳腺癌治疗，也可以针对雌激素阴性耐药乳腺癌治疗。幻肿瘤耐药类型有多种，依据肿瘤耐药标志物之一 P-糖蛋白的表达与否，可分为P-糖蛋白依赖型耐药和非P-糖蛋白依赖型耐药。本发明证实氟维司群与化疗药物联合用药不仅可以逆转P-糖蛋白阳性乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药，也可以逆转P-糖蛋白阳性乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药。因此，氟维司群作为抗微管类化疗药物耐药逆转剂用于治疗耐药乳腺癌具有很好的临床应用前景。
图 1 为 BCap37，Bats-72 和 Bads_200P-糖蛋白和 ER-α 表达检测；图2为Bats-72和Bads-200的耐药性检测(以紫杉醇为例)；图3为氟维司群对Bats-72和Bads-200细胞毒性检测；图4为氟维司群逆转Bats-72和Bads-200细胞对紫杉醇的耐受；图5为氟维司群促进紫杉醇损伤Bats-72和Bads-200细胞；图6为氟维司群逆转Bats-72和Bads-200细胞对多西紫杉醇(a)，长春瑞滨(b) 的耐受。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 :BCap37，Bats-72和Bads_200P-糖蛋白和ER- α表达检测(1)实验材料细胞株紫杉醇敏感细胞株BCap37 (购自中科院上海细胞库)，两种新型细胞株Bats-72 和 Bads-200(菌株编号为 CCTCC No :C201065 和 CCTCC No :C201066,已在在先申请 201010502654. 6中作为新细胞株保护)，P_gp阳性细胞株MCF7/ADR(购自中科院上海细胞库)，雌激素受体α阳性细胞株为MCF_7(购自中科院上海细胞库)；试剂耗材1640培养液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)，0. 25%胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清(上海依科赛生物制品有限公司)，PBS，Tween-20, IOOmm培养皿 (Corning)，蛋白裂解液(碧云天)、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所)，一抗 anti-P-gp (Santa Cruz, sc-55510),—抗 anti-ERa ,二抗(Santa Cruz, sc-2005), DAB T^1 剂盒(碧云天)，0. 45um PVDF膜。仪器细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。(2)实验方法各细胞接种于IOOmm培养皿，培养72小时，更换新鲜培养液，0.25%胰酶消化，收集细胞，分别加入0. 15 0. 3ml细胞裂解液，冰浴裂解30分钟，12000g离心30分钟，取上清。按BCA蛋白定量试剂盒操作说明进行蛋白浓度测定。配制7. 5%浓度分离胶，上样40ug 蛋白量，SDS-PAGE操作，100V，150分钟条件下，将蛋白转移至0.45um PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1小时，一抗4°C孵化过夜，二抗室温孵化3小时，按ECL试剂盒操作进行显影。(3)实验结果结果见图1，Bats-72与BCap37为Ρ-gp阴性，而Bads-200则高表达P_gp。没有检测到BCap37、Bats-72和Bads-200表达雌激素受体α。(4)结论Bats-72是非P_gp依赖耐药细胞株，而Bads-200是P_gp依赖的耐药细胞株。Bats-72和Bads-200都为雌激素受体α阴性。实施例2 :Bats-72和Bads-200耐药性检测(以紫杉醇为例)。(1)实验材料细胞株紫杉醇敏感细胞株BCap37，新型细胞株Bats-72和Bads-200试剂耗材1640培养液(杭州吉诺)，0. 25%胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清 (上海依科赛)，IOOmm培养皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO (上海国药)，MTT，紫杉醇。仪器细胞培养箱，超净工作台，血球细胞计数器，酶标仪。(2)实验方法BCap37和Bads-200接种于IOOmrn培养皿，培 养72小时，更换新鲜培养液，0. 25% 胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0. 2ml 单细胞悬液至96孔板，每总细胞数为4000个，培养过夜，加入紫杉醇处理，BCap37细胞处理浓度为 0、l、2、5、10、20、50、100、200、500nM。Bats-72 和 Bads200 细胞处理浓度为(0、5、 10、20、50、100、200、500、1000、2000、500011]\1紫杉醇处理 72h，去上清，加入 0. 2ml DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值。(3)实验结果结果见图2，紫杉醇对BCap37和Bads-200细胞的IC50分别为4，454. 4和4550nM， Bats-72和Bads-200的耐药系数分别为113. 7和1137. 5。(4)结论
相对于BCap37，Bats-72和Bads-200对紫杉醇耐受分别增强了 113. 7和1137. 5倍。实施例3 氟维司群对Bats-72和Bads-200细胞毒性检测。(1)实验材料细胞株新型细胞株Bats-72和Bads-200 ；试剂耗材1640培养液(杭州吉诺)，0. 25%胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清 (上海依科赛)，IOOmm培养皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO (上海国药)，MTT，紫杉仪器细胞培养箱，超净工作台，血球细胞计数器，酶标仪。(2)实验方法Bats-72和Bads-200接种于IOOmm培养皿，培养72，更换新鲜培养液，0. 25%胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0. 2ml单细胞悬液至96孔板，每总细胞数为4000个，培养过夜，加入氟维司群处理浓度梯度为0、10、 20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000nM。处理 72h，去上清，加入 0. 2ml DMS0，酶标仪570nM波长检测OD值。(3)实验结果结果见图3，氟维司群浓度低于IOOOOnM时，处理72h后，Bats-72和Bads-200的细胞存活率在80%以上。(4)结论氟维司群浓度低于IOOOOnM时，对Bats-72和Bads-200的细胞毒性很低。其中，当氟维司群浓度为5000nM时，处理72h后，Bats-72和Bads-200的细胞存活率在90%以上， 表明在此浓度下氟维司群对Bats-72和Bads-200的细胞几乎没有毒性。实施例4 氟维司群逆转Bats-72和Bads-200细胞对紫杉醇的耐受。(1)实验材料细胞株新型细胞株Bats-72和Bads-200试剂耗材1640培养液(杭州吉诺),0. 25%胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清 (上海依科赛)，IOOmm培养皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO (上海国药)，MTT，紫杉仪器细胞培养箱，超净工作台，血球细胞计数器，酶标仪。(2)实验方法Bats72和Bads-200接种于IOOmm培养皿，培养72小时，更换新鲜培养液，0. 25% 胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0. 2ml 单细胞悬液至96孔板，每总细胞数为4000个，培养过夜，对照组加PBS，实验组加入终浓度为5000nM的氟维司群预处理3小时，再加紫杉醇处理，紫杉醇的处理浓度梯度为0、5、10、 20、50、100、200、500、1000、2000nM。72 小时后，去上清，加入 0. 2ml DMS0，酶标仪 570nM 波长检测OD值。(3)实验结果结果见图4，对于Bats-72和Bads-200细胞，氟维司群实验组OD值较相应的对照组低。
(4)结论5000nM氟维司群可以逆转Bats-72和Bads-200细胞对紫杉醇的耐受。实施例5 氟维司群促进紫杉醇损伤Bats-72和Bads-200细胞(1)实验材料细胞株新型细胞株Bats-72和Bads-200 ；试剂耗材1640培养液(杭州吉诺)，超级新生牛血清(上海依科赛)，，35mm培养皿(Corning)仪器倒置显微镜，正置显微镜，细胞培养箱，超净工作台(2)实验方法Bats-72和Bads-200接种于35mm培养皿，培养48小时，分别以下实验组处理细胞对照组(CTL组)，氟维司群处理组(ICI)，紫杉醇处理组(PTX)和氟维司群处理组和紫杉醇共同处理组(ICI+PTX)。其中氟维司处理浓度为5000nM，Bats-72的紫杉醇处理浓度为200nM，Bads-200的紫杉醇处理浓度为2000nM。氟维司群处理3小时后，加入紫杉醇处理。48小时后更换新鲜培养液，倒置显微镜上观察，拍照。(3)实验结果结果见图5，对于Bats-72和Bads-200细胞，对照组和氟维司群处理组基本上没有飘浮的细胞或出现明显凋亡特征的细胞，紫杉醇处理组只有小量的细胞飘浮的细胞或出现明显凋亡特征，而氟维司群处理组和紫杉醇共同处理组则有大量细胞飘浮的细胞或出现明显凋亡特征。(4)结论5000nM氟维司群可促进紫杉醇损伤Bats-72和Bads-200细胞，增强紫杉醇诱导细
胞凋亡。实施例6 氟维司群逆转Bats-72和Bads-200细胞对其它常用化疗药物的耐受。(1)实验材料细胞株新型细胞株Bats-72和Bads-200。试剂耗材1640培养液(杭州吉诺),0. 25%胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清 (上海依科赛)，IOOmm培养皿(Corning)，％孔板(Corning)，DMSO(上海国药集团)，MTT， 多西紫杉醇，阿霉素，长春瑞滨和甲氨蝶呤。仪器细胞培养箱，超净工作台，血球细胞计数器，酶标仪。(2)实验方法Bats72和Bads-200接种于IOOmm培养皿，培养72小时，更换新鲜培养液，0. 25% 胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0. 2ml 单细胞悬液至96孔板，每总细胞数为4000个，培养过夜，对照组加PBS，实验组加入终浓度为5000nM的氟维司群预处理3小时，再加多西紫杉醇(DTX)，，长春瑞滨(VBN)处理。其中多西紫杉醇的处理浓度梯度为0、1、2、5、10、20、50、100、200、500nM ；长春瑞滨的处理浓度梯度为 0、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000nM ；72 小时后，去上清，加入 0. 2ml DMS0，酶标仪570nM波长检测OD值。(3)实验结果结果见图6，对于Bats-72和Bads-200细胞，氟维司群与多西紫杉醇，阿霉素，长春瑞滨共处理组OD值较相应的对照组低，而氟维司群与甲氨蝶呤共处理组OD值较相应的对照组变化非常的少。(4)结论5000nM氟维司群可以逆转Bats_72和Bads-200细胞对多西紫 杉醇，阿霉素，长春瑞滨的耐受，但不能逆转Bats-72细胞对甲氨蝶呤的耐受(Bads-200细胞相对于亲代细胞 BCap37不耐受甲氨蝶呤)。
权利要求
1.氟维司群在制备乳腺癌抗微管类化疗药物耐药逆转剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述氟维司群用于制备下列之一的化疗药物的多药耐药逆转剂紫杉醇，多西紫杉醇，长春瑞滨。
全文摘要
本发明提供了氟维司群在制备乳腺癌抗微管类化疗药物耐药逆转剂中的应用。氟维司群逆转乳腺癌细胞抗微管类化疗药物耐药不依赖于雌激素受体表达与否，也不依赖于抑制P-糖蛋白的功能与否。氟维司群与抗肿瘤药物同时使用可促进肿瘤药物诱导雌激素受体阴性的乳腺癌耐药细胞凋亡。氟维司维已被批准用于临床使用，且具有副作用少，患者耐受好，与其它雌激素受体调节剂或化疗药物少有交叉耐药等优势，与临床乳腺癌治疗常用化疗药物如紫杉醇，阿霉素，长春瑞滨等联合用药具有临床可操作性，作为抗微管类化疗药物耐药逆转剂用于治疗耐药乳腺癌具有很好的临床应用前景。
文档编号A61K31/337GK102151277SQ20111004757
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月28日 优先权日2010年12月16日
发明者范伟民, 蒋东海, 隋梅花 申请人:浙江大学