六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用的制作方法

专利名称：六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种中药组合物的应用，具体涉及ー种六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
背景技术：
六味地黄汤源于宋代医学家钱こ的《小儿药证直诀》，该方是由熟地黄、山茱萸(制)、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓共六味中药组成，是中医“滋补肾明”的基础方剂。其配方具有三补三泻的特点六味地黄汤重用熟地滋阴补肾，填精益髓，为君药。山茱萸补养肝肾，并能涩精，取肝肾同源之意，山药补益脾阴，亦能固肾，共为臣药。三药配合，肾肝脾三阴并ネト，是为三补，但熟地黄用量是山茱萸和山药之和，故仍以补肾为主。泽泻利湿而泄肾浊，并能减熟地黄之滋腻，茯苓淡渗脾湿，井助山药之健运，与泽泻共泻肾浊，助真阴得复其位，牡丹皮清泄虚热，并制山茱萸之温涩。三药称为三泻，均为佐药。六味合用，三补三泻，其中补药用量重于泻药，是以补为主，肝脾肾三阴并补，以补肾阴为主。该方被誉为补肾方药之祖，主要用于肾阴虚引起的腰膝酸软、头晕耳鸣、手脚心发热、遗精盗汗等症状。经过现代药理学研究表明，六味地黄汤具有改善肾功能、调节免疫、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、抗低温、耐缺氧、降血脂、降血压、降血糖和促进新陈代谢等作用。六味地黄制剂在中医临床中广泛应用，并获得了良好的治疗效果。但是目前该方在实际应用中存在明显不足，就是用药剂量大，用药不方便，因此，改进其制备エ艺就有其重要意义。据文献报道，六味地黄制剂中的脂溶性成分对糖尿病模型具有良好的降血糖作用參考文献韩璟超，季晖，薛城鋒，等.山茱萸总萜的降血糖作用.中国天然药物，2006，4
(2):125-129。专利申请号“200410058600. X”的专利中六味地黄制剂的制备方法考虑了六味地黄汤中多糖类和糖苷类有效成分，但在制备过程中忽略了六味地黄制剂中的脂溶性有效部位。专利申请号“200410062502. 3”的专利中六味地黄制剂的制备方法考虑到了多糖类成分和脂溶性成分，但该法仅是六味地黄处方中部分药采用了醇提取，并不是整体提取，丢失了部分脂溶性有效成分。文献报道，茯苓的活性多糖的分子量为3. 8X IO4左右參考文献陈春霞.羧甲基茯苓多糖的化学研究.中国食用菌，1994，(05):35，山药多糖分子量为4. 22X IO4左右參考文献熊平，蒋灵芝，余俊龙，等.山药多糖研究评述.中医药学刊，2003，(11):53，山茱萸多糖的分子量为2. 47X IO4左右參考文献杨云，刘翠平，王浴铭，等.山茱萸多糖的化学研究.中国中药杂志，1999，24 (10):615],丹皮降血糖的活性多糖的分子量为1.3X104左右參考文献陈彦，沈业寿，赵帜平，等.丹皮多糖PSM2b的纯化及其理化性质研究.激光生物学报，2004，13 (3):237-241，可见六味地黄活性多糖部位的分子量多集中在I万 5万之间。
发明内容本发明的目的是提供一种六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。本发明将克服现有技术忽略六味地黄汤总提取物脂溶性有效成分的不足，通过提取エ艺，得到六味地黄汤总提取物的更完备的组分构成，并使得采用这种组合物治疗治疗糖尿病肾病成为可能。本发明基于六味地黄汤的治疗新适应症和新靶点应激状态是ー种复杂的病理生理状态。其中，NADPH氧化酶的激活是最重要来源。六味地黄汤的“三补三泄”的药理作用，可能源于抑制NADPH氧化酶的激活，从而，可減少内质网应激分子，减轻无叠合蛋白质反应(Unfolded protein response, UPR)六味地黄汤治疗糖尿病肾病，由于抑制NADPH氧化酶。本发明所涉及的药物组合物是，一种六味地黄汤总提取物组合物，原料药由熟地黄、山茱萸(制)、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照10. 4 7. 6 :5. 2 2. 8 :5. 2 2. 8 :3. 9 2. I
3.9^2. I :3. 9^2. I的重量比组成，其特征在于，所述的组合物中包括有六味地黄汤总提取物挥发油3 -环糊精包合物组分，六味地黄汤总提取物多糖组分，味地黄汤总提取物糖苷 类组分，以及六味地黄汤总提取物脂溶性组分。上述原料药的优化比例是熟地黄、山茱萸(制)、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比组成。上述原料药中，所述的地黄、山茱萸及山药可以分别选择生品；也可分别选择制品(炮制品)。(I)水煎液的制备
将由熟地黄、山茱萸(制)、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3处方投料，水煎煮2次，同时回收挥发油，合并水煎液，水煎液浓缩至清膏，清膏的相对密度1. 10 I. 25(50°C)，药渣备用；
(2)挥发油￠-环糊精包合物组分的制备
采用3 -环糊精饱和水溶液法包合六味地黄汤总提取物的挥发油，将六味地黄汤总提取物的挥发油缓缓滴入3 -环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，冷藏(4°C)静置48小时后抽滤，40°C干燥，即得挥发油￠-环糊精包合物组分。(3)水煎液的こ醇沉淀
将步骤(I)中的清膏中加入こ醇并不断搅拌至こ醇浓度为70%，冷藏(4°C)静置48小时，分离得到上清液和沉淀；
(4)多糖组分的制备
将步骤(3)中的沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为I万的超滤膜过滤，除去相对分析量低于I万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量I万 5万分子量的物质，喷雾干燥得到多糖组分；
(5)糖苷类组分的制备
将步骤(3)中的上清液经大孔树脂柱层析，依次以水、20%、40%、65%こ醇的梯度洗脱，分别收集流分，合并40%和65%こ醇部分浓缩至无醇味，喷雾干燥得到糖苷类组分；
(6)脂溶性组分的制备
将步骤(I)中的药渣干燥后，加入こ醇回流提取2次，毎次I小时，滤过，合并滤液，滤液回收こ醇，浓缩至无醇味后，喷雾干燥得到脂溶性组分；(7)六味地黄汤总提取物的制备
将步骤(4)中多糖组分、步骤(5)中糖苷类组分、步骤(6)中脂溶性组分及步骤(2)中的挥发油3 -环糊精包合物组分混合，即得六味地黄汤总提取物组合物。以上组合物的进ー步限定，具有以下特征
(1).六味地黄汤总提取物组合物的红外图谱的特征峰IR(cm^1) :3396,2926,2855、1711、1615、1516、1453、1376、1203、1163、1078、1030、765、714、573 ;或者，
六味地黄汤总提取物组合物的ニ阶导数(Second Derivative,简称SD,下同)红外光谱的特征峰SD-IR (600 1800cm-1) : 1740、1710、1687、1606、1515、1467、1377、1316、1276、1204、1154、1077、1027、794、768、742、715 ；
(2).六味地黄汤提取物的多糖组分(部位A)的红外光谱的特征峰=IRH^r(cm1) 3400,2930、1718、1618、1417、1372、1238、1152、1079、1024、868、766、604、575、527 ;或者，
六味地黄汤提取物的多糖组分(部位A)的ニ阶导数红外光谱的特征峰SD-IR H^r(600 lSOOcnT1) :1731、1609、1561、1522、1506、1471、、1372、1230、1205、1153、1125、1106、1079、1056、1023、995、963、913、866、835、819、799、759、704、658、643、616、604 ；
(3).六味地黄汤提取物中糖苷类组分(部位B)的红外图谱的特征峰IR(cm-1)3398、2934、1709、1610、1533、1516、1450、1383、1278、1205、1073、1038、837、765、715、627 ；
或者，
六味地黄汤提取物中糖苷类组分(部位B)的ニ阶导数红外光谱的特征峰SD-IR ^(600 1800cm—1) : 1747、1715、1653、1631、1603、1534、1515、1490、1468、1451、1418、1396、1384、1349、1316、1280、1202、I176、II19、1098、1072、1038、1005、940、918、897、872、853、821、767、741、715；
(4).六味地黄汤提取物脂溶性组分(部位C)的红外图谱的特征峰IRV= (cm-1) 339U2928、1729、1668、1408、1385、1349、1226、1146、1075、920、868、817、777、629、590、422 ；或者，
六味地黄汤提取物脂溶性组分(部位C)的ニ阶导数红外光谱的特征峰SD-IR(600 lSOOcnT1) : 1736、1667、1609、1560、1523、1498、1457、1419、1384、1341、1315、1195、1150、1105、1079、1054、1026、977、962、917、891、865、817、799、779、700、673、661、631。以上所述的本组合物的图谱特征，是指同类组合物的图谱，其相似度不小于0. 85。换言之，以上组合物的图谱特征是
(1).六味地黄汤总提取物组合物的红外指纹图谱符合A，图8六味地黄汤提取物组合物的红外光谱图，其相似度不小于0. 85 ;或B，图9六味地黄汤提取物组合物的ニ阶导数红 外光谱 (2).六味地黄汤提取物的多糖组分的红外图谱符合:A，图2六味地黄汤提取物的多糖组分(部位A)的红外光谱图；或B，图3六味地黄汤提取物的多糖组分(部位A)的ニ阶导数红外光谱图；(3).六味地黄汤提取物中糖苷类组分的红外图谱符合:A，图4六味地黄汤提取物中糖苷类组分(部位B)的红外光谱图；或B，图5六味地黄汤提取物中糖苷类组分(部位B)的ニ阶导数红外光谱 (4).六味地黄汤提取物脂溶性组分的红外图谱符合:A，图6六味地黄汤提取物脂溶性组分(部位C)的红外光谱图；或B，图7六味地黄汤提取物脂溶性组分(部位C)的ニ阶导数红外光谱图。本发明通过对 传统的六味地黄汤进行科学的处理，在中医整体观理论的指导下，保持原六味地黄汤各药药效的基础上，増加了六味地黄中脂溶性的有效部位。如前文“背景技木”所述茯苓活性多糖的分子量为3. 8X IO4左右，山茱萸多糖的分子量为2. 47X IO4左右，牡丹皮降血糖的活性多糖的分子量为I. 3 X IO4左右，可见六味地黄活性多糖部位的分子量多集中在I万 5万之间；因此本方法采用超滤法提取精制了六味地黄I万 5万分子量的活性多糖类部位。本方法采用大孔树脂柱层析法提取精制了六味地黄中的糖苷类活性成分，大大降低了六味地黄汤的使用体积。本发明六味地黄汤提取物制备エ艺流程见图I。根据本发明六味地黄汤提取物的多糖组分(部位A)主要由I万 5万分子量多糖成分组成。根据本发明六味地黄汤提取物中糖苷类组分(部位B)主要由糖苷类成分組成。根据本发明六味地黄汤提取物脂溶性组分(部位C)主要由脂溶性成分組成。完成本申请发明任务的方案是上述六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗治疗糖尿病肾病药物中的应用。六味地黄汤的治疗新适应症和新靶点
六味地黄汤的应用十分广泛，销售量很大，与之相比较，对临床适应症和药理学的研究显得十分不足，主治不明，机制不清。临床大量使用与药理学研究与当代分子生物学和生物医学的研究脱节。因此，对它的药理作用认识，和对疾病的主治，作用主要靶点应予以深入研究。剧烈的应激性(体力性或精神性)常导致心脏功能突然恶化，血管功能损害，脑损害，短时间内会严重损害机体，危及生命。阻断急性严重的应激反应引起的心脑血管病变，是保障人民健康的重要措施。另外，中老年人群中，男性性功能低下的发病高，呈现增长趋势。在急性紧张的状态下，对睾丸的性激素生成会出现明显的抑制状态，血中性激素含量明显降低。提示对男性健康明显影响。尼日利亚军队报道，紧张的军事训练，能使男性士兵的血中睾酮的含量明显降低，证明过于繁重的军事训练，会损害睾丸的功能。应激状态是ー种复杂的病理生理状态。包含体内活性氧类(reactive oxygenspecies, R0S)的生成和释放量大大增加。体内氧自由基的生成有多种来源，其中，NADPH氧化酶的激活是最重要来源。六味地黄汤的“三补三泄”的药理作用，可能源于抑制NADPH氧化酶的激活，从而，可减少内质网应激分子，减轻无叠合蛋白质反应(Unfolded proteinresponse, UPR)；我们发现六味地黄汤治疗应激反应的多种并发症，主要在于抑制NADPH氧化酶的活性。近年来发现,无折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)增多的早期,它是补偿性反应，随着病情发展，内质网应激分子不断増加，细胞核转录生成的炎性物质和促炎性物质愈来愈多。最終细胞无 法克服，导致细胞死亡。蛋白质中肽链要进行-SH，-SH键的缩合，形成3度空间的立体构象，才获得生物活性。蛋白质的叠合反应对氧自由基十分敏感，过多氧自由基干扰蛋白质的叠合反应。应激反应通过激活NADPH氧化酶活性，使ROS生成急剧上升，诱发内质网应激，细胞遭受严重的伤害。六味地黄汤通过阻断NADPH氧化酶的激活，抑制内质网应激，使应激性病变明显缓解或完全抑制。六味地黄汤阻断NADPH氧化酶，就有可能制止严重应激性心、脑等损害的发生，或是明显缓解。六味地黄汤缓解应激性反应的心血管并发症、治疗糖尿病肾病，由于抑制NADPH氧化酶
NADPH氧化酶在病理条件下，成为生成ROS的主要来源。NADPH氧化酶的结构，可分为ニ大部分催化亚单位N0X2, N0X4,等,和调控亚单位p22phox,p47phox, p67phox,等。应激状态，以及糖尿病，NADPH氧化酶被高度激活，产生众多R0S，造成组织损害；应激性反应引起心肌病,血管病，肾病,睾丸病和脑病。NADPH氧化酶是六味地黄汤的主要的靶点，由NADPH氧化酶激活所介导的诸多疾病，六味地黄汤均可有效。NADPH氧化酶的激活，还会引起内质网应激(ER stress)。内质网功能之一，合成具有生物活性的蛋白质。如有较多ROS存在，蛋白质无法正常地叠合，或错误叠合，生成的蛋白质无活性。称之为无蛋白质置合反应(UPR)。此时，内质网和细胞核间的对话异常，生成大量ER stress的分子，如PERK，Bip，CHOP，等，促使大量生成炎症因子，或促炎症因子。引起细胞凋亡，细胞死亡，出现心血管病，脑病，肾病，睾丸病等。引起ER应激的主要机制，是由于NADPG氧化酶的激活。本发明，首次发现六味地黄汤对NADPH氧化酶的很强阻断作用，是它的药理作用基础，对抗应激性和糖尿病和它的并发症。本发明使用工具药选择性NADPH氧化酶阻断剂こ酰香草素(APO)作为阳性对照，APO只是在药理学研究中的ー种工具药，APO不是临床使用的药物。用它对比只是说明六味地黄汤制剂的药效是通过阻断NADPH氧化酶的机制。六味地黄汤制剂的作用于APO相仿，证明通过同一作用机制。这是首次证明六味地黄汤制剂所具有的作用和机制。因此，六味地黄汤制剂可抑制氧自由基产生的源头，以及可控制所有氧自由基损害所形成的病变。通过六味地黄汤的治疗，对很强的应激性反应中，抑制激活的NADPH氧化酶，对抗内质网应激，使器官的各项观察指标，均回到或接近正常的状态。六味地黄汤治疗糖尿病肾病损害
方法SD大鼠，清洁级。用硫脲霉素(STZ, streptozotocin, 65 mg/kg, ip) 一次注射。8周后，形成糖尿病并发症(早期)。使用六味地黄汤的新エ艺制剂。在后4周药物干预，给大剂量(LW-H，2.4mg/kg，po),中剂量(LW-M，I. 2mg/kg，po)，以及纯脂溶性提取物(LW-ST，相当于2. 4mg/kg, po)，与阳性药氨基胍(AMG，100mg/kg, po,双重阻断AGEsJPiNOS的药物，治疗糖尿病并发症的疗效很好)及APO (こ酰香草素80mg/kg，po。选择性NADPH氧化酶阻断剂)，做双重对照比较。治疗糖尿病肾病 1，改善肾功能
肾功能衰竭(尿毒症)约50%是由于糖尿病肾病。糖尿病肾病的发病糖尿病的病程长度有夫，进行性发展和恶化，可能与激活NADPH氧化酶，内质网应激和p66Shc基因有夫。我们发现六味地黄汤的制剂，能对抗糖尿病肾病组织中的上述靶点异常。參照图Il-A 图11-E，糖尿病大鼠的血清和尿中BUN和Cr均上升，24h尿中微量蛋白增多。六味地黄汤制剂和阳性药，均显著地缓解。N=10，X土SD; #P〈0.01，vs.normal; #P<0. 05, ##P<0. 01, vs. DM(糖尿病)。糖尿病8周大鼠，血中非蛋白氮(A)(BUN)和肌酐(B)(creatinine, Cr)上升24h的尿中BUN (C)和 Cr (D)也上升，微量蛋白(E)增加。显示肾功能明显低下。LW_H，Lff-ST使肾功能回到正常，LW-H优于JT; LW-M的药效稍差。AMG和APO均有效。2，纠正肾内生物靶点异常
參照图12-A 图12-H:糖尿病肾病的肾组织中，MMP-9 (A)(基质金属蛋白酶-9)和Cx43 (B)(细胞间缝隙连接蛋白)的mRNA下调；NADPH氧化酶的p22的mRNA (C)和蛋白(D)明显上调；体内控制氧化应激的重要基因p66Shc mRNA (E)和蛋白(F)上调显著；内质网应激分子PERK的蛋白上调(G)，和内皮素受体A的mRNA (H)上调。六味地黄汤制剂使明显缓解，与阳性药的效应相仿。


图I为本发明六味地黄汤提取物制备的エ艺流程 图2为六味地黄汤提取物的多糖组分(部位A)的红外光谱；
图3为六味地黄汤提取物的多糖组分(部位A)的ニ阶导数红外光谱；
图4为六味地黄汤提取物的糖苷类组分(部位B)的红外光谱；
图5为六味地黄汤提取物的糖苷类组分(部位B)的ニ阶导数红外光谱；
图6为六味地黄汤提取物的脂溶性组分(部位C)的红外光谱；
图7为六味地黄汤提取物的脂溶性组分(部位C)的ニ阶导数红外光谱；
图8为六味地黄汤提取物的红外光谱；
图9为六味地黄汤提取物的ニ阶导数红外光谱；
图10为10批次六味地黄汤提取物的红外光谱叠加图谱；
附图中的纵坐标是吸光度(A)。图11中的A、B、C、D、E图，分别表示糖尿病大鼠的血清和尿中BUN和Cr均上升，24h尿中微量蛋白增多。六味地黄汤制剂和阳性药，均显著地缓解。N=10，X土SD;**P〈0.01，vs. normal; #P<0. 05, ##P<0. 01, vs. DM(糖尿病)；
图12中的A、B、C、D、E、F、G、H图，分别表示糖尿病肾病的肾组织中，生物靶点明显异常，NADPH氧化酶激活，内质网应激分子上升，p66Shc上调。六味地黄汤制剂的治疗作用明显，是回到正常范围。N=IO, X土SD; **P〈0.01，vs. normal; #P<0. 05, ##P<0. 01, vs.DM(糖尿病)。
具体实施例方式实施例六味地黄汤提取物的制备
将六味地黄汤中熟地黄、山茱萸(制)、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3比例投料，加入10倍量水，浸泡3h，煎煮两次，同时回收挥发油，毎次30min，用纱布过滤，减压浓缩至清膏，清膏的相对密度为I. 10 I. 25 (50°C)，过滤后剰余的药渣备用；挥发油用无水こ醇溶解，3 -环糊精制成饱和水溶液，将挥发油こ醇溶液注入￠-环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，然后冷藏(4°C)静置48小时，过滤，加入少量石油醚(30 60°C)洗涤，40°C干燥，即得挥发油￠-环糊精包合物。清膏中加入こ醇并不断搅拌至こ醇的量为70% (V/V),将其置于冰箱4°C下冷藏48小时后，分离得到上清液和沉淀，沉淀用70%こ醇洗涤3次；沉淀除醇，沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为I万的超滤膜过滤，除去相对分析量低于I万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量I万 5万分子量的物质，喷雾干燥得到部位A。合井上清液减压浓缩至清膏，经过DlOl大孔树脂柱层析，按照每千克生药采用I. 5Kg的大孔树脂的比例上样，然后用水、20%こ醇、40%こ醇和65%こ醇依次洗脱，水和20%こ醇洗脱液弃去，合并40%こ醇和65%こ醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥得到部位B。药渣干燥后，加入5倍量こ醇回流提取2次，I小时/次，过滤，合并滤液，浓缩回收こ醇后，喷雾干燥得到部位C。合并A、B、C及挥发油环糊精包合物，得到六 味地黄汤总提取物。六味地黄汤提取物的红外测定
采用Perkin Elmer公司的FTIR傅里叶变换红外光谱仪，运用KBr压片法测定得到各有效部位的红外光谱图。各有效部位的红外光谱图采用Perkin Elmer公司Spectrum v6.0操作软件(平滑点数为13)得到各有效部位的ニ阶导数光谱图。通过采用红外光谱软件对10批六味地黄汤提取物的红外光谱扫描数据进行相似度计算处理，最終所得的10批六味地黄汤提取物的红外光谱叠加图谱如图，以六味地黄汤提取物(批号10111001)为參考，其余六味地黄汤提取物红外光谱图的相似度值见表，结果表明不同批次六味地黄汤提取物的相似度值均大于0. 85,表明该制备エ艺比较稳定。 六味地黄汤提取物红外光谱图的相似度表
批号I相似度
10111001I
101110020.9901
101110030.9843
101110040.9822
101110050.9784
101110060.9571
101110070.9426
101110080.9275
101110090. 9247
10111010]0. 8576
药理实验原料A
将(3)中上清液干燥得到药理实验原料A。药理实验原料B
将部位B和部位C以及挥发油合并得到药理实验原料B。六味地黄汤治疗糖尿病肾病损害
方法SD大鼠，清洁级。用硫脲霉素(STZ, streptozotocin, 65 mg/kg, ip) 一次注射。8周后，形成糖尿病并发症(早期)。使用六味地黄汤的新エ艺制剂。在后4周药物干预，给大剂量(LW-H，2.4mg/kg，po),中剂量(LW-M，I. 2mg/kg，po)，以及纯脂溶性提取物(LW-ST，相当于2. 4mg/kg, po)，与阳性药氨基胍(AMG，100mg/kg, po,双重阻断AGEsJPiNOS的药物，治疗糖尿病并发症的疗效很好)及APO (こ酰香草素80mg/kg，po。选择性NADPH氧化酶阻断剂)，做双重对照比较治疗糖尿病肾病。1，改善肾功能糖尿病8周大鼠，血中非蛋白氮(A)(BUN)和肌酐(B) (creatinine, Cr)上升24h的尿中BUN (C)和Cr (D)也上升，微量蛋白(E)增加。显示肾功能明显低下。LW-H，LW-ST使肾功能回到正常，LW-H优于JT; LW-M的药效稍差。AMG和APO均有效。2，纠正肾内生物靶点异常糖尿病肾病的肾组织中，MMP-9 (A)(基质金属蛋白酶-9)和Cx43 (B)(细胞间缝隙连接蛋白)的mRNA下调；NADPH氧化酶的p22的mRNA (C)和蛋白(D)明显上调；体内控制氧化应激的重要基因p66Shc mRNA (E)和蛋白(F)上调显著；内质网应激分子PERK的蛋白上调(G)，和内皮素受体A的mRNA (H)上调。六味地黄汤制剂使明显缓解，与阳性药的效应相仿。
权利要求
1.一种六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，其特征在于，大鼠实验中的用量为 中剂量组1. 2g/kg六味地黄汤的干浸膏；高剂量组2. 4g/kg六味地黄汤的干浸膏,分别相当于生药材7g/kg和14g/kg。
3.根据权利要求I所述的六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，其特征在于，所述的六味地黄汤总提取物组合物，其原料药由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照10. 4 7. 6 :5. 2 2. 8 :5. 2 2. 8 :3. 9 2. I :3. 9 2. I :3. 9 2. I的重量比组成，所述的组合物中包括有六味地黄汤总提取物挥发油3 -环糊精包合物组分，六味地黄汤总提取物多糖组分，六味地黄汤总提取物糖苷类组分，以及六味地黄汤总提取物脂溶性组分。
4.根据权利要求3所述的六味地黄汤总提取物组合物，其特征在于，原料药由熟地黄、制山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比组成。
5.根据权利要求3所述的六味地黄汤总提取物组合物，其特征在于，原料药中，所述的地黄、山茱萸及山药是分别选择生品；或是分别选择制品。
6.根据权利要求1-5之一所述的六味地黄汤总提取物组合物，其特征在于，所述的组合物是指通过以下方法制备得到的组合物 (1)水如液的制备 将由熟地黄、制山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3处方投料，水煎煮，同时回收挥发油，合井水煎液，水煎液浓缩至清膏，药渣备用； (2)挥发油P-环糊精包合物组分的制备 采用3 -环糊精饱和水溶液法包合六味地黄汤总提取物的挥发油，将六味地黄汤总提取物的挥发油缓缓滴入3 -环糊精饱和水溶液中并不断搅拌，冷藏静置后抽滤，干燥，即得挥发油P-环糊精包合物组分； (3)水煎液的こ醇沉淀 将步骤(I)中的清膏中加入こ醇并不断搅拌至こ醇重量比浓度为70%，冷藏静置，分离得到上清液和沉淀； (4)多糖组分的制备 将步骤(3)中的沉淀与水配成混悬液，离心，除去不溶物，采用截留分子量为5万的超滤膜过滤，弃去膜上液，除去相对分子量大于5万的大分子物质，膜下液再用截留分子量值为I万的超滤膜过滤，除去相对分析量低于I万的小分子物质，收集膜上液，浓缩得到相对分子量I万 5万分子量的物质，喷雾干燥得到多糖组分； (5)糖苷类组分的制备 将步骤(3)中的上清液经大孔树脂柱层析，依次以水、不同浓度的こ醇的梯度洗脱，分别收集流分，合并こ醇部分浓缩至无醇味，喷雾干燥得到糖苷类组分； (6)脂溶性组分的制备 将步骤(I)中的药渣干燥后，加入こ醇回流提取，滤过，滤液回收こ醇，浓缩至无醇味后，干燥得到脂溶性组分； (7)六味地黄汤总提取物的制备步骤(2)中的挥发油￠-环糊精包合物组分、步骤(5)中糖苷类组分及步骤(6)中脂溶性组分混合，按适当比例与步骤(4)中多糖组分混合制粒，干燥，压片或灌封胶囊，即得六味地黄汤总提取物组合物。
7.根据权利要求6所述的六味地黄汤总提取物组合物，其特征在干， 步骤(I)中，所述的水煎液是水煎煮2 3次；所述的水煎液浓缩至清膏，是浓缩至清膏50°C的相对密度1. 10 I. 25 ；、 步骤(2 )中，所述的冷藏，是指4 °C冷藏静置12 48小吋；所述的干燥，是在30 60°C干燥； 步骤(3)中，水煎液的こ醇沉淀所述的冷藏，是指4°C冷藏静置12 48小时； 步骤(5)中，所述的梯度洗脱中的固定相为制药上可接受的大孔树脂；梯度洗脱是依次以水、重量比浓度20%的こ醇洗脱，弃去洗脱液；用40% 75%的こ醇梯度洗脱，收集流分，合并洗脱液； 步骤(6)中，所述的こ醇回流提取，是指こ醇回流提取2次，毎次I小时，合并滤液，再回收こ醇,浓缩。
8.根据权利要求7所述的六味地黄汤总提取物组合物，其特征在于，所述的多糖组分由I万 5万分子量多糖成分组成。
9.根据权利要求8所述的六味地黄汤总提取物组合物，其特征在于，所述的组合物具有以下特征 (1).六味地黄汤总提取物组合物的红外光谱的特征峰IRHS" (cm^1) :3396,2926,、2855、1711、1615、1516、1453、1376、1203、1163、1078、1030、765、714、573 ;或者， 六味地黄汤总提取物组合物的ニ阶导数红外光谱的特征峰SD-IR (600 、1800cm—1) :1740、1710、1687、1606、1515、1467、1377、1316、1276、1204、I154、1077、1027、、794、768、742、715 ； (2).六味地黄汤提取物的多糖组分的红外光谱的特征峰IRV= (cm1) :3400、2930、、1718、1618、1417、1372、1238、1152、1079、1024、868、766、604、575、527 ;或者， 六味地黄汤提取物的多糖组分的ニ阶导数红外光谱的特征峰SD-IR H^r (600 、1800cm—1) :1731、1609、1561、1522、1506、1471、、1372、1230、1205、I153、1125、I106、1079、、1056、1023、995、963、913、866、835、819、799、759、704、658、643、616、604 ； (3).六味地黄汤提取物中糖苷类组分的红外图谱的特征峰=IRnSr(cnT1) :3398、2934、、1709、1610、1533、1516、1450、1383、1278、1205、1073、1038、837、765、715、627 ;或者， 六味地黄汤提取物中糖苷类组分的ニ阶导数红外光谱的特征峰SD-IR (600 、1800cm—1) : 1747、1715、1653、1631、1603、1534、1515、1490、1468、1451、1418、1396、1384、、1349、1316、1280、1202、1176、1119、1098、1072、1038、1005、940、918、897、872、853、821、、767、741、715 ； (4).六味地黄汤提取物脂溶性组分的红外图谱的特征峰IRH^r (cnT1) :3391、2928、、1729、1668、1408、1385、1349、1226、1146、1075、920、868、817、777、629、590、422 ;或者，六味地黄汤提取物脂溶性组分的ニ阶导数红外光谱的特征峰SD-IR (600 1800cm—1) :1736、1667、1609、1560、1523、1498、1457、1419、1384、1341、1315、I195、I150、1105、1079、1054、1026、977、96 2、917、891、865、817、799、779、700 、6 73、661、631。
全文摘要
六味地黄汤总提取物组合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。六味地黄汤总提取物组合物，原料药由熟地黄、制山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比组成，特征是组合物中包括有六味地黄汤总提取物挥发油β-环糊精包合物组分；六味地黄汤总提取物多糖组分；六味地黄汤总提取物糖苷类组分，以及六味地黄汤总提取物脂溶性组分。本发明克服了现有技术忽略六味地黄汤总提取物脂溶性有效成分的不足，通过提取工艺，得到六味地黄汤总提取物的更完备的组分构成，并使得采用这种组合物治疗治疗糖尿病肾病成为可能。本发明基于六味地黄汤的治疗新适应症和新靶点，由于抑制NADPH氧化酶，以治疗糖尿病肾病。
文档编号A61P3/10GK102652786SQ201110052398
公开日2012年9月5日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者丛晓东, 张云, 戴德哉, 戴茵, 王胜波 申请人:南京中敬医药科技研究所, 浙江中医药大学中药饮片厂