专利名称：六味地黄复方制剂在防治泌尿系结石中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及预防和治疗泌尿系结石的药物，具体涉及预防和治疗 泌尿系结石的中药。
背景技术：
泌尿系结石，是一种威胁人类健康的常见疾病。具统计，至2000年初发达国家中 泌尿系结石的发病率为10% 12%，其中绝大多数是草酸钙结石，草酸钙结石占尿石症的 80%左右。随着体外冲击波碎石术等现代高新科技的临床应用，泌尿系结石的治疗取得了 长足的进步，但泌尿系结石被摘除或排出后复发率很高，可达60% 80%。同时体外震波 碎石法可能会造成肾实质损伤，使肾功能下降，而且碎石后的结石碎片和可能并发的感染 给结石治疗带来一些严重问题。目前尚缺乏预防及治疗尿石症的有效药物。
发明内容
本发明的任务是提供一种用于预防和治疗泌尿系结石的药物。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种用于预防和治疗泌尿系结石的药物是六味地黄复方制剂，所述 的六味地黄复方制剂是以下列组分为原料，按常规方法制备的药物制剂熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻。这六位中药材是六味地黄丸的成份，因由六位中药材组成，其中熟地黄为君药，故 名为六味地黄丸。六味地黄丸源于宋代医学家钱乙的《小儿药证直诀》，是滋补肾阴的基础 方剂，配伍组方上具有“三补三泻”的特点。现代医学研究，六味地黄丸还具有增强免疫、抗 衰老、抗疲劳、抗低温、耐缺氧、降血脂、降血压、降血糖、改善肾功能、促进新陈代谢及较强 的强壮作用。但畏寒怕冷、痰多湿重之人不宜服用。参见《中华人民共和国药典》2005年版 一部。目前，市场上也有以这六位中药材制备的胶囊制剂，如北京亚东生物制药有限公司生 产的六味地黄胶囊。本发明研究表明，六味地黄制剂具有防治泌尿系结石的作用，能有效抑制大鼠体 内尿草酸钙结石的形成，六味地黄制剂能够用于预防和治疗泌尿系结石。实验资料一六味地黄复方制剂的制备及其防治泌尿系结石的体外药理研究(一 )六味地黄复方制剂的制备1、实验仪器及试药1.1 仪器电子分析天平(精确至万分之一，Sartorious)AS2060B 型超声波清洗仪(Automatic Science Instrument Co. Ltd)1.2 药材泽泻Alisma orientalis (Sam. ) Juz印(购于武汉刘天保药业有限责任公司，产地 福建，批次080907。)
车前子Plantago asiatica L (购于武汉刘天保药业有限责任公司，产地江西，批 次080801)
081026) 081026)
茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf (购于亳州千草药业，产地湖北，批次081026，) 熟地黄Radix rehmanniae preparata (购于毫州千草药业，产地河南，批次
山萸肉Cornus officinalis Sieb. et Zucc.(购于亳州千草药业，产地浙江，批次
干山药Dioscorea opposita(购于亳州千草药业，产地河南，批次081026) 牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr.(购于武汉刘天保药业有限责任公司，产地
安徽，批号080801) 50g。
2.药物的提取 2. 1处方 组1 泽泻50g ；
组2:茯苓50g 山药66. 6g 山茱萸66. 6g 熟地133. 3g 牡丹皮50g 泽泻
2. 2提取(按六味地黄丸质量标准)
各组方按比例称取一定量药材，加水至浸没药材3cm，浸泡0. 5h。采用煎煮法，煎 煮3次，前两次煎煮2h，第三次lh。过滤(第一遍两层纱布，第二遍3000r/5mins离心取 上清，第三遍滤纸抽滤)，合并滤液，备用。2. 3 浓缩将滤液浓缩(直火浓缩至500ml，其后沸水浴浓缩)至相当于lg/ml生药材的浓 度，得六味地黄汤，用安瓿分装保存待用。(二)体外药理实验1、实验仪器及试药1. 1 仪器:电子分析天平(精确至万分之一，Sartorious)AS2060B 型超声波清洗仪(Automatic Science Instrument Co. Ltd)HH-4型恒温水浴锅(江苏省金坛市阳光仪器厂)瓦里安原子吸收光谱仪AA240岛津原子吸收光谱仪AA-68000. 22um，0. 45um微孔滤膜(由sigma公司提供)精密PH试纸1.2 试剂钙单元素标准溶液(中国计量科学研究院，1000ug/ml GBW (E) 080118)，氯化锶 (天津市光复精细化工研究所，阳离子符合光谱测定)，硝酸、盐酸、氯化钙、草酸钙、草酸 钠、TRIS均为分析纯。2.方法及过程2. 1配制氯化锶和草酸钙亚稳过饱和溶液2. 2取草酸钙亚稳饱 和溶液，分别依次加入2. 5ml泽泻、六味地黄汤和蒸馏水(空白对照)，每组各平行操作(加入)3份。以上各组在37°C恒温水浴箱振荡IOmin后，分别 取样2ml (用针头过滤器经直径0. 45um微孔滤膜过滤于离心管内)，然后每组均加入0. 5ml 一水草酸钙籽晶悬液(浓度为5mg/ml)，搅拌30s继续置恒温水浴箱振荡孵育2h。然后从 各组取2ml溶液同样经0. 45um微孔滤膜过滤并收集在离心管内。实验结束后取各离心管 内溶液0. 5ml，加入4. 5ml氯化锶。3、样品抑制草酸钙结晶生长的抑制指数的测定3. 1用原子吸收分光光度法测各样品加籽晶前后的钙离子浓度，每组平行测三次。3. 2按下式计算各组对草酸钙晶体生长的抑制指数(I. I)草酸钙晶体生长抑制指数(I. 1)%= [1-(C0-Ct)/C0]*100%上式中，Ctl为各组加籽晶前滤液中Ca离子的浓度，Ct为各组加籽晶孵育后的Ca 离子的浓度。每实验组和对照组的3份平行操作结果，用均数士标准差表示草酸钙晶体生 长抑制指数(I. I)，并进行统计学分析。4.六味地黄汤的深入研究在确定六味地黄汤具有抑制草酸钙结晶生长的基础上，重复制备六味地黄汤和泽 泻样品，并配制不同稀释浓度的六味地黄汤样品，分别测定其对草酸钙晶体生长的抑制指 数，用均数士标准差表示，并与泽泻单味进行比较，进行统计学分析。(三)结果1、样品抑制草酸钙结晶生长的抑制指数的测定将测得的钙离子浓(其结果用均数士标准差表示)，带入公式计算出草酸钙晶体 生长抑制指数(I. I)。如表一所示，并与蒸馏水对照组用t检验进行显著性检验。表一.各组方的草酸钙晶体生长抑制指数 由结果可知，泽泻、六味地黄汤的抑制指数明显大于蒸馏水对照组，将其与蒸馏水 对照进行t检验，P < 0. 05，具有显著性差异，说明有体外抗结石能力。而且六味地黄汤的 抑制指数大于泽泻。
将蒸馏水组作为空白，得出泽泻与六味地黄汤对于蒸馏水的相对抑制指数，如表
表二.以蒸馏水为空白各组方的相对抑制指数
组别_m^_六味地黄汤_
抑制指数 I 54.73 士2.1380.88士25.25
2.六味地黄汤的深入研究
测定六味地黄汤在稀释10倍、5倍、2. 5倍下的抗结石能力。其结果均用均数士
二所示。
注A为六味地黄汤，B为泽泻水煎液，阿拉伯数字表示稀释倍数。由结果可以看出在体外模拟实验中泽泻与六味地黄汤有极其相似的抑制结石能 力，且数据分析显示无显著性差异(p>0. 05)，而稀释了 10倍、5倍、2. 5倍的六味地黄汤对 抑制能力的影响不大，样本间无显著性差异(P >0.05)。六味地黄汤与蒸馏水对照在统计 学上具有显著性差异，说明其具有防治结石的能力。单纯对抑制指数分析，六味地黄汤的抑 制指数在数值上大于泽泻的抑制指数，说明六味地黄汤的抑制结石的能力好于泽泻单味。实验资料二六味地黄制剂防治泌尿系结石的作用1.材料六味地黄制剂六味地黄胶囊(北京亚东生物制药有限公司产品)阿法骨化醇片(重庆药友制药有限责任公司产品)枸橼酸钾溶液华中科技大学同济医学院附属同济医院，配制批号091014取六味地黄胶囊，称取一定量胶囊内容物，用蒸馏水溶解分散，配成浓度为0. 16g/ ml的药液。取一定量0. 16g/ml的药液，分别稀释成0. 04g/ml及0. 02g/ml的药液，分别供 高、中、低剂量组给药。2.实验方法2. 1动物分组及给药方法8 9周龄Wistar雄性健康大鼠60只，体重180 220g,常规颗粒饲料喂养。随机分为6组(A、B、C、Dh、Dm、Dl)，每组10只。各组大鼠在相同 的环境下饲养五周，第一周先适应环境，从第二周开始给药。动物分组及给药方案如表1 表1动物分组及给药方案 2. 2观察指标及检测方法实验结束前Id称重比较实验前后大鼠体重的变化，并 用代谢笼收集并测24h尿量、尿pH值、24h尿草酸(Ox)的分泌量。断颈处死大鼠，下腔静脉 穿刺取血4ml，离心(5000r/min)15min后，取上层血清(_20°C保存)，测血尿素氮(BUN)Jjl 酐(Cr)，P，Ca2+、Mg2+含量。切取双肾，纵向剖开，取左侧肾脏用10%中性福尔马林固定，作 常规HE石蜡切片和Von-kossa’ s染色，偏光显微镜观察肾组织草酸钙结晶形态分布及肾组 织的病理改变。原子吸收光谱仪进行右肾组织Ca2+，Mg2+含量，尿总Ca2+，Mg2+含量测定。高 锰酸钾退色法测定24h尿草酸(Ox)分泌量。2. 3统计学分析所有检验结果均用均数士标准差表示，组间差异用F(0ne-Way AN0VA)检验进行显著性检验。3.实验结果3. 1 一般情况(行为、毛色、精神、体重等)实验期间各组大鼠生长状况良好，毛色、行为、精神状态、饮食及粪便均无明显异 常。A组体重增量明显大于其它各组，差异显著。模型组大鼠死亡2只，体重增量小于其它 各组。3. 2血清生化检查6组大鼠的血清生化指标结果如表2所示血清BUN方面，除Dh组外，其它各组明 显高于A组，差异显著(P <0.01)；各六味地黄制剂组BUN含量均低于B、C组，且随着剂量 的升高，有下降趋势，但差异不显著。血清Cr方面，除队组外，其它各组明显低于B、C组， 差异显著；各六味地黄制剂组随剂量的升高有下降趋势，但差异不显著。血清Ca2+、P、Mg2+ 含量各组间均无显著性差异。表2血清生化检查结果 备注与 A 组比较 *P < 0. 05，**P < 0. 01 ；与 B 组比较□ P < 0. 05，□□ P < 0. 01 ；与 C 组比较·Ρ < 0. 05，"P < 0. 01
3.3 2处尿量、尿？!1、尿(^、032+、]\%2+分泌量6组大鼠24h尿量、尿pH、尿Ox、Ca2+、Mg2+分泌量结果如表3所示24h尿量方面， A组大鼠尿量明显低于其它各组，差异显著(P<0.01) ;(、011、0 、队组尿量高于模型组，但 无显著性差异。24h尿Ox分泌量方面，B组明显低于其它各组，差异显著(P<0.05)；各六 味地黄制剂组随剂量的升高有下降趋势，24h尿Ox分泌量明显低于B组，且与A组无显著性 差异。24h尿Ca2+分泌量方面，模型组B组明显高于A组，差异显著；各六味地黄丸组随剂 量的升高有下降趋势，但差异不显著；DH、Dm组分泌量低于B组，但差异不显著。24h尿Mg2+ 分泌量方面，除队组与C组间有显著性差异(P < 0. 05)外，各组间无显著性差异。各组药 物对大鼠尿PH值无明显影响。表3 2处尿量、尿？!1、尿(^、032+、1%2+分泌量 备注与A 组比较 *P < 0. 05，**P < 0. 01 ；与 B 组比较□ P < 0. 05，□□ P < 0. 01 ；与 C 组比较·Ρ < 0. 05，"P < 0. 013. 4右肾系数、肾组织Ca2+、Mg2+含量6组大鼠右肾系数、肾组织Ca2+、Mg2+含量结果如表4所示Α组右肾系数、肾组织 Ca2+含量明显低于其它各组，差异极显著(P < 0. 01)。各六味地黄制剂组右肾系数、肾组织 Ca2+含量随着剂量的升高有下降趋势，但差异不明显；DH组右肾系数明显低于B、C组，差异 显著(P<0.05) ;DH组肾组织Ca2+含量低于B、C组，但差异不显著。肾组织Mg2+含量方面， B、C组明显低于其它各组(P < 0. 05)，其它各组间均无显著性差异。表4右肾系数、肾组织Ca2+、Mg2+含量 备注与A 组比较 *P < 0. 05，**P < 0. 01 ；与 B 组比较□ P < 0. 05，□□ P < 0. 01 ；与 C 组比较·Ρ < 0. 05，"P < 0. 013. 5肾组织病理学检查及偏光显微镜检查肉眼观察各组大鼠肾脏外观Α组肾脏大小正常，表面颜色较红润，色泽均勻；其 它各组肾脏明显肿大，表面颜色苍白，其中以B组最为显著。切面观Α组切面鲜红色；B组 切面苍白色，用手触摸有明显的细砂摩擦感，皮质和髓质分界不清楚，其它各组则不明显。常规病理切片HE染色后，草酸钙晶体在镜下呈淡蓝色晶体，不规则、折光性较强； Von-Kossa's染色后，草酸钙晶体呈黑褐色。A组为正常肾组织结构，无结晶形成；B组肾组 织有多数结晶形成，主要存在于肾皮质内，部分结晶成堆且相互连接成片，肾髓质内也有少 量结晶形成，高倍镜下可见近曲小管和远曲小管上皮细胞明显肿胀、变性、坏死，管腔明显 扩张，管腔内可见嗜伊红染色样坏死物质及部分脱落上皮细胞，周围有晶体聚集，肾间质有 明显的慢性肾炎性细胞浸润；Dh组结晶明显少于B组，仅有少量结晶分布在肾皮质和髓质， 结晶大多数不成堆，管腔内仅见散在草酸钙晶体，管腔扩大明显比B组轻，腔内也无明显的 坏死脱落样物质；DM、DpC组情况与B组类似，但相对较轻。见图1至图8。本发明采用乙二醇(EG)饮水和Ια-羟基维生素D3灌胃诱导SD大鼠肾草酸 钙结石模型形成。动物实验表明，B组大鼠的血清BUN、Cr、24h尿0x、24h尿Ca2+分泌量、右 肾系数及肾组织Ca2+含量明显高于A组，这与肾组织病理切片检查结果是一致的。而六味 地黄制剂高剂量组血清BUN、Cr、24h尿0x、24h尿Ca2+分泌量、右肾系数及肾组织Ca2+含量 明显低于B组，且能减轻草酸钙晶体在肾组织内的沉积，在一定程度上减轻了肾小管的扩 张及肾功能的损伤。另外，六味地黄制剂组大鼠24h尿量明显多于空白对照组和结石模型 组，有较强的利尿作用，有利于草酸钙结石的排出。本发明研究表明，六味地黄制剂能有效 抑制大鼠体内尿草酸钙结石的形成，能够用于预防和治疗泌尿系结石。
图1为空白对照组皮质(HE染色)图2为空白对照组髓质(HE染色)图3为空白对照组(Von-Kossa’ s染色)图4为模型组皮质(HE染色)图5为模型组髓质(HE染色)
图6为模型组(Von-Kossa’ s染色)图7 为 Dh 组皮质(Von-Kossa’ s 染色)图8 为 Dh 组髓质(Von-Kossa' s 染色)
具体实施例方式实施例1 六味地黄复方制剂的制备1.药材泽泻Alisma orientalis (Sam. ) Juz印(购于武汉刘天保药业有限责任公司，产地 福建，批次080907。)车前子Plantago asiatica L (购于武汉刘天保药业有限责任公司，产地江西，批 次080801)茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf (购于亳州千草药业，产地湖北，批次081026，)熟地黄Radix rehmanniae preparata (购于毫州千草药业，产地河南，批次 081026)山萸肉Cornus officinalis Sieb. et Zucc.(购于亳州千草药业，产地浙江，批次 081026)干山药Dioscorea opposita(购于亳州千草药业，产地河南，批次081026)牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr.(购于武汉刘天保药业有限责任公司，产地 安徽，批号080801)
50g ；
2.药物的提取 2. 1处方 组1 泽泻50g ；
组2:茯苓50g 山药66. 6g 山茱萸66. 6g 熟地133. 3g 牡丹皮50g 泽泻
2. 2提取(按六味地黄丸质量标准)
各组方按比例称取一定量药材，加水至浸没药材3cm，浸泡0. 5h。采用煎煮 法，煎 煮3次，前两次煎煮2h，第三次lh。过滤(第一遍两层纱布，第二遍3000r/5mins离心取 上清，第三遍滤纸抽滤)，合并滤液，备用。2. 3 浓缩将滤液浓缩(直火浓缩至500ml，其后沸水浴浓缩)至相当于lg/ml生药材的浓 度，得六味地黄汤制剂，用安瓿分装保存待用。
权利要求
六味地黄复方制剂在制备用于预防或/和治疗泌尿系结石药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的六味地黄复方制剂在制备用于预防或/和治疗泌尿系结石药 物中的应用，其特征在于，所述的六味地黄复方制剂是以熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山 药、茯苓、泽泻为原料，按常规方法制备的药物制剂。
3.根据权利要求1或2所述的六味地黄复方制剂在制备用于预防或/和治疗泌尿系结 石药物中的应用，其特征在于，所述的六味地黄复方制剂是六味地黄丸、六味地黄胶囊或六 味地黄汤。
全文摘要
本发明提供了一种用于预防和治疗泌尿系结石的药物，该药物是以熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻为原料，按常规方法制备的六味地黄复方制剂，如六味地黄丸、六味地黄胶囊、六味地黄汤等。本发明研究表明，六味地黄制剂能有效抑制大鼠体内尿草酸钙结石的形成，具有防治泌尿系结石的作用。
文档编号A61K36/8945GK101879263SQ20101020797
公开日2010年11月10日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者刘博 , 尹春萍 申请人:华中科技大学