专利名称：鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及弱毒活疫苗株，尤其涉及鸡传染性支气管炎冷适应弱毒活疫苗株及其应用，属于鸡传染性支气管炎的防治领域。
背景技术：
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，其特征是病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音；肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”。鸡传染性支气管炎于1930年在美国北达科塔州首次发现，1931年由Schalk和 Hawn首次报道。早期的研究表明，鸡传染性支气管炎病毒主要侵害雏鸡的呼吸道(呼吸型IB)，也危害育成鸡和产蛋鸡群，使之抵抗力降低、产蛋量及蛋的品质下降。1962年 Winterfield和Hitchner在美国报道了致肾脏病变型IB的出现。1956年Jungherr报到了 1951年分离的康涅狄格株(Connecticut，以下简称Corm)和1941年分离的马萨诸塞株 (Massachusetts,以下简称Mass)可引起类似的疾病，但不能交叉保护或交叉中和，从而证明IBV不只一个血清型。中国在1953年就有呼吸型IB发生的报道，1972年邝荣禄在广东首次确诊IB在中国的存在。目前，IBV在中国大部分地区流行，而且在中国免疫鸡群和非免疫鸡群中有新基因型的肾致病性IBV在流行。IBV对所有日龄的鸡均可感染，但感染主要侵害1 4周龄的幼鸡和雏鸡，并可引起死亡，随鸡年龄的增长抵抗力逐渐加强。IBV自然感染常在48小时内出现症状，人工接种后从第24小时到第7天始终可从气管、肾、法氏囊中分离出病毒。雏鸡感染后症状严重，死亡率取决于病毒的毒力及鸡群的抵抗力，一般死亡率为20% 30%。本病主要通过呼吸道排毒，传播速度快，距离远，往往整栋鸡舍同时发病。此外，IBV还可通过泄殖腔传播。IBV 能够在呼吸道、肠道、肾脏和输卵管等组织器官中复制。上呼吸道是IBV复制的主要部位， 通常不论分离株来自何种组织，都可感染鸡的呼吸道并在气管中产生特征性病变。随后出现病毒血症，病毒从上呼吸道广泛分布到其它组织。传统的呼吸型IB，感染病鸡的临床症状以咳嗽、喷嚏和气管发生罗音等呼吸道表现为主。致肾病变型IBV，病鸡临床剖检主要表现为肾苍白肿大，严重者出现典型的“花斑肾”，有大量的尿酸盐沉积，最后常因肾衰竭而死亡。目前，致肾病变型IBV已成为危害养鸡业的重要病原。免疫接种是防治该病的最有效手段。目前，市场上已经有一些弱毒疫苗在临床上应用，但由于IBV血清型众多，且流行毒株与疫苗株相比在基因水平上存在较大变异，致使现有的疫苗株不能够有效防制IB流行毒株的攻击，IB的防制效果不理想。因此，研究开发新的具有较好保护力的IB弱毒疫苗显得尤为重要
发明内容
本发明主要所要解决的技术问题是克服现有疫苗株不能够有效防制鸡传染性支气管炎病毒流行毒株的攻击，防制效果不理想等缺陷，提供一株新的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株，该弱毒疫苗株能够有效抵抗传染性支气管炎病毒的攻击，可提供良好的免疫保护效力。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的本发明将传染性支气管炎病毒野生强毒株进行连续低温冷适应传代致弱培养，最终筛选获得一株具有良好免疫保护效力的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株(LDL70-C 株)，其微生物保藏号是CGMCC No. 4711 ；分类命名传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)；保藏时间是2011年3月28日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株(LDL70-C株)的形态学观察 LDL70-C株病毒尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镱下可见到直径经为80-120nm的冠状毒，毒病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均勻排列的冠状突起。本发明冷适应弱毒疫苗株免疫效力评价实验表明，本发明LDL70-C株(P70代毒) 具有良好的免疫保护性，主动免疫保护率为80%以上，被动免疫在9天内可以获得90%以上的保护，说明本发明毒株对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。可有效保护鸡抵抗传染性支气管炎病毒强毒的攻击。安全性试验结果表明，本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒活疫苗(LDL70-C株)对雏鸡和产蛋种鸡安全，无副反应，安全性好。由于冷适应弱毒疫苗株LDL70-C株是由野生型毒株LDL091022在鸡胚持续逐级降温培育驯化而获得的子代毒株，参照本发明说明书中实施例1中的方法，本领域普通技术人员将能应用常规方法从LDL70-C株培育和分离子代亚克隆毒株，另外，公开的毒株进一步传代或利用不同条件培养获得毒株均完全在病毒学领域技术人员的普通技能之内，因此，以上LDL70-C株及其子代毒均在本发明范围之内。本发明冷适应弱毒疫苗株LDL70-C克隆毒株Sl基因序列如SEQ ID NO :1所示；其亲本野生毒株LDL091022株的Sl基因序列如SEQ ID NO :2所示；与商品化IB疫苗株H120、 H52和W93疫苗株Sl基因序列和氨基酸序列多重比对如图1和图2所示。以类似本发明公开的方式，从冷适应弱毒疫苗株LDL70-C及亲本毒分离或培育的类似克隆毒株也应在本发明的保护范围之内。另外，S基因是传染性支气管炎病毒的主要保护性基因，能够刺激机体产生中和抗体，S基因也是在病毒演化过程中最容易发生变异的基因，且其高变区主要位于Sl基因内，因此本发明主要展示本发明弱毒株的亲本野毒株Sl基因序列。本发明冷适应弱毒疫苗株与亲本野毒株进化关系紧密，本领域技术人员可通过培育或分离的子代亚克隆毒株Sl基因与亲本毒LDL091022株Sl基因的对比，可发现本发明涉及弱毒疫苗毒株的基因序列特征。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种预防或治疗鸡传染性支气管炎的疫苗，该由本发明冷适应弱毒疫苗株LDL70-C株和冻干保护剂组成。本发明所述的预防或治疗鸡传染性支气管炎疫苗可参考以下方法制备得到(1) 将本发明弱毒疫苗株培养增殖得到生产用毒种；将生产用毒种接种于鸡胚尿囊腔内，培养， 收获病毒尿囊液，灭菌；(2)经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液与冻干保护剂混合培苗，即得。其中，步骤(2)中将病毒液与冻干保护剂按照9 1的体积比进行配苗；所述的冻干保护剂优选主要由蔗糖和明胶组成(8%明胶、40%蔗糖保护剂)。本发明鸡传染性支气管炎疫苗的使用方法(1)接种途径滴鼻。(2)接种剂量1羽份。本发明鸡传染性支气管炎疫苗免疫后14天产生免疫力，一次免疫持续期为4个月。本发明弱毒株除了作为单苗使用外，还可用于制备联苗等。
图1本发明弱毒株(LDL70-C)克隆及其亲本野毒株Sl基因与IBV H120、H52、W93 株和LDT3-A株Sl基因核苷酸序列比对。图2本发明弱毒株(LDL70-C)克隆及其亲本野毒株Sl蛋白与IBV H120、H52和 W93株Sl蛋白的氨基酸序列比对。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验例1本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株LDL70-C株的培育及鉴定1材料与方法1.1病毒株LDL091022的冷适应传代致弱使用9-10日龄SPF鸡胚对IBV强毒株LDL091022株进行连续低温冷适应传代培养，每个代次通过尿囊腔接种3枚鸡胚，每胚接种100 μ L，培养条件为从35°C开始每10代降低1V，每代次孵育72h，72h后，将鸡胚取出，观察鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液， 进行下一次传代，传代至孵育温度到30°C，后期传代均为30°C培养，连续传至70代。1. 2病毒滴度测定取LDL091022P2、ΡΙΟ、P20、P30、P40、P50、P60 和 P70 代次毒的鸡胚尿囊液，分别
依次作10倍系列稀释；选择4个稀释倍数(IO4 IO7或IO5 IO8)的病毒悬液分别接种5 枚9 10日龄的SPF鸡胚，每枚鸡胚接种100 μ L，将鸡胚置37°C温箱内孵育1周，每天照胚，记录1周内鸡胚的感染数和生存数，按Reed-Muench法计算EID5(1。1. 3无菌检验和支原体检验分别将LDL091022株在鸡胚传代过程中的P2、P10、P30、P40、P50、P60和P70代次
毒按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。1. 4外源病毒检验分别将LDL091022株在鸡胚传代过程中的P2、P10、P30、P40、P50、P60和P70代次
毒进行外源病毒检测。1. 4. 1用鸡胚进行外源病毒检测(病毒的特异性检验)
取病毒样品LDL091022株P2、ΡΙΟ、P30、P40、P50、P60和P70代次毒,稀释成每剂量1X102_°EID5(i/0. 1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取9 10 日龄SPF鸡胚10枚，每枚鸡胚尿囊腔接种病毒样品悬液0. 2ml，另取9 10日龄SPF鸡胚 10枚，每枚鸡胚尿绒毛尿囊膜接种病毒样品悬液0. 2ml，同时设正常对照组，孵化7日，每日照胚，接种后24小时内的死亡鸡胚为非特异性死亡，弃去不计，每组存活至少8枚鸡胚，对所有接种24小时后存活的鸡胚进行检查，观察有无异常。对绒毛尿囊膜进行观察，检查有无异常，并对尿囊液进行血凝抗原检测。1. 4. 2用细胞培养物进行外源病毒检测取病毒样品1X102_°EID5(i/0. 1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(CEF)，接种中和后的病毒液0.2ml， 在37°C下吸附1小时，观察5日，检查是否出现由接种物引起的CPE ；用鸡红细胞进行血吸附试验，弃去培养液，并洗涤单层细胞，加入5%红细胞悬液，在4°C吸附60分钟，用缓冲液洗涤2次细胞后，在显微镜下观察，是否出现CPE和血吸附现象。1.4.3 COFAL试验(禽白血病病毒检验)取病毒样品，制备成每剂量5X IO5 5EID5tlA). 2ml，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(CEF)，各接种病毒样品0. 2ml，吸附30分钟，弃去培养液，加入细胞生长液，次日换成维持液。同时设立正常细胞和培养液作为对照。培养5 7日，按常规方法收获细胞，其中1/2作标记置-70°C检验用(Pl)，其余细胞分在两个瓶中，培养7日后，按同样方法收获细胞，留样(P2)，如此继续传第3代，收获细胞(P3)，所有对照同样处理。将P1、P2、P3 和所有对照冻融3次。同时设立阳性对照按照“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”对每份样品进行COFAL试验。1. 5 LDL091022 的致弱评价 180只1日龄的SPF鸡随机分为9组(每组20只)，分别将9组鸡饲养于9个负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。在10日龄时，1 8组雏鸡分别用鸡胚代次毒P2 (IO4 7EID5tl)、 PlO (IO4-8EID50)、P20 (IO5-2EID50)、P30 (IO5EID50)、P40 (IO4 8EID50)、P50 (IO4 8EID50)、 P60 (IO4-9EID50)和P70 (IO5EID5tl)进行接种，每只滴鼻100 μ L ；第9组雏鸡作为对照组，每只滴鼻100 μ L正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化并于接种后14日，使用同源强毒 LDL091022 Ρ3 (IO5-68EID50)进行攻击，每只滴鼻点眼100 μ L ；攻毒后，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理变化。2实验结果2. 1 LDL091022 的传代致弱随着对LDL091022病毒传代次数的增加，其对鸡胚的适应性越来越强，鸡胚死亡率逐渐升高，死亡时间逐渐缩短，鸡胚病变也更加明显。接种病毒的鸡胚呈现明显发育障碍(侏儒胚)，蜷曲成球形，胚体出血，羊膜水肿增厚，紧贴胚体等典型的传染性支气管炎病毒感染的变化。每个代次的鸡胚尿囊液均不能凝集鸡外周血红细胞，说明鸡胚尿囊液中不含能使鸡外周血红细胞凝集的禽的其它病毒，如正粘病毒、副粘病毒或腺病毒等。将 LDL091022P2、ΡΙΟ、Ρ20、Ρ30、Ρ40、Ρ50、Ρ60和Ρ70代次毒的鸡胚尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镜下均可见到直径约为80-120nm典型的冠状病毒，病毒粒子呈多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均勻排列的冠状突起，而且未观察到有其它病毒。含有 LDL091022 P2、ΡΙΟ、P30、P40、P50、P60和P70代次毒的鸡胚尿囊液通过RT-PCR扩增得到的产物，经0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，结果发现与预期扩增核酸片断大小相符的特异性条带，而在阴性对照中未见此条带。2. 2病毒滴度测定结果LDL091022毒株可高度适应鸡胚，P2代的EID5tl高达106_68/0. Iml，传代后病毒滴度逐渐升高，P25 P80代彡107EID50/0. lml, PlOO P120趋于稳定，滴度约为 107EID50/0. lml。表1 LDL091022鸡胚冷适应传代毒滴度测定结果
权利要求
1.鸡传染性支气管炎(Avianinfectious bronchitis)冷适应弱毒疫苗LDL70-C株， 其特征在于其微生物保藏号是CGMCC No. 4711。
2.由权利要求1所述的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗LDL70-C株分离或培育的亚克隆毒株。
3.权利要求1所述的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗LDL70-C株在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎药物中的用途。
4.权利要求1所述的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗LDL70-C株在制备诊断或检测鸡传染性支气管炎试剂中的用途。
5.权利要求2所述的亚克隆毒株在制备预防或治疗鸡传染性支气管炎药物中的用途。
6.权利要求2所述的亚克隆毒株在制备诊断或检测鸡传染性支气管炎试剂中的用途。
7.一种防治鸡传染性支气管炎的疫苗组合物，由权利要求1所述的鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗LDL70-C株和药学上可接受的冻干保护剂组成。
8.一种防治鸡传染性支气管炎的疫苗组合物，由权利要求2所述的亚克隆毒株和药学上可接受的冻干保护剂组成。
9.按照权利要求7或9所述的疫苗组合物，其特征在于所述的冻干保护剂主要由蔗糖和明胶组成。
全文摘要
本发明公开了鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用。本发明将传染性支气管炎病毒野生强毒株进行连续低温冷适应传代致弱培养，获得一株具有良好免疫保护效力的冷适应弱毒疫苗株，其微生物保藏号是CGMCC No.4711。免疫效力评价实验表明，本发明冷适应致弱疫苗株具有良好的免疫保护性，主动免疫保护率为80％以上，被动免疫在9天内可以获得90％以上的保护，对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力，可有效保护鸡抵抗传染性支气管炎病毒强毒的攻击。安全性试验表明，本发明冷适应弱毒活疫苗对雏鸡和产蛋种鸡安全，无副反应，安全性好。本发明冷适应致弱疫苗株可应用于制备成防治鸡传染性支气管炎病毒的单苗或联苗等。
文档编号A61P31/14GK102220287SQ20111011046
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者刘晓丽, 刘胜旺, 孔宪刚, 邵昱昊, 韩宗玺 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司