专利名称：黄芪甲苷在制备促进创面愈合上皮化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及黄芪甲苷在制药领域中的新用途，具体地说，是黄芪甲苷在制备促进创面愈合上皮化药物中的应用。
背景技术：
中药黄芪具有补齐、托毒、生肌之功效。《本草纲目》中记载其有排脓止痛，活血生肌，内托阴疽之功效，有“疮家圣药”的美誉，临床常用于治疗各种难愈性溃疡。黄芪甲苷则是中药黄芪的主要有效成分之一，其结构式为
该化合物的分子式是=C41H68O14,分子量784. 98，20%-30%的黄芪甲苷为黄色粉末，90% 的黄芪甲苷为白色粉末，98%的黄芪甲苷则为无色针晶，稍溶于甲醇，几乎不溶于乙酸乙酯、 丙酮及水，在乙醇中加热溶解。该化合物可从豆科植物黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge)的干燥根部提取获得，也可直接从公司购买，如上海中国药品生物制品鉴定所。已知黄芪甲苷具有多种药理作用，如可改善心肺功能，加强心脏收缩力，扩张血管，降低血压，改善皮肤血液循环和营养状况；保护肝脏，防止肝糖元减少，对慢性活动性肝炎有良好作用；诱生干扰素和调动机体免疫功能，抑制病毒繁殖和肿瘤生长；还可增强免疫力， 增加能量，抗疲劳。 慢性皮肤溃疡又称难治性溃疡或难愈性溃疡，往往是由于各种原因，如糖尿病、下肢静脉曲张、创伤和长期压迫等，导致的体表皮肤组织缺损，而缺损部位皮肤组织不能及时修复，进一步影响其正常生理功能，甚至继发感染等，最终导致的一种常见于多种疾病的并发症。该病具有病程长，反复发作，花费巨大的特点，对患者生活、心理和工作质量都具有极大影响。临床实践显示，慢性难愈性皮肤溃疡主要涉及创伤性溃疡、下肢静脉曲张性溃疡、 老年性压迫性溃疡及糖尿病溃疡等。在欧洲，下肢静脉曲张性溃疡发病率为0.1%-1% ；在美国，糖尿病人群中发生溃疡的患者为5. 8%，因下肢溃疡而住院的患者占20%，其中截肢患者约为6% ；在我国，因体表慢性难愈性创面在外科进行住院治疗的患者占外科住院患者的 1.5%-3%。另外，我国目前约有3000万糖尿病患者，其中I型糖尿病伴有下肢血管并发症者占2. 6%, II型糖尿病为5. 2%，总计为5%。而且，我国糖尿病患者发病率逐年增高，目前已经成为全世界糖尿病患者最多的国家。慢性皮肤溃疡花费巨大。据统计，英国每年治疗慢性皮肤溃疡的费用超过3亿英镑。美国每位患者的年治疗费用超过2000美元。尽管我国没有确切的卫生经济学统计数据，但勿容置疑的是，罹患慢性皮肤溃疡的患者正承受无比沉重的经济压力。因此，积极研究中医药防治糖尿病及其并发症，如皮肤、足溃疡等慢性皮肤溃疡，努力开发促进创面愈合的药物，具有重要的社会意义及广泛的经济效益。现代医学研究将创面愈合过程分为炎症期、肉芽及血管组织增殖期、上皮化期与重塑期等不同阶段。其中，创面上皮化是创面愈合的重要阶段，该阶段涉及角质形成细胞的增殖与迁移，特别是创缘角质形成细胞的向内迁移，有效覆盖创面形成上皮，是创面愈合的关键步骤。所以，研究和开发可加快上皮化进程、促进角质形成细胞增殖和迁移的药物，对攻克和治愈慢性皮肤溃疡，意义十分重大。在对创面愈合机制的研究中，人们发现，Wnt信号通路与创面修复关系密切，涉及成纤维细胞、角质形成细胞的增殖与迁移、细胞外基质及胶原收缩、血管新生等诸多方面。 Wnt信号转导通路是由Wnt基因编码的Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等一起组成的复杂的信号通路。该信号通路主要有3个①经典Wnt-β -catenin-LEF/TCF信号通路(简称经典Wnt信号通路)，这条通路激活后将募集细胞内的β -链蛋白(β -catenin)，将后者活化后转移入细胞核，与转录因子LEF/TCF等共同作用激活特异基因的转录。而在未活化下， β-catenin则被磷酸化后降解；②细胞极性通路，主要调控细胞骨架的重排；③Wnt/Ca2+通路，通过钙依赖性激酶、钙调蛋白和转录因子激活T细胞核因子(NF-AT)起作用。已有研究证实经典Wnt信号通路相关糖蛋白与创面愈合有密切关系。在成年机体，Wnt基因则多处于相对静止状态。而在慢性皮肤溃疡中，Wnt分子通过旁分泌和自分泌的方式作用于细胞膜(目前已知Wnt蛋白家族成员中，能激活经典Wnt信号通路的有Wntl、Wnt-3a和Wr^8)，与跨膜受体frizzelds及其共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白结合，进而降低β-catenin磷酸化的降解，使得β-catenin在细胞内聚集，最后进入细胞核与T细胞因子(TCF)结合，激活下游靶基因，例如c-myc、K6、K16、MMP-7、FN等。 其中，c-myc能够促进细胞从Go期进入S期，被认为可能与细胞的增殖及分化相关。在正常人表皮中，c-myc的表达仅局限在表皮的基底细胞层，然而，有研究表明，在慢性皮肤溃疡中，c-myc则在表皮全层表达增强，失衡的c-myc可能使干细胞耗竭，而抑制细胞生长并刺激其终末分化，同时还可导致细胞外骨架物质K6/K16蛋白降低，影响细胞迁移，不迁移的终末分化细胞堆积在创周阻碍上皮化形成。科学家通过对难愈性溃疡与正常人皮肤相比较发现，慢性皮肤溃疡患者创面β-catenin核表达、c-myc蛋白表达明显增强。将溃疡创缘 β -catenin核表达的角质形成细胞进行体外培养，发现其迁移能力与正常对照组相比显著降低。因此，我们期望发现一种药物，用来抑制慢性皮肤溃疡患者的经典Wnt信号通路的过度激活，下调β-catenin以及通路下游基因的表达，从而促进角质形成细胞增殖和迁移，即促进创面愈合的上皮化进程，最终达到治愈慢性皮肤溃疡的目的。但是，目前关于黄芪甲苷在制备促进创面愈合上皮化药物中的应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种黄芪甲苷在制药中的新用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是 黄芪甲苷在制备促进创面愈合上皮化药物中的应用。所述的上皮化为角质形成细胞的增殖； 所述的上皮化为角质形成细胞的迁移。所述的创面愈合上皮化是慢性皮肤溃疡的创面修复。本发明优点在于
1、本发明发掘了黄芪甲苷在制药上的新用途，开拓了一个新的应用领域。2、黄芪甲苷可促进角质形成细胞的增殖和迁移，即可加快创面愈合过程中的上皮化进程，具有治疗创面愈合的功效，为防治慢性皮肤溃疡提供了重要的临床依据。3、黄芪甲苷物质原料来源丰富、价格低廉、制备工艺简单，具有广阔的产业化前景，适于广泛推广使用。
附图1是氯化锂对小鼠角质形成细胞增殖的影响。附图2是氯化锂处理的小鼠角质形成细胞BrDU染色图。附图3是氯化锂诱导角质形成细胞发生S期阻滞的分析图。附图4是氯化锂对蛋白β -catenin和PCNA表达的影响。附图5是黄芪甲苷在氯化锂模拟激活经典Wnt信号通路下对角质形成细胞增殖的影响图。附图6是不同浓度黄芪甲苷在干预氯化锂模拟激活经典Wnt信号通路7 时对角质形成细胞增殖的影响图。附图7是黄芪甲苷改善氯化锂对角质形成细胞的迁移抑制图。附图8是黄芪甲苷降低氯化锂诱导角质形成细胞引起的β -catenin核表达图。附图9是黄芪甲苷降低氯化锂对角质形成细胞S期阻滞效应图。附图10是黄芪甲苷干预氯化锂模拟激活经典Wnt信号通路下对β-catenin、 c-myc和PCNA表达的影响图。附图11是BrDU检测显示黄芪甲苷提高氯化锂干预下细胞阳性率图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明。本具体实施方式
是以小鼠角质形成细胞为主要研究对象，探讨氯化锂(LiCL)模拟激活Wnt信号通路下，黄芪甲苷(Astragaloside IV，简写为AS-IV)对细胞增殖与迁移的影响。试验所用AS-IV购自上海中国药品生物制品鉴定所，取20mg AS-IV溶于Iml 二甲基亚砜(DMS0)，配成浓度为20mg/ml的储存液，4°C冰箱备用，临用时用Cnt_07培养液倍比稀释，使其最终浓度分别为4(^8/1111，8(^8/1111，和160yg/ml ；所用LiCL购自美国Sigma 公司，使用无菌IX磷酸盐缓冲液PBS配制为4M浓度，尼龙筛过滤，-4°C保存备用；MTS/PMS 液购自美国!Iomega公司；β -catenin、c_myc、PCNA等试剂分别购于美国Cell Signaling Technology公司及Santa Cruz公司；Cnt-07细胞培养液，购自瑞士 CELLnTEC公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Amreson公司；所用小鼠角质形成细胞是通过培养美国癌症研究会的原代角质形成细胞制得。实施例1
LiCL模拟激活经典Wnt信号通路
1、MTS/PMS法检测LiCL模拟激活经典Wnt信号通路及对角质形成细胞增殖的影响使用MTS/PMS法检测LiCL对角质形成细胞增殖的影响，结果显示采用从0. 5mM到 40mM不同浓度的LiCL，分别干预处理小鼠角质形成细胞24h，4 i和72h，LiCL在大于5mM 浓度时开始显著抑制角质形成细胞生长(见图9)。LiCL在Mh，48h，7a!时候的小鼠角质形成细胞半数抑制浓度IC50分别为25. 85士5. 03，16. 16士0. 95，12. 35士 1. 38mM。因此，本实验采用20mM浓度培养48h开展后续对AS-IV的研究。2、BrDU染色法测定LiCL对角质形成细胞增殖的影响
BrDU染色的原理是在细胞周期的S期，和细胞一起孵育的BrdU能渗入DNA分子中， 再结合BrdU抗体与渗入DNA的BrdU特异性结合，就能够检测到DNA复制活跃的细胞。因此，利用BrDU在特定时间内掺入细胞的多少就可以反应出细胞增殖的状态。我们采用BrDU 掺合法进一步观察LiCL对角质形成细胞增殖的影响。结果如图IOA所示正常空白对照组细胞生长正常，BrDU阳性率在对照组为71. 81 士6. 79%，提示细胞增生活跃，处于增殖指数期。采用LiCL培养干预细胞后发现，LiCL显著抑制细胞增殖，随着LiCL浓度的增加， BrDU 细胞阳性率细胞在 10mM，20mM，40mM 处理 24h 后分别为 57. 91 士6. 57%, 23. 48士3. 19% 和9. 67士2. 45% (见图10A)，呈现随LiCL干预浓度增加而增殖降低趋势(见图10B)。同时，Wfestern blot检测显示随着LiCL浓度的增加，β-catenin蛋白表达也逐渐增强(见图 10C),从而发挥显著的抑制效应。3、LiCL抑制角质形成细胞增殖的机理研究 3. 1 LiCL诱导角质形成细胞发生S期阻滞
为进一步了解LiCL对角质形成细胞细胞周期的影响，我们采用流式细胞仪检测了细胞周期的分布情况。如图11所示以不同浓度的1^仏处理对11，4811，7211，细胞周期发生明显改变。特别是在72h，随剂量增加，S期与M期细胞明显增多，尤以M期为主，Gl期细胞显著降低，结合前述MTS/PMS检测结果可知，细胞发生了 S期与M期的阻滞。3. 2 LiCL对β -catenin及TGF β信号通路相关蛋白的影响
如图12所示=LiCL干预处理可引起β-catenin蛋白表达上调，且其上调水平与浓度有一定相关性。与此同时，随着浓度的增加，细胞增殖指标PCNA蛋白水平亦显著降低，结合前面的MTS/PMS检测结果，提示细胞增殖受到抑制。
综上所述，LiCL可模拟激活经典Wnt信号通路，特异性上调β -catenin的核表达， 显著抑制角质形成细胞的增殖和迁移，其作用机制与诱导细胞S期阻滞、激活TGF β凋亡信号通路相关。实施例2
AS-IV改善LiCL对角质形成细胞的增生抑制
在利用LiCL模拟激活经典Wnt信号通路下，我们观察AS-IV对角质形成细胞增生的影响。结果如图5所示，经20mM的LiCL干预，细胞增生得到明显抑制，而不同浓度的AS-IV对这一抑制均有明显的纠正作用，可改善细胞受到的抑制情况，其作用效果在72小时最强。 由图6可以看出，随着AS-IV浓度的升高，纠正作用越明显。实施例3
AS-IV改善LiCL对角质形成细胞的迁移抑制
为观察AS-IV在体外对角质形成细胞的迁移功能影响，我们用LiCL模拟激活经典Wnt 信号通路后，采用刮擦实验予以证实。结果显示如图7A所示，LiCL激活下的角质形成细胞，其迁移能力明显减弱，刮擦损伤需要更长的时间修复，而在加入表皮生长因子(EGF)或 AS-IV的对照组，其细胞迁移抑制效应均能在一定程度上得到改善。如图7B所示，LiCL处理的创缘角质形成细胞免疫荧光显示核表达β-catenine，LiCL干预后的人工划痕边缘， 角质形成细胞迁移阻滞在β-catenine核表达最明显的地方，而AS-IV可降低这一效应，细胞迁移开始从非核表达的细胞突破。图7C显示的是三次平均迁移结果，提示AS-IV能够改善角质形成细胞的迁移。因此，该试验亦表明AS-IV改善角质形成细胞迁移功能与降低经典Wnt信号通路的过度表达有关。实施例4
AS-IV的纠正作用的机制研究
通过实施例2和实施例3，我们初步观察到LiCL模拟激活经典Wnt信号通路下， 对角质形成细胞具有两方面的影响，即抑制细胞增殖与迁移，而AS-IV对这一效应均有一定程度的纠正作用。下面探讨AS-IV是通过何种机制发挥作用的。1、AS-IV降低LiCL诱导角质形成细胞引起的β-catenin核表达
由于LiCL可明显上调Wnt信号通路中的β -catenin,因此，我们对AS-IV干预下的 β-catenin表达进行检测。借助荧光免疫检测，我们发现，LiCL干预角质形成细胞后， β -catenin表达明显增强，且呈现出典型的核表达。而显著促进细胞增殖的阳性对照组药物EGF并没有出现该现象，仍然为明显的膜表达。如图8A所示，在LiCL干预4 后加入 AS-IV，72h以后观察，发现由LiCL诱导的β-catenin核表达情况有所降低。进一步采用 Western blot法检测相关蛋白，结果如图8B所示，80 μ g/ml浓度的AS-IV，能显著降低LiCL 诱导的β-catenin上调。我们可以推断，在角质形成细胞中，LiCL可激活抑制细胞增殖与迁移，且与经典 Wnt信号通路激活，上调β-catenin及其相关下游调控蛋白密切相关。而AS-IV能纠正这一效应的机制，与拮抗这一过程有关。2、AS-IV降低LiCL对角质形成细胞S期阻滞效应
如实施1所述，LiCL模拟激活经典Wnt信号通路可观察到角质形成细胞阻滞于S期， 细胞增殖水平明显降低，为观察AS-IV对细胞周期的影响，我们在LiCL干预模型基础上，采用AS-IV同步处理，4 后，流式细胞仪检测显示，LiCL诱导的角质形成细胞S期阻滞得到一定程度改善(图9)。对照组细胞GO期，S期与G2/M期细胞百分比分别为50. 83士0. 12%， 29. 69士 1. 83%和19. 14士2. 17%，提示大部分细胞均处于GO期。经LiCL干预48h后， GO期细胞降低至37. 22士2. 03%，而S期细胞显著增加至48. 81 士7. 43%，G2/M期细胞则同步降低为13. 88士5. 42%。 经AS-IV同步干预的角质形成细胞组，其S期细胞则降至 35. 08士2. 14%，与LiCL干预组比较具有统计学差异(P=O. 019)，与正常对照组比较亦有统计学差异(P=O. 039)。同时，G2/M期细胞增加至19. 50士 1. 42%，与正常对照组比较无统计学差异(P=O. 690)，提示AS-IV同步处理的角质形成细胞可越过S期进入G2/M期，进行细胞增殖。同时，我们检测了细胞增殖指标PCNA，结果如图10所示，显示反映细胞增殖水平的 PCNA蛋白在LiCL处理后表达量明显降低，而在AS-IV同步干预下，PCNA蛋白表达有一定程度上调。另外，经典Wnt信号通路下游的表达基因c-myc的表达则有一定程度降低，亦从侧面证实AS-IV可减弱LiCL对经典Wnt信号通路的激活。3、BrDU检测显示AS-IV提高LiCL干预下的细胞阳性率
实施例1已经表明AS-IV可降低LiCL诱导的细胞S期阻滞，为了解细胞在S期细胞增殖的情况，我们采用BrDU掺合法进一步检测。结果如图IlA所示，AS-IV可使20mM的LiCL 干预下细胞增殖明显增多，如图IlB所示，显示AS-IV可使得20mM的LiCL干预下，角质形成细胞的 BrDU 阳性率由 23. 48士3. 19% 提升至 31. 05士7. 75% (p=0. 03)。Western bot 同时检测β-catenine蛋白表达，发现AS-IV同时降低了 β-catenine的表达(图11C)。综上所述，LiCL模拟激活经典Wnt信号通路可诱导角质形成细胞增殖抑制和迁移，使细胞阻滞于S期。而AS-IV可减弱这一抑制效应，其作用机理与降低β-catenine蛋白核表达，降低LiCL对角质形成细胞S期阻滞效应和下调通路下游基因有关。而我们知道，慢性皮肤溃疡疾病的创面愈合困难是因为经典Wnt信号通路过度激活，导致β -catenine蛋白核表达过量，进而导致下游c-myc等基因过量表达，最终抑制角质形成细胞的增殖和迁移，即创面愈合的上皮化进程。而创面上皮化又是创面愈合的关键步骤，因此，AS-IV对于加快创面愈合的上皮化进程，促进创面愈合和治疗慢性皮肤溃荡，将发挥重要的作用。实施例5
AS-IV治疗创面愈合的临床试验
称取6.3g的AS-IV粉末(购自上海中国药品生物制品鉴定所)，加入1000ml 95%的乙醇。使用前，70°C水浴，充分溶解。病例来源2008年3月-2009年10月在上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院皮肤科住院及门诊慢性皮肤溃疡患者，共计63例。其中男性34例，女性四例；年龄18-80 岁，平均(50. 02士 14. 35)岁。随机分为治疗组21例，外用本实施例制备的AS-IV溶液，对照组21例，外用生肌散(购于天津宏仁堂药业有限公司)，空白组21例，外用生理盐水。治疗方法三组治疗方法均是用消毒棉签蘸取涂抹物，直接涂到慢性皮肤溃疡的病灶处，一日3次，连续使用4周。疗效评价标准参考国家中医药管理局制定的《中医外科病证诊断疗效标准》，治疗4周后进行疗效评价。疗效等级分为痊愈创面完全愈合，临床症状消失；显效创面缩小75%，临床症状消失；好转创面缩小25%，临床症状改善；无效创面缩小不足25%，临床症状无改善。临床试验结果如表1所示。表 权利要求
1.黄芪甲苷在制备促进创面愈合上皮化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的上皮化为角质形成细胞的增殖。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的上皮化为角质形成细胞的迁移。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的创面愈合上皮化是慢性皮肤溃疡的创面修复。
全文摘要
本发明涉及黄芪甲苷在制备促进创面愈合上皮化药物中的应用，所述黄芪甲苷可以纠正氯化锂模拟激活经典Wnt信号通路下对角质形成细胞增殖和迁移的抑制效应，因此它对创面愈合过程中的上皮化阶段有促进作用，可用于制备治疗慢性皮肤溃疡或其它皮肤创面的药物。本发明优点在于发掘了黄芪甲苷在制药上的新用途，开拓了一个新的应用领域；黄芪甲苷可促进角质形成细胞的增殖和迁移，即加快创面愈合过程中的上皮化进程，因此，具有治疗创面愈合的功效，为防治慢性皮肤溃疡提供了重要的临床依据；黄芪甲苷物质原料来源丰富、价格低廉、制备工艺简单，具有广阔的产业化前景，适于广泛推广使用。
文档编号A61K31/7048GK102349925SQ201110242219
公开日2012年2月15日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者徐蓉, 李斌, 李欣, 李福伦, 王一飞, 范斌, 陈洁 申请人:上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院