专利名称：一种促进皮肤创面愈合的生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，特别涉及一种可促进皮肤创面愈合的，含有干细胞的生物制剂。
背景技术：
随着社会经济的发展和工业化程度的日益提高，创伤与其他意外伤害所致的伤亡比例大幅增加，已成为当今社会主要致死性疾病之一。皮肤是人体最大的器官，是与外界环境接触的屏障。皮肤的创伤愈合是一个复杂的生物学过程，它启动一系列复杂的生物学事件，包括炎症、组织新生及组织重构。但是因为皮肤直接与外界环境相接触，皮肤创伤，特别是大面积的皮肤创伤，其修复是比较困难的。常见的皮肤创面修复制剂有以下几种。1.传统型敷料
传统型的敷料主要是由棉、软麻布、纱布等材料组成，其特点是具有良好的吸水性，从而能保持创面的干燥。但传统型敷料不能有效地阻止创面被感染。而且传统型敷料容易与刨面发生粘连，去除时很可能再次使刚恢复的创面受损。改进的油纱布和抗菌纱布，使传统型人工皮肤具有了防粘连和抗菌作用。2.合成型敷料
高分子薄膜具有良好的弹性和透气性，常用材料有聚氨酯、聚乙烯、硅橡胶、聚四氟乙烯等。但由于其吸湿性和透水性不良，往往导致创面处形成积液而导致细菌的繁殖，因此高分子薄膜多用于表皮损伤，对于大面积的皮损不适合。高分子海绵体是高分子材料形成的三维网状结构物，比薄膜更有利于新组织的形成，而且透气性好、无创面粘连、质轻、舒适等特点。高分子凝胶体具有良好透气性和透水性，能抵御细菌的侵入，并能根据创面的外形而成型，不足之处在于缺乏耐用性和贴附性不好 3.生物型人工皮肤
生物型人工皮肤是取自于天然生物组织，主要包括自体皮、异体皮和异种皮。自体皮是所有人工皮肤中最理想的皮肤替代物。应用自体皮不但可以解决大面积皮损患者急迫的需要而且可以使创面完全恢复到正常皮肤的外观和功能，是真正永久的人工皮肤。但是存在来源有限和影响美观等缺点，使其使用受到了限制。异体皮主要来源于尸体皮肤。早在上世纪40年代，同种异体皮就已作为一种辅助治疗深度烧伤患者的临时覆盖物。同种异体皮肤具有粘附性好、可为创面提供生长因子等优点，不足之处在于可能传播艾滋病、肝炎等传染性疾病，而且不同来源的同种异体皮肤具有不同的免疫原性。4.组织工程型人工皮肤
组织工程型人工皮肤是近二十年来发展起来的，已知的组织工程皮肤有Apligraf， Intergra, Dermagraft等，这些进口的组织工程皮肤价格及其昂贵。国内的第一个也是唯一一个国家食品药品监督管理局批准的组织工程皮肤“安体肤”即将上市，还没有大量开始使用，安全性和稳定性有待验证。
随着组织工程研究的发展，干细胞研究为创伤修复提供了新思路。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)起源于中胚层，具有较强的自我更新和多向分化的潜能，经过适当的的诱导分化可以向成骨、肌腱、神经细胞、 皮肤细胞等不同的组织细胞分化。在机体的组织损伤修复过程中，BMSCs在损伤组织的特殊信号作用下，迁移至损伤部位，在局部增殖，并依据不同的损伤信息分化为不同的功能性细胞。移植迁移到组织损伤部位的BMSCs，通过两种功能发挥其组织损伤的修复作用，一是在局部微环境作用下，定向分化为特定类型的功能性细胞，直接参与组织修复；二是通过分泌多种生物活性物质，如生长因子等，改善损伤部位的再生微环境，间接促进组织修复。目前，已有实验研究结果证实BMSCs在促进创面愈合方面起到积极的作用。 Badiavas将骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植到深II度烧伤创面，发现其明显促进创面的愈合，其作用强于成纤维细胞。付小兵等将BMSCs移植至猪深度烧伤创面，发现创面愈合速度明显加快，表皮增厚，真皮神经纤维增多，大大改善了创面愈合质量。文献报道BMSCs还参与表皮、汗腺及创面血管的重建。这些研究结果证明BMSCs是非常好的皮肤组织工程的种子细胞。虽然BMSCs可以很好的促进创面愈合，但是，有必要进一步提高其修复效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可更好地促进皮肤创面愈合的生物制剂。本发明所采取的技术方案是
一种促进皮肤创面愈合的生物制剂，由活化素B、骨髓间质干细胞及可接受的药用辅料组成。优选的，制剂中活化素B的浓度为0. 5 20ng/ml，骨髓间质干细胞的浓度为1 8X IO6 个/ml。本发明的有益效果是
本发明的制剂中，活化素B与骨髓间质干细胞存在协同作用，联合使用，可以更好的修改皮肤创面。
图1是BMSCs相关标志物抗原的表达图； 图2是不同处理组的创面愈合的效果图3是BMSCs参与皮肤创面愈合的效果图； 图4是术后不同时间点的创伤组织学切片； 图5是不同注射方式的创伤愈合过程图； 图6是活化素B诱导BMSCs肌动蛋白的重组和迁移的效果图； 图7是活化素B诱导BMSCs骨架结构变化和细胞迁移的效果图； 图8是Western blot分析结果。
具体实施例方式一种促进皮肤创面愈合的生物制剂，由活化素B、骨髓间质干细胞及可接受的药用辅料组成。优选的，制剂中活化素B的浓度为0. 5 20ng/ml，骨髓间质干细胞的浓度为1 8X IO6 个/ml。下面结合实施例，进一步说明本发明。以下实验中，使用的骨髓间质干细胞(BMSCs)取自南方医科大学动物中心SPF级 SD大鼠的胫骨和肱骨骨髓做原代培养所得。如无特别说明，ACT指活化素。免疫细胞化学检测BMSCs表面标志抗原表达
第3代BMSCs以4-5 X IO5/孔的密度接种于12孔板中，待细胞长至90%，吸去培养基， PBS 漂洗(3X5min)，4% 多聚甲酸固定 lOmin，PBS 漂洗(3X5min)。0. 5%TritonX-100 细胞穿孔 15min，PBS 漂洗(3X5min)，l%BSA 封闭(RT, 30min), CD44 (兔抗大鼠，1:10)、CD90 (小鼠抗大鼠，1:100)和 CD29 (兔抗大鼠，1:200)，CD80 (兔抗大鼠，1 100)，37°C 2h，PBS 漂洗(3 X 5min)，分别红色羊抗兔二抗(1 200)、红色驴抗小鼠二抗(1 200)和红色羊抗兔二抗(1:200)，RT lh, PBS 漂洗(3X5min)，Hoechst33258 (1:500)复染细胞核 lOmin，PBS 漂洗(3X5min)，封片观察。显微镜拍照(Leica DM4000B),20X倍镜下选取5_7个视野，计数BMSCs表面标志抗原阳性表达率。第3代BMSCs接种于12孔板中cover glass上，待细胞长至90%融合时，固定后进行免疫组织化学检测BMSCs表面标志物抗原表达红色荧光染料示⑶四，⑶44和⑶90阳性表达，而⑶80阴性表达。H0echst33258复染细胞核，蓝色荧光示细胞核。结果如图1所示，从图中可以看出，该细胞为骨髓间充质干细胞，而非造血干细胞等其他细胞。继续培养第3代BMSCs得到第4代BMSCs。实验处理创伤模型
24只健康成年SPF级SD大鼠随机分为四个组PBS对照组，BMSCs移植组，Activin B 注射组和Activin B结合BMSCs移植组。10%水合氯醛(0. 003ml/g)腹腔注射麻醉，SD大鼠背部两侧剪毛后用蜂蜜脱毛冻蜡脱毛，做面积为Icm2正方形切口，深达皮下。创伤制造后，在创伤处局部注射，注射量是0. 4ml/大鼠。其中，BMSCs移植组中，BMSCs的注射浓度是1 X IO6 BMSCs/ml ；Activin B注射组中，Activin B的注射浓度是5ng/ml ；Activin B结合BMSCs移植组中，Activin B的注射浓度是5ng/ml、BMSCs的注射浓度是IXlO6 BMSCs/ml。术后动物自由进食、水。术后每天用细Mark笔把各组未愈合创面面积描记在透明薄膜上，数码相机在相同的条件下对描记下的图像拍照，IPP图像分析系统计算未愈合创面面积，计算创面愈合率。愈合率=(原始创面面积一未愈合的创面面积)/原始创面面积 X100%OH&E 染色
术后3d、7d、14d、21d取伤口周围0.5cm皮肤，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗， 乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片(5 μ m)，二甲苯脱蜡，乙醇逐级复水，常规的苏木精伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色。对大鼠创面愈合进行组织学观察。实验照片如图2和图4所示，图中，Ep指表皮；D指正常皮肤；G指创口处肉芽组织，标尺为100 μ m。
结果发现与Activin B、BMSCs单独处理组及PBS对照组相比，Activin B结合 BMSCs处理组可以显著促进SD大鼠皮肤创面愈合(图2A)。在移植后第7天，Activin B 结合BMSCs处理组的创面愈合率显著高于Activin B、BMSCs单独处理组及PBS对照组(图 2B)，对第14天的创面进行分析，显示Activin B结合BMSCs处理组可以促进皮肤毛囊的再生(图2C术后14天的H&E染色)，这些显示Activin B结合BMSCs可以更好的促进急性创伤的愈合。实验结果如下
权利要求
1.一种促进皮肤创面愈合的生物制剂，由活化素B、骨髓间质干细胞及可接受的药用辅料组成。
2.根据权利要求1所述的促进皮肤创面愈合的生物制剂，其特征在于制剂中活化素B 的浓度为0. 5 20ng/ml，骨髓间质干细胞的浓度为1 8X IO6个/ml。
全文摘要
本发明公开了一种促进皮肤创面愈合的生物制剂，制剂由活化素B、骨髓间质干细胞及可接受的药用辅料组成。本发明的制剂，可以更好地促进皮肤创面愈合。
文档编号A61K35/28GK102552880SQ201110417590
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者张敏, 张琳, 张璐, 陈世萱, 陈英华 申请人:南方医科大学