专利名称：干细胞归巢的快捷方法
技术领域：
本发明所涉及的是一种干细胞归巢的快捷方法，具体说是利用磁场使干细胞迅速准确归巢。
背景技术：
干细胞是指一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，在适当的诱导条件下，可分化为不同的功能细胞。随着干细胞生物学研究的不断深入，以干细胞为种子细胞的细胞治疗在糖尿病、肝衰竭、心肌梗塞、早老性痴呆、帕金森病、视网膜损伤、癌症、血友病、脊髓损伤、先天性免疫性疾病等难治性、终末期疾病的治疗中越来越显示出良好的应用前景。研究中发现，哺乳动物体内多种组织(包括骨髓、脐带血等)来源的成体干细胞均具有“多能性”(即具有向多种组织细胞分化潜能)的特点，比如，其中的⑶34+Lin_细胞向造血系统各系细胞分化；c-Met+ β 2Μ细胞可以向成熟的肝细胞分化；间充质干细胞可以向神经元、心肌细胞或胰岛β细胞分化等等。大量的基础研究及临床实践证实，干细胞在适当的诱导条件下，在体内外均可定向分化为功能完备的肝细胞。如何选择合适的诱导方法，促进移植干细胞向肝脏迁移、分化，恢复肝脏解剖学结构及生理功能，一直是众多学者努力探索的问题。一般说来，只有足够数量的干细胞向特定组织归巢，才能有效分化成特定组织细胞，发挥生理功能。目前，干细胞移植的常用方法有特定组织直接注入和外周静脉输注法等。前者虽然可以保证干细胞能相对集中于特定组织中，但需通过开放性的手术实现，操作复杂，受者创伤大，并发症多；后者方法简单，易于操作，但是由于选用的干细胞随血液循环流至全身各个器官，因而易于被某些富含网状内皮系统的组织吞噬、滞留，使得定位于特定组织的干细胞数量相对减少，严重影响其修复功能的发挥。而寻找一种高效、简单的干细胞归巢方法具有非常重要的意义。如何诱导干细胞归巢、分化，已经成为当前研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种快捷高效的干细胞归巢方法。本发明所提供的干细胞归巢方法具体步骤包括a)用粒径为40 60nm的免疫磁珠标记干细胞；b)将标记后的干细胞注入特定组织的循环系统内；c)将正负两个磁极指向所述特定组织相对应的体表部位，在所述循环系统的循环过程中，所述干细胞迅速准确归巢于所述特定组织内；所述正负两个磁极间的磁场强度为8400 18600GS。其中，所述干细胞为具有特定细胞表面标志的、具有多向分化潜能的干细胞，可以来源于人骨髓、流产胎儿的不同组织、胎盘、脐带血或来自大鼠骨髓。如以大鼠骨髓c-Met+β 2M细胞为例，采用免疫磁珠标记所述干细胞的过程如下将针对所述干细胞表面标志性抗原的特异性抗体与所述干细胞孵育，经清洗后再与偶联有抗所述特异性抗体的免疫磁珠孵育，清洗得到所述标记后的细胞。所述特异性抗体为兔抗大鼠c-Met抗体和β2Μ抗体；所述免疫磁珠偶联有山羊抗兔IgG。
为了能提高干细胞在特定组织中的归巢效率，所述两个异性磁极的材料可选用铁氧体烧结永磁性材料，两个异性磁极呈圆柱状，且两磁极靠近相对的一端直径缩小；所述两个异性磁极端面的距离为5 25mm。此时，在两个磁极之间形成高强度、高梯度的磁场，磁场的高强度使免疫磁珠标记的干细胞具有良好的归巢能力，磁场的高梯度则使免疫磁珠标记的细胞能选择性地滞留于特定组织而不是其他组织。本发明将直径在35纳米左右的免疫磁珠通过抗原抗体亲和反应来特异性标记细胞，由于该免疫磁珠的超顺磁性，使得特定细胞在磁场的作用下迅速归巢于特定组织，而且当磁场消失后，免疫磁珠失去磁性，在特定组织内的细胞不会因为相互吸引聚集成球而导致血管阻塞。在本发明中，免疫磁珠的主要制备原料均可以被生物体吸收、排泄，对机体无毒副作用。本发明合理利用超顺磁性磁珠的磁特性，采用磁场定向技术使干细胞向特定组织归巢，具有归巢高效快捷等优点，有很好的临床应用前景。
图1为干细胞的免疫磁珠标记；图2为细胞在磁场中的筛分；图3A为归巢仪的结构；图3B为图3A的俯视；图4为体外免疫磁珠标记细胞的富集操作流程图；图5为免疫磁珠标记的干细胞向大鼠肝的归巢照片。
具体实施例方式实施例1、C-Met +β 2M细胞的归巢本实施例以肝损伤大鼠模型的肝脏作为靶组织。本实施例中所用免疫磁珠购于清华大学材料学院，该磁珠偶联了山羊抗兔IgG，粒径在35nm左右，具有良好的超顺磁性。1、大鼠骨髓单个核细胞的获得断颈处死的大鼠经75%乙醇消毒后，用剖腹的方法取出股骨，以含10%胎牛血清的DMEM培养液作为冲洗液，用5ml注射器反复冲洗骨髓腔，用100目筛网过滤冲出的细胞制成大鼠骨髓单细胞悬液，1200rpm离心后，将细胞重悬于PBS中，经Ficoll (相对密度1.083g/ml)密度梯度离心后收集大鼠骨髓单个核细胞，洗涤后重悬于PBS中。2、用两步间接免疫磁珠分离方法富集并标记大鼠骨髓来源的c-Met+β 2M细胞如图1所示，将步骤I所得细胞I先与兔抗大鼠β 2Μ抗体2于4°C孵育30min，经PBS缓冲液洗涤后，再将其与偶联了山羊抗兔IgG4的免疫磁珠3于4°C孵育30min，再经PBS洗涤，从而使凡是表达β 2Μ的细胞都可被免疫磁珠标记。如图2所示，将该群细胞流过位于两个磁极9之间的塑料软管7，其中被免疫磁珠所标记的表达β2Μ的细胞5(即阳性细胞)滞留于磁场内，而未被标记的细胞6(即阴性细胞)流出磁场，用Eppendorf管8收集细胞6 ;而滞留于磁场内的细胞5在去掉磁场后用缓冲液冲洗收集。按照上述操作将收集到的β 2Μ-细胞群6先后与兔抗大鼠c-Met抗体及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG孵育，再经PBS洗涤。这样，在β2Μ-的细胞群中，凡是表达c-Met的C-Met+ β 2Μ细胞均被免疫磁珠所标记，流经磁场时，该细胞滞留于磁场内，将塑料软管移离磁场后，用PBS将细胞冲出，获得目的细胞-免疫磁珠标记的c-Met+β2Μ细胞。为了有效检测移植细胞在受者体内的归巢效率，该群细胞以荧光染料DAPI标记并充分洗涤。3、近交系F344大鼠的饲养和肝损伤模型的制备雄性一级近交系F344大鼠，体重180 200g，室温20 22°C饲养，光线12小时明暗交替，自由饮水、进食。将丙烯醇按O. 62umol/kg体重经腹膜下注射至F344大鼠体内，制备药物所致大鼠肝损伤模型，常规饲养3天后备用。4、C-Met+ β 2M 细胞的归巢如图3Α、图3Β所示，磁归巢定位仪包括有一支架10，支架10内上下相对设置有二磁极，下磁极11垂向设置在支架10的底面，上磁极12与下磁极11相对应的设置在支架10的顶面，上磁极12连接于螺杆14下端，而螺杆14上端设置有转动把手13。通过旋转转动把手13，可以使螺杆14转动，从而使螺杆相对支架10的顶面沿垂向移动，也就可以带动上磁极12移动，借此来改变上、下磁极之间的距离。二磁极成圆柱状，为了保证两磁极间的磁场强度，两磁极靠近相对的一端直径缩小，且直径缩小的越多，两磁极间的磁场梯度越大。此外，支架及二磁极的材料均选用铁氧体烧结永磁性材料，可以有效的提高磁极间的磁场强度。将大鼠固定于磁归巢定位仪中，使肝脏所对应的体表投射区正对上下两个磁极，然后通过大鼠外周静脉(尾静脉或股静脉)将步骤2所得目的细胞一荧光素标记的携带免疫磁珠的C-Met+ β 2Μ细胞输注入体内，这样，标记了免疫磁珠的目的干细胞可在磁力的引导下沿血液循环向分布于肝脏内的各级血管富集，随着大鼠在磁场内停留时间的延长，目的干细胞便可穿越血管内皮细胞进入肝组织内整合入肝细胞板，从而使c-Met+β 2Μ细胞归巢于肝组织。 实施例2、细胞归巢效果的检测体外富集按照实施例1中步骤I 2的操作得到免疫磁珠标记的β 2Μ细胞，PBS洗涤。然后配制含20%葡聚糖的生理盐水作为流动相，将所得细胞悬浮于其中。调节蠕动泵流速为
O.1 15cm/s,使磁珠标记的细胞流过磁场(调节两磁极间的距离1. 6 2. 5cm,使场强波动于1. 33 O. 85T)，显微镜下计数流出和流入细胞的比值，得到磁场对磁珠标记细胞的富集效率。操作过程如图4所示，图中15为加有免疫磁珠标记的β 2Μ细胞的20%葡聚糖生理盐水溶液；16为蠕动泵；17为磁场的两个磁极；18为富集的细胞。结果表明，随着磁场强度的增加，β 2Μ细胞富集效果逐渐加强，当磁场强度在O. 75Te以上时，均能使磁珠标记的细胞在磁极对应的管道局部很好地富集，其效率达到95%以上。2、体内归巢取近交系F344大鼠，雌雄不限，按实施例1步骤4的方法制备肝损伤模型。动物分为3组G1外周静脉(股静脉)移植+磁场；G2开腹经门静脉移植；G3 :外周静脉移植(对照组，不加磁场)。其中，Gl组的操作如下I)按实施例1中步骤I 2的方法制备免疫磁珠标记的C-Met+ β 2Μ细胞，然后加入DAPI染液，室温避光染色30min，用PBS洗4次，按IxlOVmL将细胞重悬于DMEM/F12培
养基中；
2)大鼠常规麻醉后置于磁归巢定位仪中四肢固定，使其肝脏体表投影部位正对上下两个磁极；3)于腹股沟切开皮肤暴露股静脉，经股静脉缓慢注入处理好的细胞悬液，术后缝皮，灯照保暖，术后不同时间将大鼠移离磁场，正常饲养；4)术后分别于3d和IOd活杀大鼠，取肝组织制备冰冻切片，于荧光显微镜下观察荧光标记细胞在受体大鼠肝内的分布。结果如图5所不，图5A为经门静脉移植后,大鼠固定于磁场内20h细胞在肝脏的归巢，图5B为门静脉细胞移植无磁场(对照)。结果表明，经股静脉移植DAP1-免疫磁珠标记的细胞后,大鼠固定于磁场内20h与2h者相比，标记细胞在肺内的截留明显减少，而在肝内的停留明显增多；初步统计结果表明，滞留于肝脏内的细胞数，依次为磁场内20h >经门静脉移植>磁场内2h和股静脉移植(无磁场，对照组)，标记细胞在肺内的滞留与此相反。表明采用本发明方法能有效地使细胞归巢于靶组 织内。
权利要求
1.一种干细胞归巢的快捷方法，具体步骤包括a)用粒径为40 60nm的免疫磁珠标记干细胞山)将标记后的干细胞注入特定组织的循环系统内；c)将正负两个磁极指向所述特定组织相对应的体表部位，在所述循环系统的循环过程中，所述干细胞迅速准确归巢于所述特定组织内；所述正负两个磁极间的磁场强度为8400 18600GS。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述干细胞来源于人骨髓、流产胎儿的不同组织、胎盘、脐带血或来自大鼠骨髓。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫磁珠标记所述干细胞的过程如下将针对所述干细胞表面标志性抗原的特异性抗体与所述干细胞温育，经清洗后再与偶联有抗所述特异性抗体的免疫磁珠温育，清洗所得到的标记干细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述干细胞为来源于大鼠骨髓的c-Met+β 2M细胞；所述特异性抗体为兔抗大鼠c-Met抗体和β 2Μ抗体；所述免疫磁珠偶联有山羊抗兔IgG。
5.根据权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于所述两个异性磁极的材料为铁氧体烧结永磁。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述两个异性磁极呈圆柱状，且两磁极靠近相对的一端直径缩小；所述两个异性磁极端面的距离为6 30mm。
全文摘要
本发明提供的方法可使干细胞快速有效归巢。本发明所提供的干细胞归巢方法包括如下步骤1)用粒径为40～60nm的免疫磁珠标记干细胞；2)将标记后的干细胞注入特定组织的循环系统内；3)将正负两个磁极指向所述特定组织相对应的体表部位，在所述循环系统的循环过程中，所述干细胞迅速准确归巢于所述特定组织内；所述正负两个磁极间的磁场强度为8400～18600Gs。本发明创新性地利用超顺磁性磁珠的磁特性，采用磁吸引技术使干细胞在特定组织归巢，可帮助干细胞在特定组织分化成有功能的成体细胞，为干细胞的临床应用开拓了新方向。
文档编号A61N2/00GK103055418SQ201110323619
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者田杰 申请人:北京清美联创干细胞科技有限公司