专利名称：迟钝爱德华菌外膜蛋白0245在制备疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及迟钝爱德华菌外膜蛋白0245在作为迟钝爱德华菌抗原、制备迟钝爱德华病疫苗中的应用。
背景技术：
迟缓爱德华菌(FdwairkidJa是目前水产养殖中危害极大的病原菌之一， 能够侵入宿主细胞内，在宿主内生长繁殖，最终导致细胞质膜的裂解，引起鱼类产生迟缓爱德华菌病(我国的三类水生动物疫病)。这种胞内寄生特性对其致病性具有重要作用，可引起鱼类腹部积水肿胀、体表出血、肠内出现黏液，造成鱼类的大量死亡，严重危害了鱼类的养殖，带来了巨大的经济损失。对这类致病菌的防治主要包括药物即抗生素防治以及免疫防治。抗生素虽然在最初的使用中取得了巨大的进展，然而随着抗生素的广泛使用，也出现了一系列的相关问题，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐药菌的产生，细菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐药性而人为地加大剂量，加剧耐药性的产生。因此，研制以具有免疫保护作用的高效中和抗原为成分的疫苗具有广阔的应用前景。在各种动物疾病的防治中，疫苗的使用是一个具有低成本、高效的方法，并且已经有部分疫苗得到大规模使用并取得了不错的防治效果。疫苗种类很多，以细菌为例，包括全菌疫苗、亚单位疫苗以及DNA疫菌等。从实际应用的情况来看，全菌疫苗虽然具有制作相对简单而且成本也较低的优点，但它也存在不少由于使用全菌体而固有的一些缺点，如减毒全菌疫苗可能出现菌株突变而导致的毒性恢复等不良后果；灭活全菌疫苗则往往由于对细菌的灭活过程而导致一些免疫保护基团活性的改变，影响免疫保护的效果。而且对全菌疫苗来说，由于细菌成分的复杂性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，会导致机体产生不良反应。并且常规制得的全菌疫苗免疫保护效果不理想。然而，全菌疫苗仍然是目前最为主要的疫苗种类。其原因可能与高效中和抗原的发现和鉴定困难有关。基因组学、蛋白质组学和转录分布图技术的发展为细菌疫苗提供了新的契机。基因工程疫苗由于高效，且摆脱了传统疫苗的种种缺点等特征，成为疫苗研究的重点，具有广阔的应用与开发前景。外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面对宿主的体液及组织，细菌利用外膜蛋白进行黏附、侵入和炎症等生理活动，更容易被宿主识别作为攻击目标，使得革兰氏阴性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可以刺激体液免疫，而且对细胞免疫亦有刺激作用。近年来，细菌的一些外膜蛋白已经被证实具有良好的免疫原性，用其制备基因工程疫苗具有良好的前景。如已发现迟钝爱德华菌外膜蛋白的P33k、3^、3^、^k可能为保护性抗原，可作为疫苗的候选成分；外膜蛋白S2和OmpA具有免疫原性，研究者多集中于上述两种外膜蛋白的研究。如张亚宁等(迟缓爱德华菌HBOl 外膜蛋白0mpS_2基因的克隆表达及其免疫原性研究，细胞与分子免疫学杂志，2011年10 期)构建了重组菌株BL21(DE3) (pET-28a-0mpS2)，制备防治鱼类爱德华氏菌病的基因工程疫苗。虽然该基因工程疫苗具有一定的免疫作用，但是由于基因长度过大，制备上不是太方便。关于迟钝爱德华氏菌外膜蛋白0245的功能还未见报道，也未见任何关于其具有免疫调节功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种迟钝爱德华菌外膜蛋白 0245在免疫调节中的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
经过研究发现，迟钝爱德华菌外膜蛋白0245具有较强的免疫原性，可以作为迟钝爱德华菌的抗原应用。更进一步，该迟钝爱德华菌外膜蛋白0245可以制备成防治迟钝爱德华菌病的疫苗使用。所述迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的制备方法如下
(1)以迟钝爱德华菌EIB202全基因组为模板，SEQID NO:广2为引物，扩增迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的基因；
(2)用限制性内切酶feoTPI和损ol分别酶切扩增的迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的基因和pET-3h表达载体后连接，构建重组表达载体，转化大肠杆菌BL21，表达蛋白、纯化。所述迟钝爱德华病菌疫苗制备方法如下将纯化的迟钝爱德华菌外膜蛋白0245 水溶液与弗氏佐剂等体积混合均勻形成油包水乳剂，迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的浓度可根据需要任意选择，只要能够满足最终注射剂量在250(Γ10000微克蛋白/千克体重的使用范围内即可。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
对迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的主动免疫保护试验结果表明ΕΤΑΕ_0245免疫小鼠后还可以提高小鼠对迟钝爱德华菌的抵抗力。由此可见，ΕΤΑΕ_0245具有明显的免疫保护作用，可用作疫苗组分。
图1为ΕΤΑΕ_0245、ΕΤΑΕ_2675和ETAEJ9!35基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析(M =DNA Marker ；泳道 1. ETAE_2935 PCR 产物；泳道 2. ETAE_2675 PCR 产物；泳道 3. ETAE_0245 PCR 产物。图 2 为 ETAE_0245、ETAE_2675 和 ETAEJ9!35 基因重组子双酶切鉴定(Μ :DNA Marker,泳道1、2和3分别为ETAEJ9!35、ETAEJ675和ETAE_0245重组子质粒的双酶切)。图3为聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ETAE_0245、ETAEJ675和ETAEJ935基因表达产物(泳道1、2和3分别为ETAE_2935、ETAE_2675和ETAE_0245 ；BSA为牛血清白蛋白对照)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册QOOl by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1迟钝爱德华菌外膜蛋白0245基因、2675基因和四35基因克隆的制备和鉴定
在该实施例中，将全长的迟钝爱德华菌外膜蛋白0245基因(ETAE_0M5)、ETAEJ675和 ETAE_2935的编码序列或片段构建入大肠杆菌蛋白质原核表达载体中，以达到表达和提纯目的蛋白。1.迟钝爱德华菌外膜蛋白0M5J675和四35基因的扩增
根据NCBI公布的迟钝爱德华菌EIB202的全基因组序列(Genbank登录号NC_013508) 设计了 3对引物，引物序列见表1。为便于克隆和表达载体的构建，在引物上分别引入限制性内酶位点i^o/PI和损ol Γ划线部分)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 PCR反应条件的确立以热变性法获得的迟钝爱德华菌ΕΙΒ202全基因组为模板，在25ml反应体系中加PCR反应缓冲液2. 5ml, 10mmol/L dNTPlml，5，和3，引物各10mmol/L，模板DNA l-2ml，补水至25ml。PCR循环参数为-MV, 2 min，然后进行30个PCR循环(94°C变性60s， 60°C退火60s，72°C延伸60s)后继续在72°C延伸10 min，4°C保存。用0. 7%琼脂糖胶电泳后，扩增的DNA片断长度与预测的片段大小类似，ETAE_0245约63;3bp，ETAEJ675约57!3bp， ETAEJ9!35 约 873bp (图 1)。回收 DNA 片断。表1 3个迟缓爱德华氏菌外膜蛋白基因克隆信息表
权利要求
1.迟钝爱德华菌外膜蛋白0245在作为迟钝爱德华菌抗原中的应用。
2.迟钝爱德华菌外膜蛋白0245在制备迟钝爱德华病菌疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的制备方法如下(1)以迟钝爱德华菌EIB202全基因组为模板，SEQID NO:广2为引物，扩增迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的基因；(2)用限制性内切酶feoTPI和损ol分别酶切扩增的迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的基因和pET-3h表达载体后连接，构建重组表达载体，转化大肠杆菌BL21，表达蛋白、纯化。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述迟钝爱德华病菌疫苗制备方法如下 将纯化的迟钝爱德华菌外膜蛋白OM水溶液与福氏佐剂等体积混合均勻形成油包水乳剂。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述迟钝爱德华病菌疫苗的注射剂量为 2500^10000微克蛋白/千克体重。
全文摘要
本发明公开了迟钝爱德华菌外膜蛋白0245在制备疫苗中的应用。实验研究发现，迟钝爱德华菌外膜蛋白0245具有明显的免疫保护作用，能够有效抵抗迟钝爱德华菌的感染，可作为亚单位疫苗的候选靶位。本发明还公开了迟钝爱德华菌外膜蛋白0245的表达及疫苗的制备方法，制备得到的疫苗对控制迟钝爱德华菌感染的免疫学防治具有十分重要的意义。
文档编号A61K39/02GK102397537SQ20111038715
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者刘洋, 张海丽, 彭宣宪, 李惠 申请人:中山大学