本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。
背景技术：
D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)
目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)
本发明首次从水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。
技术实现要素：
本发明从水生拉恩菌(Rahnella aquatilis)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。
本发明的技术方案如下：
1、菌株
本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Rahnella aquatilis ATCC 33071，购自美国ATCC菌种库。
2、D-乳酸氧化酶基因的克隆
提取Rahnella aquatilis ATCC 33071菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
3、D-乳酸氧化酶表达与纯化
将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。
4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析
以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。
酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。
5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯
拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。
产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：
对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％
式中SR为反应后(R)-对映体的峰面积，SS为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。
产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。
所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本发表明的有益之处：从Rahnella aquatilis ATCC 33071中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
实施例1
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
1、Rahnella aquatilis ATCC 33071 DNA的提取
将Rahnella aquatilis ATCC 33071菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
2、大肠杆菌感受态制备
(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。
(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。
(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。
(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。
(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。
3、D-乳酸氧化酶基因的克隆
(1)引物设计
设计引物序列为：
引物1：5'GCCGGGATCCTGGATAATCAGTCACTCATCGCC 3'
引物2：5'GCCGTCTAGATCAATCATGCCAGTTTTTCAACTTA 3'
(2)PCR扩增
用以上合成的两条引物，以Rahnella aquatilis ATCC 33071的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
本步骤中扩增体系为：
扩增程序为：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环
72℃，10min
PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)双酶切和连接
将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。
(4)转化
步骤：
1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。
2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。
5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。
6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。
实施例2
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。
1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。
实施例3
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为4.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为45℃。
实施例4
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，45℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 4.0条件下D-乳酸氧化酶酶活最高。
实施例5
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表2中。
表2 D-乳酸氧化酶对不同底物的活性
实施例6
根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：
表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果
由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种氧化酶及其应用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1692
<212> DNA
<213> Rahnella aquatilis ATCC 33071
<400> 1
atggataatc agtcactcat cgccacgctg aaagagattg ccggcagtcg ccacgtttta 60
accggcgaca gcaacactga acgttaccgc aaagggttcc gatccggtgg cggcaaagcg 120
ctggcggtgg tatttccgca aacgctgctg cagcaatggc aattgctcaa ggcctgtatc 180
gccgccgaca aaattgtcat tatgcaggcc gccaataccg ggctgaccga aggttcgacg 240
cccagcggtg acgactatga ccgcgacatt gtgattttca gcacgctgaa actagacaca 300
atccagttac tcgacggcgg ccatcaggtg atcggctttc ccggcagcac cctttataag 360
ctggaaaaaa tcctcaagcc ctacaaccgc gagccccatt cggtgattgg ctcatcctgt 420
atcggcgcat cggtggtcgg cgggatctgt aataattccg gcggttcgct ggtgaaacgt 480
ggcccggcgt ataccgaaat ggcactgtac gcacagattg atgcgcaagg tgagttacag 540
ctgattaatc atctgggtat taatcttggc gaaacgccgg aagaaatcct gacacgtctg 600
gaaaaaggcg attatctgga aaccgatatc cagcatgatc agcgtctggc gtcagatcac 660
gattatgcct cgcgtgtccg cgaagtggat gctgatacgc cgtcacgttt caacgccgat 720
cagcgacgtt tatttgaagc ctcgggttgt gcgggtaagc tggccgtttt cgccgtgcgg 780
ctggatacct tcccggcaga aacgcagcag caggtttttt acatcggcac caacgatact 840
gcggtgctga cagaattacg tcgtcagatc ctgcgtgatt tcgctaacct tccggttgcc 900
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ctgatgatcg acaaacttgg caccgacaag atgccggata tgtttactgc caaaggaaag 1020
ttcgatgcac acgccagtaa ggtccctttc ctgcctaaaa atttcagtga ccgcgtgatg 1080
caatgcctga gcaaagcttt gccgaatcat ctgccgccgc ggatgaaaca gtaccgcgac 1140
cggtttgaac atcacttatt gctgaaaatg tccggccccg gcattgacga agcccgaact 1200
tttttgacgc gtttctttag tgagggtcag ggtgatttct ttatctgttc cgccgatgaa 1260
ggcaagaaag ccttcctgca ccgcttcgct gccgccggtg cggccgtgcg ttatcacgcg 1320
gtacatgaaa aagaagtgga agatattctg gcactggata tcgcactgcg ccgcaatgac 1380
cgtgactggt tcgaaacttt gccggaagat atcgataatc agctggtggc aaaactgtat 1440
tacggccatt tcatgtgcca cgttttccat caggattaca tcgtcaaaaa aggcgcaaac 1500
agtaaggcgc tgaaacacag aatgttagaa ctgctcgatg ccaaaggcgc ggaatatccc 1560
gccgaacata acgtcggcca tttgtatctg gcgaaaccgc atctgaaaga attctaccgg 1620
caggccgacc cgaccaacag cttcaatccg gggatcggga aaaccagtaa gttgaaaaac 1680
tggcatgatt ga 1692
<210> 2
<211> 563
<212> PRT
<213> Rahnella aquatilis ATCC 33071
<400> 2
Met Asp Asn Gln Ser Leu Ile Ala Thr Leu Lys Glu Ile Ala Gly Ser
1 5 10 15
Arg His Val Leu Thr Gly Asp Ser Asn Thr Glu Arg Tyr Arg Lys Gly
20 25 30
Phe Arg Ser Gly Gly Gly Lys Ala Leu Ala Val Val Phe Pro Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Gln Gln Trp Gln Leu Leu Lys Ala Cys Ile Ala Ala Asp Lys
50 55 60
Ile Val Ile Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly Leu Thr Glu Gly Ser Thr
65 70 75 80
Pro Ser Gly Asp Asp Tyr Asp Arg Asp Ile Val Ile Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Leu Asp Thr Ile Gln Leu Leu Asp Gly Gly His Gln Val Ile Gly
100 105 110
Phe Pro Gly Ser Thr Leu Tyr Lys Leu Glu Lys Ile Leu Lys Pro Tyr
115 120 125
Asn Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser Ser Cys Ile Gly Ala Ser
130 135 140
Val Val Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly Gly Ser Leu Val Lys Arg
145 150 155 160
Gly Pro Ala Tyr Thr Glu Met Ala Leu Tyr Ala Gln Ile Asp Ala Gln
165 170 175
Gly Glu Leu Gln Leu Ile Asn His Leu Gly Ile Asn Leu Gly Glu Thr
180 185 190
Pro Glu Glu Ile Leu Thr Arg Leu Glu Lys Gly Asp Tyr Leu Glu Thr
195 200 205
Asp Ile Gln His Asp Gln Arg Leu Ala Ser Asp His Asp Tyr Ala Ser
210 215 220
Arg Val Arg Glu Val Asp Ala Asp Thr Pro Ser Arg Phe Asn Ala Asp
225 230 235 240
Gln Arg Arg Leu Phe Glu Ala Ser Gly Cys Ala Gly Lys Leu Ala Val
245 250 255
Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Ala Glu Thr Gln Gln Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Asp Thr Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Arg
275 280 285
Gln Ile Leu Arg Asp Phe Ala Asn Leu Pro Val Ala Gly Glu Tyr Met
290 295 300
His Arg Asp Ile Phe Asp Ile Thr Glu Val Tyr Gly Lys Asp Thr Phe
305 310 315 320
Leu Met Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys Met Pro Asp Met Phe Thr
325 330 335
Ala Lys Gly Lys Phe Asp Ala His Ala Ser Lys Val Pro Phe Leu Pro
340 345 350
Lys Asn Phe Ser Asp Arg Val Met Gln Cys Leu Ser Lys Ala Leu Pro
355 360 365
Asn His Leu Pro Pro Arg Met Lys Gln Tyr Arg Asp Arg Phe Glu His
370 375 380
His Leu Leu Leu Lys Met Ser Gly Pro Gly Ile Asp Glu Ala Arg Thr
385 390 395 400
Phe Leu Thr Arg Phe Phe Ser Glu Gly Gln Gly Asp Phe Phe Ile Cys
405 410 415
Ser Ala Asp Glu Gly Lys Lys Ala Phe Leu His Arg Phe Ala Ala Ala
420 425 430
Gly Ala Ala Val Arg Tyr His Ala Val His Glu Lys Glu Val Glu Asp
435 440 445
Ile Leu Ala Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg Asn Asp Arg Asp Trp Phe
450 455 460
Glu Thr Leu Pro Glu Asp Ile Asp Asn Gln Leu Val Ala Lys Leu Tyr
465 470 475 480
Tyr Gly His Phe Met Cys His Val Phe His Gln Asp Tyr Ile Val Lys
485 490 495
Lys Gly Ala Asn Ser Lys Ala Leu Lys His Arg Met Leu Glu Leu Leu
500 505 510
Asp Ala Lys Gly Ala Glu Tyr Pro Ala Glu His Asn Val Gly His Leu
515 520 525
Tyr Leu Ala Lys Pro His Leu Lys Glu Phe Tyr Arg Gln Ala Asp Pro
530 535 540
Thr Asn Ser Phe Asn Pro Gly Ile Gly Lys Thr Ser Lys Leu Lys Asn
545 550 555 560
Trp His Asp