一种水产迟钝爱德华氏菌的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种水产迟钝爱德华氏菌，为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)ET?1008株，于2015年8月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11270。本发明的迟钝爱德华氏菌ET?1008株用于制备疫苗。本发明筛选的迟钝爱德华氏菌制备的疫苗对牙鲆幼苗进行免疫后，再用ET?1008株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于用本发明ET?1008株制成的灭活疫苗的效果。CGMCC No.1127020150824
【专利说明】
一种水产迟钝爱德华氏菌
技术领域
[0001] 本发明属于水产养殖疫苗用微生物筛选技术领域，具体涉及一种水产迟钝爱德华 氏菌。
【背景技术】
[0002] 近年来随着水产养殖业的快速发展，水产养殖动物病害问题也日益突出，其中细 菌性疾病已在世界范围内对渔业经济造成了巨大的损失。迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种水产动物重要的致病菌，可以感染包括淡水与海水养殖的多种鱼类，并能在 短期内引起大量死亡，给我国水产养殖业带来了巨大经济损失。疫苗的使用可提高养殖鱼 类特异性免疫水平，使鱼体产生抵抗特定病原微生物感染的免疫力，不污染环境，无药物残 留等问题，是今后鱼类疾病防控的主流发展方向。目前国内外的渔用疫苗大多以注射或浸 浴方式接种为主，口服免疫的少有报道。大规模的集约化养殖模式采用注射方式接种疫苗 需要耗费大量的人力和时间，同时注射接种往往会对鱼体造上生理损伤，且注射接种对小 规格鱼体难以实施。而通过口服免疫接种则操作简便，安全实用，不受鱼体大小的限制，且 疫苗的使用量比浸浴免疫更为节省，同时也不存在因浸浴免疫给水体造成的潜在污染问 题。因此，口服疫苗的研制和应用已逐渐成为当前鱼类疫苗研究的热点。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种水产迟钝爱德华氏菌，从而弥补现有技术的不足。
[0004] 本发明提供的迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)ET-1008株，于2015年8月24 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(位于北京市朝阳区北辰西路1 号院3号），保藏编号为CGMCC No.11270。
[0005] 本发明的迟钝爱德华氏菌ET-1008株用于制备疫苗；
[0006] 所述的疫苗为灭活疫苗。
[0007] 本发明筛选的迟钝爱德华氏菌制备的疫苗对牙鲆幼苗进行免疫后，再用ET-1008 株进行攻毒实验;结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于用本发明ET-1008株 制成的灭活疫苗的效果。
【附图说明】
[0008] 图1:迟钝爱德华氏菌菌株ET-1008的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、外膜蛋白 ompW及鞭毛蛋白fliC的原核重组表达蛋白的纯化产物电泳图；
[0009] 图2:迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗的表观特性图（X200);
[0010] 图3:迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙鲆的免疫保护效果图；
[0011] 图4:本发明的flic蛋白与NCBI中的氨基酸序列为SEQ ID N0:3的flic基因的序列 比较图。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0013] 实施例1:迟钝爱德华氏菌菌株的分离及其毒力特性分析
[0014] (1)患病牙鲆取自山东黄岛养鱼厂，病鱼平均体重为(200±5)g，平均体长(20±5) cm，主要症状为腹水、肛门红肿突出、肝脏和肾脏肿大。
[0015] (2)取腹水症状典型的濒死病鱼，无菌条件下从肝脏、肾脏、腹水等病灶处挑取部 分组织，划线于普通营养琼脂平板上，28 °C培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培 养，直至获得纯培养菌。普通营养琼脂培养基配方为:酵母膏3g，蛋白胨10g，氯化钠15g，蒸 馏水lL，pH 7.6-7.8，琼脂208。
[0016] (3)将分离获得各菌株纯培养物，在普通营养琼脂平板上进行扩大培养，28 °C培养 24h后，用0.9 %无菌生理盐水洗脱菌落，获得菌悬液，利用比浊法将各菌株的细菌浓度定为 1 X 106CFU/mL，用于注射感染。
[0017] (4)实验用健康牙鲆每20尾1组，大小规格与患病牙鲆相同，并设生理盐水对照组。 养殖水温为20± °C，全天充气，每天换水50%。暂养7d后，腹腔注射0.2mL不同菌株的菌悬 液，对照组注射同体积的0.9%无菌生理盐水。定时观察记录，取濒死鱼的病灶及内脏器官 进行细菌再分离，所分离优势菌株再次感染牙鲆，观察结果。
[0018] (5)感染实验结果显示，仅有菌株ET-1008显示出对健康牙鲆具有较高的毒力，可 引起90%牙鲆死亡，且死亡牙鲆出现与患病牙鲆相同的症状。因此，证实菌株ET-1008为牙 鲆腹水症的病原。且在感染患病的牙鲆体内可再次分离到该菌株。
[0019] (6)对比实验表明，用目前市场上出售的迟钝爱德华氏菌疫苗对牙鲆幼苗进行免 疫后，再用本发明筛选的ET-1008株进行攻毒实验;结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫 效果远低于用本发明ET-1008株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于ET-1008株的某个致病 基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
[0020] (7)利用常规生理生化鉴定以及6SrRNA和HSP60基因序列分析显示，菌株ET-1008 为迟钝愛德华氏菌(Edwardsiella tarda)，并将该菌株于2015年8月24日保藏在位于北京 市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 为：CGMCC No.11270。
[0021] 实施例2:迟钝爱德华氏菌菌株ET-1008的GAPDH、外膜蛋白ompW及鞭毛蛋白f 1 iC的 原核重组表达
[0022] (1)目的表达蛋白的序列扩增:根据Genbank迟钝爱德华氏GAPDH、ompW及fliC的基 因序列，分别设计其特异性引物(见表1)。利用细菌基因组抽提试剂盒，以抽提细菌基因组 DNA为模板，分别配合各基因的正反向引物进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件为:50μ1 反应体系，包含37μ1 Η20、5μ1 lOXTaq buffer、4yl dNTP(2.5mM)、正反引物各 1μ1、1μ1 Taq DNA Polymerase及ΙμL DNA模板;PCR反应程序为94°C变性 10min;94°C变性，lmin，50°C 退火lmin，72 °C延伸lmin，进行30个循环，最后72 °C延伸8min 1CR产物经1 %琼脂糖凝胶电 泳检测，凝胶成像系统拍照观察，结果显示GAroH、ompW及fliC基因扩增成功，且扩增产物大 小与目的基因一致(图1)。
[0023]表1迟钝爱德华氏菌鞭毛蛋白flic、外膜蛋白ompW及GAPDH的引物
[0024]
[0025] 对扩增产物回收后进行测序，结果表明，获得的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的 氨基酸序列为SEQ ID N0:1、外膜蛋白（ompW)的氨基酸序列为SEQ ID N0:2;NCBI比对结果 表明上述两种蛋白与NCBI中已公开的序列一直，没有发生变化。但fliC基因的序列与NCBI 中已公开的序列存在明显的差异;本发明获得的氨基酸序列为SEQ ID N0:4的fliC蛋白相 比于NCBI中的氨基酸序列为SEQ ID N0:3的fliC基因存在10个以上氨基的区别（图4)。 [0026] 而免疫效果表明，用氨基酸序列为SEQ ID N0:4的fliC蛋白制成的疫苗对ET-1008 株的免疫效果明显好于氨基酸序列为SEQ ID N0:3的fliC蛋白制成的疫苗。
[0027] (2)GAPDH、ompW及fliC基因表达载体的构建：将扩增的迟钝爱德华氏菌GAPDH、 ompW和f 1 iC基因产物切胶回收进行纯化，纯化产物经BamHI和Xho 11双酶切后，连接至原核 表达载体pET32a，分别构建其表达载体pET32a-GAPDH、pET32a-〇mpW及pET32a-fl iC，并将表 达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，于含氨苄青霉素的LB平板上培养，待长出菌落后，利用 PCR方法筛选阳性克隆表达菌，将PCR检测为阳性克隆的菌株进一步利用测序进行确认。
[0028] (3)重组蛋白的表达与纯化:经测序确认载体中插入序列正确后，将筛选到的迟钝 爱德华氏菌GAPDH、ompW和fliC阳性克隆表达菌分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基内，在 摇床上培养至指数生长期时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导表达6h，离心收集菌体，经超声 破碎后，以Ni离子螯合的亲和层析柱(HisTrap HP lml，GE)对重组蛋白进行纯化，洗脱产物 经尿素浓度梯度透析后，最后以PBS进行透析，透析完成后对样品进行冷冻干燥以浓缩样 品，SDS-PAGE检测纯化的重组蛋白。迟钝爱德华氏菌fliC重组蛋白分子量为63kDa，该目的 基因编码416个氨基酸，表达的蛋白片段理论分子量为43kDa，质粒pET32a的标签蛋白大小 则约为20kDa左右，结果与理论大小相符;GAPDH重组蛋白分子量为55kDa，该目的基因编码 331个氨基酸，表达的蛋白片段理论分子量为35kDa，质粒pET32a的标签蛋白大小则约为 20kDa左右，结果与理论大小相符;ompW重组蛋白分子量为43kDa，该目的基因编码214个氨 基酸，表达的蛋白片段理论分子量为23kDa，质粒pET32a的标签蛋白大小则约为20kDa左右， 结果与理论大小相符。
[0029] 实施例3:迟钝爱德华氏菌脂多糖(LPS)的抽提
[0030] (1)菌体培养:用无菌接种环挑取少量保存的ET-1008菌落划线于普通营养琼脂平 板，用液体培养基洗下生长良好的菌苔，转接入装有40ml培养基的100ml三角烧瓶中，28 °C 振荡培养过夜（160rpm)。在10ml离心管内加入7ml菌液，4°C条件下5000r/min离心10min收 集细菌，用生理盐水洗涤3次，用7ml 50mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0,内含5mmol/L EDTA， 20mmol/L MgCh)使细菌悬浮，浓度为lX108CFU/ml。
[0031] (2)热酚水法制备LPS:在冰浴条件下进行超声波破碎，设定时间为5min，其中4s 开，4s关;将菌液转移到250ml烧杯中，加入溶菌酶至终浓度为200μg/ml，37 °C搅拌温育lh，4 °C搅拌过夜；加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，65°C搅拌孵育lh，再加入RNase和DNase至 终浓度为40μg/ml，37°C温育lh，置于65-70°C的水浴中。平衡后，加入相同体积的预热至65-70 °C的90 %苯酚，边加边剧烈搅拌30min，用冰水浴快速冷却15min，转移至1.5ml离心管中， 4<€10,00〇1'/111；[11离心151]1；[11。弃去酸相，取上层水相至透析膜中，用蒸馏水静置透析3(1，每天 换水3次。在水相中加入乙酸钠至终浓度为0.5M和10倍体积的95 %乙醇，-20 °C过夜沉淀 LPS，2000g 4°C离心10min，lml蒸馏水重悬，冷冻干燥获得高纯度脂多糖干粉用于与蛋白的 偶联。
[0032] 实施例4:迟钝爱德华氏菌重组表达蛋白与LPS的偶联
[0033] (1)重组蛋白与LPS的偶联:将llOmg脂多糖干粉溶解于10ml蒸馏水中，往该LPS水 溶液中加入400mg固体NaI〇4,混合孵育2min，然后加入220μ1乙醇胺终止氧化反应，将反应 产物加入孔径为3Κ大小的透析袋中，置于0.01mol/L的roS中，在4°C条件下透析过夜，期间 换两次透析液。同时，称取390mg碳化二亚胺(EDC)，溶解于5ml蒸馏水中，然后加入90mg纯化 后的GAPDH重组蛋白，利用1M HC1将反应体系pH调整至5.4，室温震荡孵育211。将上述完成氧 化反应后的LPS与含EDC的重组GATOH蛋白溶解混合，在22°C条件下孵育lh，最后将反应液置 于PBS缓冲液中透析过夜，期间更换透析液，最后将透析后的溶液在8000g下离心30min，所 得上清即为GAPDH与LPS的偶联粗制物。FI iC和ompW与LPS的偶联同样参照以上方法进行。 [0034] (2)重组蛋白-LPS偶联物的纯化：各重组蛋白的偶联粗制物，利用Sephacry 1 S- 300凝胶柱层析分离纯化各重组蛋白-LPS偶联物。具体为：首先将粗制偶联产物以孔径为 0.22以1]1的滤膜过滤，然后往柱体积为12〇1]1]^的36口1^(^713-300层析柱内上样1〇1]11偶联粗制 物，以PBS缓冲液作为平衡与洗脱缓冲液，均匀将流速控制为2ml/min，根据紫外吸收波收集 样品，根据分子筛原理，分子量较大的偶联产物将会首先分离获得。将收集到的偶联产物以 超纯水透析，然后进行冷冻干燥，-20 °C保存备用。
[0035]实施例5:迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗的制备
[0036] (1)海藻酸钙一壳聚糖微胶囊的制备：将上述制备的GAPDH、ompW及fliC 3种重组 蛋白-LPS偶联产物按3: 3:1 (W/W)混合后，然后以总量为3:1 (W/W)的比例与黄芪多糖混合， 将抗原混合物与海藻酸钠以1:4(W/W)比例混合，用蒸馏水配制成海藻酸钠-抗原乳浊液，其 中海藻酸钠终浓度为2%，在混匀器的搅拌作用下包埋30min。将该乳浊液利用喷雾式锐孔 凝固浴法，直接喷入经混匀器搅动的3%CaCl 2溶液中，形成海藻酸钙微胶囊，乳浊液与CaCl2 溶液的体积比为1:1，喷雾完毕后继续搅拌20min。离心收集海藻酸钙微胶囊，然后将微胶囊 分散到0.2 %的壳聚糖溶液中，充分搅拌30min，离心收集海藻酸钙-壳聚糖微胶囊，蒸馏水 洗涤3次并离心后，再将收集的微胶囊分散在8%的甘露醇溶液中，混匀后冷冻，经冷冻干燥 后，封盖包装，即为本发明所述的迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗。利用显微镜对制 备的微胶囊进行表观特性观察，结果如图2所示，可见微胶囊颗粒大小均匀，平均直径为150 ± ΙΟμπ?ο
[0037] (2) 口服微胶囊包封率和蛋白载量的测定：以Brad-ford法测定海藻酸钙微胶囊固 化后，CaCl2溶液中的蛋白浓度，然后根据CaCl2溶液的体积计算溶液中逸散的重组蛋白-LPS 偶联产物中的蛋白含量。根据公式:包封率％ =偶联蛋白的总量-CaCl2溶液中逸散的偶联 蛋白的含量/偶联蛋白的总量X100%，计算微胶囊的包封率;根据公式:蛋白载量=偶联蛋 白的总量X包封率/微胶囊干重，计算微胶囊的蛋白载量。最终结果显示，所制备的口服微 胶囊包封率为78%，蛋白载量为102mg/g。
[0038]实施例6:迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙鲆的免疫保护效果 [0039]准备健康牙鲆共80尾，平均体重为50g±5g，利用可控温循环养殖系统对牙鲆暂养 7天，水温控制为21°C，期间正常投喂商品化颗粒饲料。实验前，将鱼平均分为2组，每组40 尾，在对供试鱼体禁食24h后，对免疫组鱼体投喂本发明研制的口服微胶囊疫苗，投喂方法： 将口服微胶囊疫苗与鱼饲料混合投入水体，供鱼体自由采食，使用剂量为:每kg体重鱼体投 放微胶囊疫苗〇.5g，连续投喂5天。首次投喂后15天，再次进行二次免疫，用法及用量与首次 相同。对照组鱼体投喂以不含免疫原与黄芪多糖的海藻酸钠溶液制备的微胶囊颗粒，投喂 方法与投喂量与免疫组相同，在首次投喂后35天，利用生理盐水配制迟钝爱德华氏菌活菌 悬液，浓度为1 X l〇7CFU/ml，采用肌肉注射方式对实验鱼体进行攻毒，每尾注射100μΙ。攻毒 后连续观察并记录鱼体发病与死亡状况，计算迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗对牙 鲆的相对免疫保护率。结果如图3所示，对照组鱼体累计死亡率为95%，免疫组鱼体在攻毒 后20天的累计死亡率为17.5%，通过计算得知，本发明研制的迟钝爱德华氏菌亚单位口服 微胶囊疫苗对牙鲆的相对免疫保护率为81.6%。
[0040]综上所述，本发明研制的迟钝爱德华氏菌亚单位口服微胶囊疫苗，使用方便，粒径 合适，具有良好的缓释性和抗原保护性，且能有效刺激鱼体肠道免疫系统产生免疫应答，使 鱼体获得对迟钝爱德华氏菌的特异性免疫保护力，具有良好的开发应用前景。
【主权项】
1. 一种迟钝爱德华氏菌，其特征在于，所述的迟钝爱德华氏菌的保藏编号为CGMCC Νο·11270〇2. 如权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌，其特征在于，所述的迟钝爱德华氏菌为ΕΤ-1008株。3. 权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌在制备疫苗中的应用。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。5. 权利要求1所述的迟钝爱德华氏菌在制备饲料添加剂中的应用。
【文档编号】A61K39/02GK106085903SQ201610405018
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】刁菁, 叶海斌, 王晓璐, 于晓清, 李乐
【申请人】山东省海洋生物研究院