一种地下芽孢杆菌及其生物防治制剂和应用
【专利摘要】本发明公开地下芽孢杆菌(Bacillus subterraneus)菌株ZDC?01，属于生物防治植物病害技术领域，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12216。实验表明，该菌株ZDC?01具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物体上能够快速大量定殖等特点。由该地下芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治多种植物病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治的植物病害，包括苹果轮纹病、小麦赤霉病、茄子灰霉病、草莓白粉病等中的一种或几种。CGMCC No.1221620160315
【专利说明】
一种地下芽孢杆菌及其生物防治制剂和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物防治植物病害技术领域，特别涉及一种地下芽孢杆菌及其生物防 治制剂和应用。
【背景技术】
[0002] 植物病害严重影响着农作物的生长，制约着农业的持续发展，造成了巨大的经济 损失。因此关于植物病害防治的研究越来越受到重视。植物病害的防治方法目前主要采用 培育抗病品种、化学防治和生物防治。培育抗病品种周期长，效率低，预见性差，可利用的种 质资源有限，且抗性单一。化学农药的长期大量使用，造成农药残留，严重污染环境，同时加 快了病原菌抗药性的增加。生物防治对人畜安全，不污染环境，不易产生抗药性。利用微生 物防治植物病害具有广阔的应用前景。
[0003] 海洋约占地球面积的71%，其中的生物资源极其丰富，数量非常庞大，据统计，海 洋微生物有一百万到两亿种。而海洋沉积物是地球上最复杂的微生物栖息地，沉积物中的 微生物往往具有适应其特殊环境的形态学、生理学的特异性。研究表明，大量的细菌生物量 蕴藏在深海地下，其中大部分深埋于海底沉积物中。由于其环境的极特殊性，如高压，高盐， 低营养，低温，无光照等特点都决定了生活于其中的微生物具有不同于陆地微生物的特点， 使其代谢方式具有特异性，而产生结构和功能独特的天然活性代谢产物，具有重要的开发 价值，利用海洋微生物寻找新的药物资源成为了研究热点。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种地下芽孢杆菌及其生物防治制剂和应用，本发明的地下芽孢杆 菌菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强的特点。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0006] 本发明所提供的菌株为地下芽孢杆菌(Bacillus subterraneus)ZDC_01，分离于 东海海底底泥(经炜度为31° 0(Τ N，124° 3W)，已于2016年3月15日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No. 12216。其具有以下生物学特性:菌体长杆状，大 小为(0.7~1.1)μπιΧ(22~39)μπι，能运动，产芽孢，革兰氏染色呈阳性。在LB培养基上25°C 培养48h，菌落呈灰白色，扁平，边缘不规则，不透明，菌落直径大小为1~1.5mm。
[0007] 本发明提供了地下芽孢杆菌(Bacillus subterraneus)菌株ZDC-01在防治多种植 物病害中的用途。
[0008] 其中，优选地，所述植物病害为苹果轮纹病、小麦赤霉病、茄子灰霉病或草莓白粉 病。
[0009] 本发明提供了一种生物防治制剂，包括所述的地下芽孢杆菌（Bacillus subterraneus)菌株 ZDC-01。
[0010] 本发明提供了一种生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0011] (1)将保存在试管斜面中的地下芽孢杆菌菌株ZDC-01用2216E培养基或LB培养基 进行活化，并置于28-30°C恒温培养箱培养2-3d;所述的2216E培养基配方为酵母提取物lg， 蛋白胨5g，琼脂15-20g，过滤后的海水1000mL，pH调至7.4-7.5;所述LB培养基配方为胰蛋白 胨l〇g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2;
[0012] (2)将步骤（1)的地下芽孢杆菌菌株ZDC-01的孢子移植到2216E或LB液体培养基 中，28-30°C摇床振荡培养48h得到种子液;所述的2216E配方为酵母提取物lg，蛋白胨5g，过 滤后的海水l〇〇〇mL，pH调至7.4-7.5;所述或LB液体培养基为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， 氯化钠 l〇g，蒸馏水1000mL，pH调至7 · 0-7 · 2;
[0013] (3)按体积比为10 %比例将种子液接种到固体培养基中，28-30 °C下振荡培养3- 5d;所述的固体培养基配方为固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐的比例质量比为98.5: 0.5;所述固料的组成按质量比为麸皮:稻壳:玉米粉:豆柏粉=10:65:15:10;所述无机盐按 照质量百分比包括20 %磷酸二氢钾，15 %硫酸镁，10 %硫酸铵，55 %轻质碳酸钙；
[0014] (4)将步骤(3)的培养物用无菌水按照质量比1:15的比例混合，过滤，将滤液按体 积比1:6的比例接种至固体培养基，28-30°C、相对湿度85 %以上的条件下发酵8-9d。
[0015] 本发明提供了生物防治制剂在防治多种植物病害中的用途。
[0016] 其中，优选地，所述的植物病害为苹果轮纹病、小麦赤霉病、茄子灰霉病或草莓白 粉病。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 实验表明，本发明的地下芽孢杆菌菌株ZDC-01具有生长速度快、产孢量大、作用谱 广、抗逆性强，在植物体上能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该地下 芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治多种植物病害，还能有效提高作物产 量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防 治的植物病害，包括苹果轮纹病、小麦赤霉病、茄子灰霉病、草莓白粉病等中的一种或几种。
【具体实施方式】
[0019] 下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的内容仅仅是本发 明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没 有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0020] 实施例1
[0021 ] 1、地下芽抱杆菌(Bacillus subterraneus)ZDC_01的分离与纯化
[0022] (1)本发明的地下芽孢杆菌(Bacillus subterraneus)菌株ZDC-01分离方法
[0023] 本发明的地下芽孢杆菌(Bacillus subterraneus)ZDC-01采用稀释涂布法分离获 得的，具体分离方法为:称取lg底泥样品溶于99mL无菌水中，置于摇床振荡5-10min，使样品 与水充分混合，即获得10- 2底泥稀释液。取lml上述底泥稀释液至9ml无菌水中，摇匀即获得 1〇一3底泥稀释液。相同的方法配置10- 4、1〇-5、1〇-6的底泥稀释液。取10-4、1〇- 5、1〇-6的底泥稀释 液100yL于倒好的2216E培养基平板中，用涂布器将稀释液均匀涂布，每个浓度重复3次。培 养皿置于28-30 °C的恒温箱中培养24h，将培养基上的不同形态的菌落在空白2216E培养基 平板中进行划线，纯化获得的菌株，并分别编号保存。
[0024] (2)茄子灰霉病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
[0025] ①初筛:采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器(直径为8mm)在茄子灰霉病菌菌 丝边缘打取菌饼，接在平板中央，四周2cm处采用点接的方法接种芽孢杆菌菌株，将其置于 28-30 °C恒温培养箱培养，以不接种芽孢杆菌的培养皿作对照。待对照皿菌丝长满培养皿时 检查试验结果。
[0026] ②复筛:将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐 温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间 试验。
[0027] 本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的地下芽孢杆 菌(Bacillus subterraneus)ZDC_01。实验证明，该地下芽孢杆菌原粉在防治前子灰霉病方 面显示出较优的效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的地下芽孢杆菌是具有广泛应用 前景的新菌株，可以用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。
[0028] 2、菌株鉴定
[0029] (1)微生物特性：菌体长杆状，大小为（0 · 7~1 · 1 )μπιX (22~39)μπι，能运动，产芽 孢，革兰氏染色呈阳性。在LB培养基上25°C培养48h，菌落呈灰白色，扁平，边缘不规则，不透 明，菌落直径大小为1~1.5_。
[0030] (2)分子生物学特性
[0031] 该菌株的16S rRNA基因序列测定结果如下：
[0032] TGCAGTCGAGCGGATCTTCATTAGCTTGCTTTTGAAGATCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGC AACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATCCTTTCCCTCTCATGAGGGAAA GCTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA AGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTC GTAAAGCTCTGTTGTCAGGGAAGAACAAGTACCGGAGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTGACCAGAAAGCCAC GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCG CAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTG CAGAAGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGC TCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGG AGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA GCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGA GTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG ATCTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC AAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGT GAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTA ATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA CACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTGGAGCCAGCCG
[0033] 实施例2
[0034] 1、地下芽孢杆菌菌株ZDC-01发酵过程
[0035] LB液体培养基，配方为:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水lOOOmL， pH调至7.0-7.2。
[0036] 2216E液体培养基，配方为:酵母提取物lg，蛋白胨5g，过滤后的海水lOOOmL，pH调 至7.4-7.5。
[0037] 大量发酵培养基为固体培养基，其配方为固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐 的比例为98.5:0.5 (质量比）；所述固料的组成为麸皮:稻壳:玉米粉:豆柏粉=10:65:15:10 (质量比）；所述无机盐按照质量百分比及，包括20 %磷酸二氢钾，15 %硫酸镁，10 %硫酸铵， 55 %轻质碳酸|丐；
[0038] 地下芽孢杆菌菌株ZDC-01大量固体发酵过程：
[0039] (1)将保存在试管斜面中的地下芽孢杆菌菌株ZDC-01用2216E培养基或LB培养基 进行活化，并置于28-30°C恒温培养箱培养2-3d;
[0040] (2)将步骤（1)的地下芽孢杆菌菌株ZDC-01的孢子移植到2216E或LB液体培养基 中，28-30 °C摇床振荡培养48h得到种子液；
[0041 ] (3)按10 %比例（体积比）将种子液接种到固体培养基中，28-30°C下振荡培养3- 5d〇
[0042] (4)将步骤(3)的培养物用无菌水按照质量比1:15的比例混合，过滤，将滤液按体 积比1:6的比例接种至固体培养基，28-30°C、相对湿度85%以上的条件下发酵8-9d，即可得 到芽孢杆菌原粉。
[0043] 实施例3
[0044] 地下芽孢杆菌菌株ZDC-01对三种病原菌室内效果验证
[0045] 1、实验方法
[0046]采用平板对峙培养法，将供试的苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、小麦 赤霉病菌（Fusarium graminearum)、前子灰霉病菌（Botrytis cinerea)菌饼（8mm)移至平 板中央，四周2cm处接种ZDC-01菌株，将其置于28-30°C恒温培养箱培养，以不接种芽孢杆菌 的培养皿作对照，每个处理重复3次。待对照菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直 径、抑菌带直径，计算平均值和相对抑制率。
[0047] 2、结果
[0048]由表1可以看出，地下芽孢杆菌菌株ZDC-01对苹果轮纹病菌、小麦赤霉病菌和茄子 灰霉病菌的菌丝生长均有较强的抑制作用，抑菌带宽度为1.18~1.27cm，菌丝生长抑制率 为85.59 ~88.53%。
[0049] 表1.地下芽孢杆菌菌株ZDC-01对三种病原菌的室内抑菌活性测定
[0050]
[00511实例4地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对苹果轮纹病的田间效果验证 [0052] 1.1供试药剂
[0053] 地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液;70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(市售）。
[0054] 1.2供试作物与防治对象：
[0055] 供试作物:苹果，品种为富士，树龄16年生 [0056]防治对象:轮纹病
[0057] 1.3试验地情况
[0058]试验地设在河南省滑县白道口镇杨店苹果园，土壤为砂土地，肥力中等偏下，常年 亩产量为4000-5000斤左右。试验期间未施肥和灌水。所有试验小区栽培条件及管理措施一 致。
[0059] 1.4试验设计及安排
[0060] 本试验设计了地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液400倍、600倍、800倍，70 %甲基硫菌灵 可湿性粉剂800倍液及不施药清水作对照共5个处理，每个小区成龄苹果树2株，重复4次，共 20个小区，各小区随机排列。
[0061] 1.5试验调查及计算方法
[0062] 于2015年6月24日、7月20日、8月17日共喷药3次。于9月20日进行采收期调查，记录 各处理的总果数、病果数，随后于当天按照东、西、南、北四个方位随机采取外观无病的果 实，置于常温贮藏，于贮藏后15天和30天继续调查，统计采收期和贮藏15天、30天各处理的 累积病果率，计算防治效果。用Duncan新复极差法对试验数据进行统计分析。在施药期间， 观察各处理对苹果有无药害产生。
[0063] 按下列公式计算病果率和防治效果：
[0064]
[0065]
[0066] 2.结果
[0067] 2.1供试药剂对苹果轮纹病的防治效果
[0068] 表2地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对苹果轮纹病的田间药效试验
[0069]
[0070] 试验结果表明，常温贮藏苹果果实15天后，清水对照的病果率为16.3%，而地下芽 孢杆菌ZDC-01发酵液稀释400倍、600倍的处理平均防效分别为79.8%、76.7%，与70%甲基 硫菌灵可湿性粉剂稀释800倍的防治效果相当，不存在显著性差异。贮藏30天时，清水对照 病果率增至27.6%，其他处理为5.7~8.9%，与贮藏15天的防效相似，地下芽孢杆菌ZDC-01 发酵液稀释400倍的、600倍以及70%甲基硫菌灵可湿性粉剂稀释800倍的处理防效均显著 高于地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释800倍的处理。
[0071]实例5地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对小麦赤霉病的田间效果验证 [0072] 1.1供试药剂
[0073]地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液；15%氟环唑悬浮剂(市售）。
[0074] 1.2供试作物与防治对象：
[0075]供试作物:小麦，品种为南段 [0076]防治对象:赤霉病 [0077] 1.3试验地情况
[0078]试验地设在莒南县十字路街道南石桥村小麦田，土壤肥力中等，所有试验小区栽 培条件及管理措施一致，并符合当地农业生产实际。
[0079] 1.4试验设计及安排
[0080] 本试验设计了地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液400倍、600倍、800倍，15 %氟环唑悬浮 剂6000倍液及不施药清水作对照共5个处理，小区面积为20平方米，重复四次，各小区随机 排列。
[0081] 1.5试验调查及计算方法
[0082] 于2015年4月27日、5月9日共喷药2次。于5月9日、5月20日调查病穗数，调查时对每 个小区取东、西、南、北四个方位取样，每点调查100穗，以枯穗面积占整个穗的面积进行分 级，记录各级病穗和总穗数。
[0083] 病穗分级如下：
[0084] 0级:全穗无病；
[0085] 1级:枯穗面积占全穗面积的1/4以下；
[0086] 3级:枯穗面积占全穗面积的1/4-1/2;
[0087] 5级:枯穗面积占全穗面积的1/2-3/4;
[0088] 7级:枯穗面积占全穗面积的3/4以上；
[0089]按下列公式计算防治效果：
[0093] 2.结果[0094] 2.1供试药剂对小麦赤霉病的防治效果
[0090]
[0091]
[0092]
[0095] 表3地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对小麦赤霉病的田间药效试验
[0096]
[0097]试验结果表明，地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对小麦赤霉病有一定的防治效果。第 一次施药后10天，地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液的防效为71.5-80.3%，且地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释400倍的处理与对照15%氟环唑悬浮剂稀释6000倍的处理效果相当。第二次 施药后10天，地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释800倍的处理防效仅为69.8%，但其稀释400 倍的处理与对照药剂的处理防效分别为81.1%、82.4%，两处理间不存在显著性差异。 [0098] 实例6地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对茄子灰霉病的田间效果验证 [0099] 1.1供试药剂
[0100]地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液;50%腐霉利可湿性粉剂(市售）。
[0101] 1.2供试作物与防治对象：
[0102] 供试作物:茄子，品种为布利塔702
[0103] 防治对象:灰霉病
[0104] 1.3试验地情况
[0105] 试验地设在山东省寿光市茄子保护地，于2015年在寿光市茄子保护地大棚内进行 防治茄子灰霉病试验。土壤为砂土地。病害发生严重。所有试验小区栽培条件及管理措施一 致。
[0106] 1.4试验设计及安排
[0107] 本试验设计了地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液400倍、600倍、800倍，50 %腐霉利可湿 性粉剂800倍液及不施药清水作对照共5个处理，每个小区24m2,重复4次，共20个小区，各小 区随机排列。
[0108] 1.5试验调查及计算方法
[0109] 在打药前调查病情基数，并于施药后7天，施药后15天各调查一次，整个试验调查3 次。调查方法采用随机抽样法进行调查。每小区随机5株，每株选2个枝编号挂牌，药前药后 都从枝尖完全展开叶往下数5片叶进行调查，每小区共调查50片。用Duncan新复极差法对试 验数据进行统计分析。在施药期间，观察各处理对茄子有无药害产生。
[0110]分级方法：
[0111] 0级:无病斑；
[0112] 1级:病斑面积占整个叶面积5%以下；
[0113] 3级:病斑面积占整个叶面积6%~10% ;
[0114] 5级:病斑面积占整个叶面积11 %~20% ;
[0115] 7级:病斑面积占整个叶面积21 %~50 %
[0116] 9级:病斑面积占整个叶面积的51 %以上。
[0117] 按下列公式计算病情指数和防治效果：
[0118]
[0119]
[0120] 2.结果
[0121 ] 2.1供试药剂对茄子灰霉病的防治效果
[0122] 表4地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对茄子灰霉病的田间药效试验
[0123]
[0124] 试验结果表明，施药后7天，地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释400倍、600倍时的防 治效果分别为71.77%、69.84%，与50%腐霉利可湿性粉剂稀释800倍的防治效果相当，不 存在显著性差异。药后10天，地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释600倍的处理与50%腐霉利可 湿性粉剂稀释800倍的效果不存在显著性差异;地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释400倍的效 果显著好于其他处理，防治效果为80.71 %。
[0125] 实例7地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对草莓白粉病的田间效果验证
[0126] 1.1供试药剂
[0127] 地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液;70 %甲基硫菌灵可湿性粉剂(市售）。
[0128] 1.2供试作物与防治对象：
[0129] 供试作物:草莓，品种为红颜
[0130] 防治对象：白粉病
[0131] 1.3试验地情况
[0132] 试验于2015年在山东省青岛上马草莓大棚栽培地进行，草莓长势较均匀，处于收 获初期，有草莓白粉病感染。所有试验小区栽培条件及管理措施一致。
[0133] 1.4试验设计及安排
[0134] 本试验设计了地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液400倍、600倍、800倍，70 %甲基硫菌灵 可湿性粉剂800倍液及不施药清水作对照共5个处理，每个小区25m2,重复4次，各小区随机 排列，各处理之间设保护行。
[0135] 1.5试验调查及计算方法
[0136] 在打药前调查病情基数，并于第一次施药后7天，第二次施药后7天各调查一次，整 个试验调查3次。调查方法采用对角线五点取样法，每点调查3株，每株调查全部完全展开 叶，每片叶按照病斑面积占叶面积的百分比进行分级，记录调查总叶数和各级病叶数。
[0137] 分级方法：
[0138] 〇级:无病斑；
[0139] 1级:病斑面积占整个叶面积5 %以下；
[0140] 3级:病斑面积占整个叶面积6%~15% ;
[0141] 5级:病斑面积占整个叶面积16%~25% ;
[0142] 7级:病斑面积占整个叶面积26 %~50 %
[0143] 9级:病斑面积占整个叶面积的51 %以上。
[0144] 按下列公式计算病情指数和防治效果：
[0145]
[0146]
[0147] 2.结果
[0148] 2.1供试药剂对草莓白粉病的防治效果
[0149] 表5地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液对草莓白粉病的田间药效试验
[0150]
[0151] 试验结果表明，第一次施药后7天，地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释400倍、600倍、 800倍的处理病情指数分别降至5.21、6.37和7.23，防效分别为68.3%、60.9%和56.7% ;对 照药剂70%甲基硫菌灵WP稀释800倍的处理病情指数降至5.17，防效为68.9 %，与地下芽孢 杆菌ZDC-01发酵液稀释400倍的处理无显著性差异。而清水对照的病情指数由12.13升至 16.42〇
[0152] 第二次施药后7天，地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释400倍、600倍、800倍的处理病 情指数分别降至6.56、8.46和11.22，防效分别为74.3%、67.1 %和56.8% ;对照药剂的处理 病情指数降至6.98，防效为72.9% ;而清水对照的病情指数由12.13升至25.51。方差分析结 果表明，地下芽孢杆菌ZDC-01发酵液不同稀释倍数的3个处理间防效存在显著性差异，但地 下芽孢杆菌ZDC-01发酵液稀释400倍与对照药剂稀释800的防效无显著性差异。
[0153]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 地下芽孢杆菌(Bacillus subterraneus)菌株ZDC-01，该菌株保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 12216。2. 权利要求1所述的地下芽孢杆菌(Bacillus subterraneus)菌株ZDC-01在防治多种 植物病害中的用途。3. 如权利要求2中所述的用途，其特征是，所述植物病害为苹果轮纹病、小麦赤霉病、茄 子灰霉病或草莓白粉病。4. 一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的地下芽孢杆菌(Bacillus subterraneus) 菌株 ZDC-01。5. -种权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤： (1) 将保存在试管斜面中的地下芽孢杆菌菌株ZDC-01用2216E培养基或LB培养基进行 活化，并置于28-30 °C恒温培养箱培养2-3d;所述的2216E培养基配方为酵母提取物lg，蛋白 胨5g，琼脂15-20g，过滤后的海水1000mL，pH调至7.4-7.5;所述1^培养基配方为胰蛋白胨 l〇g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2; (2) 将步骤（1)的地下芽孢杆菌菌株ZDC-01的孢子移植到2216E或LB液体培养基中，28-30°C摇床振荡培养48h得到种子液;所述的2216E配方为酵母提取物lg，蛋白胨5g，过滤后的 海水1000mL，pH调至7.4-7.5;所述或LB液体培养基为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 1(^，蒸馏水1〇〇〇11^4!1调至7.〇-7.2 ; (3) 按体积比为10 %比例将种子液接种到固体培养基中，28-30 °C下振荡培养3-5d;所 述的固体培养基配方为固料和无机盐溶液，所述固料和无机盐的比例质量比为98.5:0.5; 所述固料的组成按质量比为麸皮:稻壳:玉米粉:豆柏粉=10:65:15:10;所述无机盐按照质 量百分比包括20 %磷酸二氢钾，15 %硫酸镁，10 %硫酸铵，55 %轻质碳酸钙； (4) 将步骤(3)的培养物用无菌水按照质量比1:15的比例混合，过滤，将滤液按体积比 1:6的比例接种至固体培养基，28-30°C、相对湿度85 %以上的条件下发酵8-9d。6. 权利要求4所述的生物防治制剂在防治多种植物病害中的用途。7. 如权利要求6所述的用途，其特征是，所述的植物病害为苹果轮纹病、小麦赤霉病、茄 子灰霉病或草莓白粉病。
【文档编号】A01P3/00GK106085898SQ201610395357
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月3日 公开号201610395357.3, CN 106085898 A, CN 106085898A, CN 201610395357, CN-A-106085898, CN106085898 A, CN106085898A, CN201610395357, CN201610395357.3
【发明人】雍道敬, 邱森森, 胡修俊
【申请人】青岛中达生物技术有限公司