用于预防或治疗代谢综合症的方法
【专利摘要】本发明旨在提供一种用于预防或治疗代谢综合症的方法，其可以通过抑制巨噬细胞浸润进入脂肪组织中在上游停止代谢综合症中类似多米诺效应的疾病链。本发明提供了一种用于预防或治疗代谢综合症的方法，该方法包括将AIM抑制剂施用到对象的步骤。
【专利说明】用于预防或治疗代谢综合症的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种预防或治疗代谢综合征的方法，该方法包括将AIM抑制剂施用到对象。
【背景技术】
[0002]通常，已知诸如糖尿病、高血脂症、高血压和肥胖症的与生活方式相关的疾病经常聚集于一个人。尽管这些疾病有分别成为动脉硬化症的风险，但是当聚集时，风险变得非常高。因此，已经提出了多个名称以表示这些疾病聚集的病理。
[0003]目前，用标准名称-代谢综合症来表示包括糖尿病、高血脂症、高血压、肥胖症和胰岛素抗性作为基本构成要素的疾病概念，其中，这些疾病经常聚集于一个人并使导致动脉硬化疾病的风险变高。 [0004]通常，在代谢综合症中，内脏脂肪型肥胖症，即腹腔内过量聚集中性脂肪的肥胖症，是核心病理。由肥胖症引起的胰岛素抗性相继引发高血压、糖尿病、高血脂症等，它们的聚集和联系引发动脉硬化疾病。这种现象被比作多米诺效应，近些年提出了“代谢多米诺”的概念。
[0005]也就是说，就像一旦开始倾倒就难以恢复的多米诺效应一样，一系列病理朝一个方向行进，并且长期地以持续的方式慢性地引发各种疾病。
[0006]代谢综合征的治疗不以症状的减缓为目的，而是以预防各种疾病尤其是后来可能引发的动脉硬化疾病的起始为目的。
[0007]如上所述，在代谢多米诺的概念下，由于一旦开始，行进就难以恢复到原来的状态，所以期望在上游抑制行进。
[0008]迄今进行的研究已经阐明，在代谢综合征中，当过量的中性脂肪聚集在腹腔内的脂肪细胞中时，由于发生来自脂肪细胞的脂肪细胞因子的分泌量异常、血液游离脂肪酸的增加以及脂肪组织的慢性炎症，所以诸如胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压等与生活方式相关的疾病以及继发的疾病像链式反应一样被引发。
[0009]因此，在代谢综合症的预防或治疗中，优选考虑以诸如脂肪细胞因子的分泌、血液游离脂肪酸和脂肪组织的慢性炎症的上游事件为目标。
[0010]在它们之中，已经阐明脂肪组织的慢性炎症的发生是由于伴随肥胖症浸润进入脂肪组织的巨噬细胞增加(参见，例如，非专利文献I和2)。
[0011]巨噬细胞的活化状态包括两种:M1和M2。Ml也被称作经典活化巨噬细胞，并表现出使诸如TNF-a、IL-6和IL-12等的炎性细胞因子和诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)的产生增加。M2也被称作替代活化巨噬细胞，并表现出使炎性细胞因子的产生下降并使诸如IL-10等的抗炎性细胞因子和抑制iNOS活性的精氨酸酶的产生增加。
[0012]已知在非肥胖症的情况下，浸润进入脂肪组织的巨噬细胞主要是M2，而随着肥胖症的行进主要是Ml (参见，例如，非专利文献3)。
[0013]也已经报道，在巨噬细胞特异性PPARy-缺陷小鼠中，不存在M2并且高脂肪饮食诱发的肥胖症和胰岛素抗性增强(非专利文献4);巨噬细胞PPAR Y的失活导致在正常饮食的不肥胖小鼠的骨骼肌和肝脏中葡萄糖耐受性和胰岛素抗性的下降(非专利文献5);巨噬细胞特异性Cap (Cbl相关蛋白质)缺陷小鼠表现出脂肪组织中巨噬细胞浸润的下降以及由高脂肪饮食负荷(high-fat diet loading)导致的胰岛素抗性的表达减弱(非专利文献6);等等。因此，暗示了浸润进入脂肪组织的巨噬细胞Ml在胰岛素抗性的表达中发挥着重要的作用。
[0014]脂肪组织的慢性炎症在代谢综合症的发生中的深度参与与许多代谢综合症患者是高敏CRP阳性的报道一致，这表明轻度炎症的存在以及具有抗炎作用的水杨酸和噻唑烷药剂的施用改善了胰岛素抗性。
[0015]此外，同野生型小鼠相比，在CCR2 (C-C趋化因子受体2)敲除小鼠中，对与肥胖症相关的脂肪细胞因子的产生的异常控制(abnormal control)得到改善,其中，CCR2敲除小鼠表现出巨噬细胞进入脂肪组织的浸润的下降(非专利文献7)。因此，认为浸润进入脂肪组织的巨卩遼细胞也参与脂肪细胞因子的产生的瓦解控制(collapsed control)。
[0016]综上所述，认为在代谢综合症的预防或治疗中，通过以浸润进入脂肪组织的炎性巨噬细胞为目标，能够在诸如脂肪组织中的慢性炎症和脂肪细胞因子产生的瓦解控制的代谢多米诺的最上游的位点停止代谢多米诺的行进。
[0017]然而，还未阐明伴随肥胖症的巨噬细胞诱导进入脂肪组织的机制。
[0018]例如，报道已经证明了巨噬细胞诱导效率在单核细胞趋化因子MCP-1敲除小鼠和CCR2敲除小鼠中降低，但是 该效率依据报道而变化。另外，也有报道表明巨噬细胞的浸润在MCP-1敲除小鼠中得到促进。
[0019]因此，存在讨论MCP-1和CCR2与巨噬细胞的诱导之间的因果关系的空间，至少它们不被认为是明确的(必要的)和基本的因素。
[0020]自然，还没有发现通过抑制巨噬细胞浸润进入脂肪组织的基本原因来在代谢多米诺的最上游中止代谢多米诺行进的方法。
[0021]同时，本发明人已经发现来自组织巨噬细胞的巨噬细胞凋亡抑制因子(AM)(参见非专利文献9)。AIM是可溶性蛋白质，是清道夫受体富含半胱氨酸(SRCR)超家族的成员。AIM首先作为保护巨噬细胞免受各种凋亡诱导剂影响的凋亡抑制因子被发现(参见非专利文献9)。
[0022]因为AIM的结构具有3个SRCR结构域，与⑶5的细胞外结构域相似，所以AM也称作CD5L (CD5-相似)。
[0023][文献列表]
[0024]非专利文献
[0025]非专利文献I:ffeisberg, S.P.等人，J.Clin.1nvest.，2003，112:1796-1808
[0026]非专利文献2:Xu, H.等人，J.Clin.1nvest.，2006，116:115-124
[0027]非专利文献3:Lumeng, C.N.等人，J.Clin.1nvest.，2007，117:175-184
[0028]非专利文献4:0degaard, J.L.等人，Nature, 2007，447:1116-1121
[0029]非专利文献5:Hevener, A.L.等人，J.Clin.1nvest.，2007，117:1658-1669
[0030]非专利文献6:Lesniewski, L.A.等人,Nature Med., 2007, 13:455-462
[0031]非专利文献7:ffeisberg, S.P.等人，J.Clin.1nvest.，2006，116:115-124[0032]非专利文献8:Kanda, H.等人，J.Clin.1nvest.，2006，116:1494-1505
[0033]非专利文献9:Miyazaki, T.等人，J.Exp.Med.189，413-422 (1999)
[0034]非专利文献10:Arai, S.等人，Cell Metab.1, 201-213 (2005)
【发明内容】
[0035]技术问题
[0036]本发明旨在提供一种用于预防或治疗代谢综合症的方法，其可以通过抑制巨噬细胞浸润进入脂肪组织中在上游停止代谢综合症中类似多米诺效应的疾病链。
[0037]技术方案
[0038]在本
【发明者】对AM进一步研究过程中，我们发现在动脉粥样硬化病变中，巨噬细胞内吞脂质并产生AM，由于产生的AM支持病变部位巨噬细胞的凋亡抑制，所以产生的AIM也参与动脉硬化症的发展。另外，我们已经制备了 AIM缺陷小鼠，并证实了 AIM缺陷显著地减轻了动脉硬化症(Arai, S.等人，Cell Metab.1, 201-213 (2005))。
[0039]同时，本
【发明者】已经发现，如在下述参考示例中所示，AM也在浸润进入肥胖脂肪组织的巨噬细胞中表达。另外，我们发现:在存在AIM的情况下，前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞受到抑制；在存在AIM的情况下，在成熟脂肪细胞中引起脂滴的分解(脂解作用)；在存在AIM的情况下，脂肪细胞的尺寸趋于变小；因此，AIM本身作为抗肥胖症药物是有用的。
[0040]另外，我们还发现:脂肪组织中产生的AIM结合到细胞表面上的⑶36并通过内吞作用进入到脂肪细胞中；产生的AIM结合到细胞中的脂肪酸合酶(FAS)并抑制其活性，即，AIM的直接目标分子是FAS，并且AM通过抑制FAS活性抑制前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞并抑制脂滴的分解。
[0041]然而，本
【发明者】现在已经发现看起来与上述发现明显相反的现象；即，AIM直接参与代谢综合症的发生。
[0042]具体地讲，我们已经通过体内研究证实:伴随肥胖症，AIM的血液浓度增加；即使在AM敲除小鼠已经变肥胖之后，它们的脂肪组织中也几乎看不到巨噬细胞的浸润；并且通过对AIM敲除小鼠全身施用重组AIM，炎性巨噬细胞浸润进入脂肪组织中。
[0043]另外，我们已经通过体内研究证实，炎性巨噬细胞浸润进入脂肪组织中是由脂滴融解的诱导所导致的巨噬细胞的迁移引起的，脂滴融解是通过因肥胖症使AM血液浓度增加而抑制FAS活性引起的。
[0044]另外，我们已经发现，即使在通过采取高脂肪饮食使AM敲除小鼠变肥胖时，小鼠的葡萄糖代谢也不会下降，因此，即使小鼠变得肥胖，对AM抑制也可以防止类似多米诺效应的代谢综合症的一系列疾病的后续链式起始和行进，这导致了本发明的完成。
[0045]因此，本发明涉及:
[0046][I] 一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的方法，该方法包括将AIM抑制剂施用到对象的步骤；
[0047][2]根据上述[I]所述的方法，其中，上述AM抑制剂降低血液中AM的稳定性；
[0048][3]根据上述[I]所述的方法，其中，上述AM抑制剂抑制AM与⑶36之间的结合；[0049][4]根据上述[I]所述的方法，其中，上述AM抑制剂抑制AM进入靶细胞中；
[0050][5]根据上述[I]所述的方法，其中，上述AIM抑制剂抑制AIM从内含体转移到细胞质；
[0051][6]根据上述[I]所述的方法，其中，上述AIM抑制剂抑制AIM结合到脂肪酸合酶(FAS)；
[0052][7]根据上述[I]所述的方法，其中，上述AM抑制剂抑制AM的表达；
[0053][8]根据上述[1]_[7]中任意一项所述的方法，其中，上述代谢综合症或其相关疾病是从由代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常以及血液游离脂肪酸量异常组成的组中选择的至少一种；
[0054][9]根据上述[1]_[8]中任意一项所述的方法，其中，上述对象是人；
[0055][10]根据上述[1]_[8]中任意一项所述的方法，其中，上述对象是非人类的哺乳动物或鸟类；
[0056][11]根据上述[10]所述的方法，其中，上述对象是狗或猫；
[0057][12] 一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的药剂，该药剂包括从以下组中选择的至少一种:[0058]抗AM抗体；
[0059]抗CD36 抗体；
[0060]对AM基因具有RNAi效应的双链核酸；
[0061]AM基因的反义核酸；
[0062]AM基因的核酶；
[0063]结合到抗AIM抗体而不抑制FAS活性的蛋白质；
[0064]结合到⑶36而不抑制FAS活性的蛋白质；
[0065]结合到FAS而不抑制FAS活性的蛋白质；以及
[0066]可溶CD36;
[0067][13]根据上述[12]所述的治疗药剂，其中，上述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或者抗体片段；
[0068][14]根据上述[12]或[13]所述的治疗药剂，其中，上述结合到FAS而不抑制FAS活性的蛋白质结合到从由DH、ER、TE和CC组成的组中选择的至少一个结构域；
[0069][15]根据上述[12]或[13]所述的治疗药剂，其中，上述结合到抗AM抗体而不抑制FAS活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM变异体或其片段以及AM嵌合蛋白质或其片段组成的组；
[0070][16]根据上述[12]或[13]所述的治疗药剂，其中，上述结合到CD36而不抑制FAS活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM变异体以及AM嵌合蛋白质组成的组；
[0071][17]根据上述[12]或[13]所述的治疗药剂，其中，上述结合到FAS而不抑制FAS活性的蛋白质选自于由AM片段、AM类似物、AM变异体以及AM嵌合蛋白质组成的组；
[0072][18]根据上述[15]-[17]中任意一项所述的治疗药剂，其中，上述AM片段选自于包含AIM蛋白质的功能域及其保守区域的片段；
[0073][19]根据上述[12]_[18]中任意一项所述的治疗药剂，其中，上述代谢综合症或其相关疾病是从由代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常以及血液游离脂肪酸量异常组成的组中选择的至少一种；
[0074][20]根据上述[12]_[19]中任意一项所述的治疗药剂，其中，上述对象是人；
[0075][21]根据上述[12]_[19]中任意一项所述的治疗药剂，其中，上述对象是非人类的哺乳动物或鸟类；
[0076][22]根据上述[21]所述的治疗药剂，其中，上述对象是狗或猫；
[0077][23] 一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的方法，该方法包括施用根据上述[12]-[22]中任意一项所述的治疗药剂的步骤；
[0078][24] 一种生产AM抑制剂的方法，该方法包括:
[0079]用蛋白酶处理AM以获得AM片段的步骤，以及
[0080]通过其中固定有结合到AM的功能域或保守区域的抗AM抗体的亲和柱纯化上述AM片段的步骤。
[0081]发明效果
[0082]根据本发明的方法，可以通过抑制AM来抑制巨噬细胞浸润进入肥胖个体的脂肪组织中以在上游停止代谢综合症的致命疾病组的链式起始。
【专利附图】
【附图说明】
[0083]图1示出了肥胖小鼠和正常小鼠的血液AM浓度的测量结果。
[0084]图2示出了使用抗巨噬细胞单克隆抗体(F4/80)等检测巨噬细胞浸润进入肥胖AIM+/+小鼠和肥胖AIM+小鼠的内脏脂肪组织中的结果。 [0085]图3示出了在对AM+小鼠全身施用rAM3周后使用抗巨噬细胞单克隆抗体(F4/80 )等检测巨噬细胞浸润进入内脏脂肪组织中的结果。
[0086]图4示出了巨噬细胞迁移能力的测量结果。
[0087]图5是示出了用HFD饲喂12周之后的AIM+/+小鼠和AIM+小鼠的解剖学结果的照片。
[0088]图6示出了用HFD饲喂12周之后的AIM+/+小鼠和AIM+小鼠的体重和总脂肪量的结果。
[0089]图7示出了在饲喂HFD之前对AIM+/+小鼠和AIM+小鼠执行葡萄糖耐受性测试的结果。
[0090]图8示出了在饲喂HFD之后对AIM+/+小鼠和AIM+小鼠执行葡萄糖耐受性测试的结果。
[0091]图9示出了在饲喂HFD之前对AIM+/+小鼠和AIM+小鼠执行胰岛素耐受性测试的结果。
[0092]图10示出了在饲喂HFD之后对AM+/+小鼠和AIM+小鼠执行胰岛素耐受性测试的结果。
[0093]图11示出了在饲喂HFD之后对AIM+/+小鼠和AIM+小鼠执行胰岛素敏感性测试的结果。[0094]图12示出了使用抗巨噬细胞单克隆抗体、抗小鼠AM多克隆抗体和抗IL-6抗体对从正常小鼠(未饲喂高脂肪饮食的小鼠)和肥胖小鼠的内脏脂肪组织制得的切片染色的结果。
[0095]图13示出了在3T3-L1细胞培养期间施用rAM的时间表。
[0096]图14示出了按照图13中示出的时间表在第12天用红油O (oil-red-Ο)对细胞染色的结果。
[0097]图15示出了按照图13中示出的时间表在第12天通过定量实时PCR测量脂肪细胞标记的表达结果。
[0098]图16A示出了施用rAM并用红油O染色的成熟脂肪细胞的结果。图16B示出了脂滴的尺寸，图16C示出了每单位面积的包含脂滴的细胞的数目。
[0099]图17示出了通过对成熟脂肪细胞施用rAM并测量培养上清液中的丙三醇和游离脂肪酸获得的测量结果。
[0100]图18示出了通过对成熟脂肪细胞施用rAM并通过定量实时PCR测量脂滴形成相关基因的表达获得的测量结果。
[0101]图19示出了在施用HFD20天后AIM+/+小鼠和AIM+小鼠的脂肪组织切片的HE染色的结果。
[0102]图20A示出了通过对分化或未分化3T3-L1细胞施用rAM并针对AM、PPAR Y 2和DAPI对细胞染色获得的结果。图20B示出了基于图20A的结果根据PPAR Y 2的表达水平对细胞分类并计算每100个每种细胞中包含rAIM的细胞的数目而获得的测量结果。图20C示出了通过对3T3-L1细胞施用rAM并针对AM和内含体或者AM和溶酶体对细胞染色获得的结果。
[0103]图21示出了使用金纳米粒子对AM标记之后与图20的样品相同的样品的电子显微镜观察的结果。
[0104]图22示出了通过使用⑶36中和抗体处理3T3-L1细胞并检测rAM对内吞作用的影响获得的结果。
[0105]图23示出了通过对⑶36+/+小鼠和⑶36+小鼠静脉注射rAM并对从脂肪组织制得的切片针对AIM和巨噬细胞进行染色而获得的结果。
[0106]图24示出了通过注射对AIM+小鼠的脂肪组织直接施用用HA-标签标记的rAM、使用脂肪组织通过抗HA抗体执行免疫共沉淀并通过免疫印记检测沉淀物中的FAS而获得的结果。
[0107]图25示出了通过使用抗Flag抗体或抗HA抗体的免疫共沉淀来证实用HA标签标记的rAM和用FLAG标签标记的FAS在HEK293T细胞中的结合而获得的结果。
[0108]图26示出了通过用Flag标签标记FAS的每个结构域、在稳定地表达AM-HA的HEK293T细胞中进行表达并通过使用抗Flag抗体或抗HA抗体的免疫共沉淀来证实FAS和AIM的结合而获得的结果。
[0109]图27示出了在存在或不存在rAM (5 μ g/ml)并存在C75 (25 μ Μ)的情况下处理6天的3T3-L1细胞的FAS活性的测量结果。
[0110]图28示出了 ΑΜ+/+小鼠和AIM+小鼠的脂肪组织中的FAS活性的测量结果。
[0111]图29示出了在之前3小时通过局部注射到脂肪中施用rAM或BSA的AM+小鼠的脂肪组织的FAS活性的测量结果。
[0112]图30示出了人源AM的氨基酸序列和小鼠AM的氨基酸序列及其之间的共有序列。
[0113]图31是示出FAS结构的概念图。
[0114]图32示出了用HFD喂饲12周的AIM+/+小鼠和AIM+小鼠的内脏脂肪量和皮下脂
肪量的变化的测量结果。
[0115]图33示出了 AIM+小鼠5周(在5周内，每周对小鼠施用HFD以及rAM或BSA两次)的体重变化的测量结果。
[0116]图34示出了 AIM+小鼠5周(在5周内，每周对小鼠施用HFD以及rAM或BSA两次)的内脏脂肪量和皮下脂肪量的变化的测量结果。
[0117]图35示出了在图33和图34中示出的实验之后的AM+小鼠的内脏脂肪中的脂肪细胞标记等的mRNA水平的测量结果。
[0118]图36示出了通过免疫印迹对狗、猫和小鼠的血清中的AM蛋白的检测结果。
[0119]图37示出了通过基于FSP27表达的筛选获得的低分子量化合物的AIM抑制活性的评价结果。
[0120]图38示出了通过基于FSP27表达的筛选获得的低分子量化合物的AM抑制活性的评价结果。
[0121]图39示出了通过基于FSP27表达的筛选获得的抗AIM抗体的AIM中和活性的评价结果。
[0122]图40示出了经全面医学检查的大约550个患者的血液AM浓度的测量结果。
[0123]图41示出了随意选择的BMI为18_25或不小于35的献血者(包括外国人)的血液AIM浓度的测量结果。
【具体实施方式】
[0124]本发明的用于预防或治疗代谢综合症及相关疾病的方法包含将AIM抑制剂施用到对象的步骤。
[0125]在本说明书中，代谢综合症是表现为一系列疾病链的概念，该一系列疾病链通常从内脏脂肪型肥胖症(内脏脂肪积累)开始，然后通过脂肪组织的慢性炎症、来自脂肪细胞的脂肪细胞因子的分泌异常和血液游离脂肪酸的异常量等引起胰岛素抗性，其后引发诸如糖尿病、高血脂症和高血压等的与生活方式相关的疾病，最后发展为各种动脉硬化疾病。疾病链的下游可以包括肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症和肾脏疾病等。
[0126]在本说明书中，代谢综合症及相关疾病包括基于在代谢综合症的发作或行进的机制中以及在代谢综合症的发作或行进的过程中产生的各种异常的任何疾病、症状和异常。例如，他们包括但不限于代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病(包括脂肪肝、肝癌)、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常和血液游离脂肪酸量异
堂
巾O
[0127]在本说明书中，以最广泛的意义和方式使用代谢综合症及相关疾病的预防或治疗，例如，胰岛素抗性的预防、延迟或改善；代谢综合症及相关疾病的发作的预防、延迟或改善；与代谢综合症及相关疾病有关的一种或多种症状的缓解；代谢综合症及相关疾病的诊断标准中的各项值的改善；等等。
[0128]作为代谢综合症的诊断标准的项的示例包括作为腹部肥胖的指标的腰部直径、血清甘油三酯值、HDL胆固醇值、血压、空腹血糖水平、葡萄糖耐量、胰岛素抗性和尿白蛋白质
含量等。[0129]在本说明书中，AM抑制剂表示通过抑制AM蛋白质的功能或表达来抑制机体中AIM蛋白质活性的物质。其示例包括但不限于低分子量化合物、高分子量化合物、肽、蛋白质和核酸等。
[0130]在本说明书中，如上所述，“AM”是作为SRCR超家族的成员的可溶性蛋白质。作为一个示例，在图30中示出了人类AIM和小鼠AM的氨基酸序列。
[0131]如下述的示例10中所示，在大部分健康个体(经过全面健康检查而无需医疗看护的个体)中，血液AM浓度是5-20 μ g/mL。此外，如示例11中所示,具有35或更高BMI的对象与具有18-25BMI的对象相比，表现出显著高的血液AM浓度。
[0132]本发明的AIM抑制剂可以抑制任何种类的AIM。例如，人类、人类之外的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马、猴)以及鸟类等中的AIM同源蛋白质的抑制剂也相当于本发明的AIM抑制剂。本领域普通技术人员可以从高水平的序列相似性和功能分析来评价其他哺乳动物或鸟类中的蛋白质是否是AIM的同源蛋白质。例如，小鼠AIM和人类AM之间的氨基酸序列的同源性高达大约80%。另外，对于小鼠AM和人类AIM，SRCR结构域中的共有序列(在具有SRCR结构域的诸如CD5、CD6等的其他分子中保守的氨基酸序列)完全相同。
[0133]作为示例，在SEQ ID NO: 1、22、23、24和25中分别示出了人类、黑猩猩、狗、小鼠和
大鼠的AIM的氨基酸序列。
[0134]另外，本发明的AM抑制剂可以抑制AM的类似物或变异体。AIM的类似物和变异体的示例包括具有其中经过缺失、取代或添加一个至几个氨基酸的AM的氨基酸序列并且保持AIM的功能的蛋白质。本领域普通技术人员可以通过高水平的序列相似性或功能分析来确定某个蛋白质是否是AIM的类似物或变异体。
[0135]在本发明中，AIM的受AM抑制剂抑制的功能是指将巨噬细胞浸润进入脂肪组织中的功能以及对于巨噬细胞浸润进入脂肪组织中所需的并且由AIM直接或间接地表现的任何功能。对于巨噬细胞浸润进入脂肪组织中所需的并且由AM直接或间接地表现的任何功能的示例包括在脂肪细胞表面上导致结合到CD36的功能；通过内吞作用导致进入脂肪细胞中的功能；在脂肪细胞中导致结合到FAS的功能；导致抑制FAS的酶活性的功能；导致促进脂滴融解的功能；通过脂滴融解引发巨噬细胞迁移的功能；等等。
[0136]通过抑制AIM的这些功能中的任何功能，可以防止巨噬细胞浸润进入脂肪组织中，巨噬细胞浸润进入脂肪组织中导致脂肪组织和整个机体的慢性炎症。因此，即使是肥胖症，也不引发胰岛素抗性，并可以在上游停止代谢综合症疾病的链式发作。
[0137](抑制AM功能的AM抑制剂)
[0138]抑制AIM的功能的AM抑制剂通过直接或间接地作用于AIM来抑制AIM的全部功能或部分功能。抑制AIM功能的机制的示例包括但不限于降低血液中AIM的稳定性、抑制AIM与CD36的结合、抑制AM进入靶细胞中、抑制AM从内含体转移到细胞质中以及抑制AM与FAS的结合等。
[0139]当施用降低血液中AIM的稳定性的抑制剂时，AIM在短时间内被降解，而未发挥其功能。
[0140]当施用抑制AM与⑶36结合的AM抑制剂时，可以抑制AIM通过内吞作用进入靶细胞中，由此可以抑制AIM的功能。
[0141]作为抑制AIM与CD36结合的物质，可以使用抑制蛋白质之间结合的任何物质，例如可以使用抗AIM抗体和抗CD36抗体。如下述的参考示例中所示，施用抗CD36抗体可以抑制AM进入靶细胞中。对于抗AM抗体，将AM对CD36的结合位点识别为抗原决定基的抗体是优选的。对于抗CD36抗体，识别CD36对AIM的结合位点的抗体是优选的。
[0142]本说明书中的“抗体”也包括抗体片段，并可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2抗体、scFv、双特异性抗体以及合成抗体等。
[0143]可以根据本领域普通技术人员已知的方法生产这些抗体。例如，可以通过从用AM免疫的非人类的哺乳动物中分离产生抗体的细胞，将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞等融合以产生杂交瘤细胞,并纯化由杂交瘤细胞产生的抗体来获得抗AIM的单克隆抗体。另外，可以从用AIM免疫的动物的血清等中获得多克隆抗体。
[0144]这里使用的用于免疫的AM可以是全长或片段，并且本领域普通技术人员可以合适地确定。当使用片段时，它 优选地包含对CD36的结合位点。
[0145]另外，当能够获得有效地抑制AM对CD36的结合的非人源的单克隆抗体时，也可以通过基因重组的方法生产抗体。例如,从产生抗AM单克隆抗体的杂交瘤细胞通过标准方法来制备总RNA，使用市售的试剂盒制备编码抗AIM抗体的mRNA，并使用逆转录酶合成cDNA，由此可以获得编码抗AM抗体的DNA。将包含该DNA的表达载体转染到合适的宿主细胞中并在合适的条件下培养宿主细胞以表达抗AIM抗体。
[0146]另外，还可以使用上述cDNA作为模版通过PCR方法来获得编码抗AM抗体的⑶R区域的DNA。利用编码⑶R区域的DNA，可以根据常规方法通过基因重组方法来生产人源抗体和人源化抗体。例如,通过PCR方法来合成编码来源于非人源抗体的⑶R区域的DNA和设计为连接到人源抗体的骨架区的DNA，再连接到编码人源抗体的恒定区的DNA，由此可以获得编码人源抗体的DNA。
[0147]根据已知的方法(利用限制酶的方法等)将这样的DNA插入到表达载体(例如，质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、诸如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒等的植物病毒、粘粒、YAC、来源于EBC的附加体)中，将表达载体转染到合适的宿主细胞中以产生转化子。表达载体还可以包含调节抗体基因表达的启动子、复制起始点和选择标记基因等。可以根据宿主细胞和载体的种类合适地选择启动子和复制起始点。
[0148]然后，在合适的条件下培养转化子以表达抗AM抗体的人源抗体。
[0149]例如，可以使用诸如哺乳动物细胞(CH0细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、HeLa细胞、Vero细胞等)、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞(酵母、曲霉等)的真核细胞以及诸如大肠杆菌(E.Coli)、枯草芽孢杆菌等的原核细胞作为宿主细胞。
[0150]可以通过已知方法(例如，使用蛋白质A等的亲和柱、其他的色谱柱、过滤、超滤、盐析、透析等)的合适的组合来分离和纯化表达的抗体。
[0151]当本发明的抗AIM抗体是诸如Fab片段、F(ab’)2抗体和scFv等的低分子量的抗体时，也可以根据上述的方法，使用编码低分子量抗体的DNA表达抗体。另外，也可以通过使用诸如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等的酶的处理来生产抗体。
[0152]也可以使用结合到抗AM抗体并且不抑制FAS活性的蛋白质作为抑制AM和⑶36结合的AM抑制剂。这样的蛋白质与AM竞争性地结合到⑶36，并且抑制由于AM结合到⑶36而对FAS活性的抑制。
[0153]结合到抗AM抗体并且不抑制FAS活性的蛋白质的示例包括AM片段、AM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段。[0154]然而，AM片段不受具体限制，只要它包含AM的部分肽，例如，可以使用包含AM功能域或保守区域的5-150个氨基酸的片段。
[0155]可以使用具有AM的经过缺失、取代或添加1-10个氨基酸的氨基酸序列并且不抑制FAS活性的蛋白质作为AIM变异体。
[0156]AIM嵌合蛋白质是指部分人源AIM蛋白质和来源于其他动物(例如小鼠)的AIM蛋白质的嵌合蛋白质。
[0157]结合到抗AM抗体并且不抑制FAS活性的蛋白质还包括AM变异体或AM嵌合蛋白质的片段。
[0158]通过常规方法获得编码蛋白质的DNA并通过基因重组的方法使DNA表达蛋白质，这样可以表达结合到抗AM抗体并且不抑制FAS活性的蛋白质。为了增加对⑶36的亲和力和在血液中的稳定性，可以视情况改变和修改氨基酸序列。必要时，可以将蛋白质表达为与其他蛋白质和肽的融合蛋白质。
[0159]另外，也可以通过生产每个全长蛋白质并用蛋白酶处理该蛋白质来获得AM片段、AIM变异体的片段和AIM嵌合蛋白质的片段。
[0160]另外，也可以使用结合到⑶36而不抑制FAS活性的蛋白质作为抑制AM和⑶36的结合的AIM抑制剂。这样的蛋白质与AIM竞争性地结合到⑶36，并且抑制因AIM结合到⑶36而对FAS活性的抑制。
[0161]结合到⑶36而不抑制FAS活性的蛋白质的示例包括AM片段、AM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段。
[0162]当施用抑制AIM进入靶细胞中的AIM抑制剂时，可以抑制AIM结合到靶细胞中的FAS并抑制其酶活性的功能。
[0163]另外，抑制AM从内含体转移到细胞质中的AM抑制剂还抑制AM结合到靶细胞中的FAS并抑制其酶活性的功能。
[0164]当施用抑制AIM和FAS的结合的AIM抑制剂时，可以直接抑制AIM对FAS的作用，例如，可以使用结合到FAS并且不抑制FAS活性的蛋白质。这样的蛋白质与AM竞争性地结合到FAS’并且抑制因AM结合到FAS而对FAS活性的抑制。
[0165]对于这种的蛋白质，优选结合到从DH、ER、TE和CC组成的组中选择的至少一个FAS结构域的蛋白质。
[0166]结合到FAS并且不抑制FAS活性的蛋白质的示例包括AM片段、AIM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段。[0167]可以通过利用AM抑制前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞、引起脂肪细胞中的脂滴融解以及减小脂肪细胞的尺寸等事实的筛选方法从候选化合物中容易地选择上面解释的抑制AM的功能的AM抑制剂。
[0168]例如，可以通过包括以下步骤的筛选方法容易地选择AM抑制剂:
[0169](i )在用于分化成为脂肪细胞的条件下培养前脂肪细胞，并且仅将AIM或AIM与候选化合物加入培养基；
[0170](ii)评价上述前脂肪细胞向脂肪细胞的分化；以及
[0171](iii)选择与仅加入AM相比，在与AM —起加入时增加分化诱导效率的候选化合物。
[0172]例如，可以使用脂肪细胞中脂滴的产生以及脂肪细胞标记、前脂肪细胞标记和/或间充质干细胞标记的表达作为指标来执行步骤(ii )。
[0173]另外，可以通过包括以下步骤的筛选方法容易地选择AM抑制剂:
[0174](a)培养脂肪细胞，并且仅将AM或AM与候选化合物加入培养基；
[0175](b)评价上述脂肪细胞中的脂滴融解；以及[0176](C)选择与仅加入AM相比，在与AM—起加入时降低脂滴融解效率的候选化合物。
[0177]例如，可以使用脂肪细胞的培养上清液中的丙三醇或游离脂肪酸的量、脂滴形成相关基因的表达等作为指标来执行步骤(b)。
[0178]另外，可以通过包括以下步骤的筛选方法容易地选择AM抑制剂:
[0179](I)培养脂肪细胞，并且仅将AM或AM与候选化合物加入培养基；
[0180](2)评价上述脂肪细胞的尺寸；以及
[0181](3)选择与仅加入AM相比，在与AM —起加入时增加脂肪细胞的尺寸的候选化合物。
[0182]例如，可以通过细胞的伊红染色来执行步骤(2)。
[0183]另外，AM抑制剂包括以下步骤:
[0184]在候选化合物的存在或不存下在包括AIM的培养基中培养脂肪细胞或前脂肪细胞；以及
[0185]评价在上述培养之后被摄入上述细胞中的AIM0
[0186]例如，可以在细胞培养步骤之后通过固定细胞、赋予渗透性、加入被标记的以允许检测的抗AM抗体以及温育细胞来检测摄入细胞中的AIM。
[0187]当在候选化合物的存在下细胞中的所述摄入减少时，可以评价该候选化合物通过抑制AM进入细胞中抑制了 AIM的功能。
[0188]另外，AM抑制剂包括以下步骤:
[0189]在候选化合物存在或不存在下在包括AIM的培养基中培养脂肪细胞或前脂肪细胞；以及
[0190]评价在上述细胞中AIM和FAS的结合。
[0191]例如，可以通过制备细胞裂解液、使用抗AIM抗体进行免疫沉淀以及使用抗FAS抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹来确定AIM和FAS的结合。
[0192]当在候选化合物的存在下AIM与FAS的结合减少时，可以评价该候选化合物通过抑制AM和FAS的结合来抑制AM的功能。
[0193]可以使用下面的化合物作为抑制AIM的功能的低分子量化合物。
[0194]
【权利要求】
1.一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的方法，所述方法包括将AIM抑制剂施用到对象的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂降低血液中AIM的稳定性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM与CD36之间的结合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM进入靶细胞中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM从内含体转移到细胞质。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM结合到脂肪酸合酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述AIM抑制剂抑制AIM的表达。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述代谢综合症或其相关疾病是从由代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常以及血液游离脂肪酸量异常组成的组中选择的至少一种。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，所述对象是人。
10.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，所述对象是非人类的哺乳动物或鸟类。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述对象是狗或猫。
12.一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的药剂，所述药剂包括从以下组中选择的至少一种: 抗AIM抗体； 抗CD36抗体； 对AM基因具有RNAi效应的双链核酸； AIM基因的反义核酸； AM基因的核酶； 结合到抗AIM抗体而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质； 结合到CD36而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质； 结合到脂肪酸合酶而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质；以及 可溶⑶36。
13.根据权利要求12所述的治疗药剂，其中，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或抗体片段。
14.根据权利要求12或13所述的治疗药剂，其中，所述结合到脂肪酸合酶而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质结合到从由DH、ER、TE和CC组成的组中选择的至少一种结构域。
15.根据权利要求12或13所述的治疗药剂，其中，所述结合到抗AIM抗体而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM变异体或其片段以及AIM嵌合蛋白质或其片段组成的组。
16.根据权利要求12或13所述的治疗药剂，其中，所述结合到CD36而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM变异体以及AIM嵌合蛋白质组成的组。
17.根据权利要求12或13所述的治疗药剂，其中，所述结合到脂肪酸合酶而不抑制脂肪酸合酶活性的蛋白质选自于由AIM片段、AIM类似物、AIM变异体以及AIM嵌合蛋白质组成的组。
18.根据权利要求15-17中任意一项所述的治疗药剂，其中，所述AIM片段选自于包含AIM蛋白质的功能域及其保守区域的片段。
19.根据权利要求12-18中任意一项所述的治疗药剂，其中，所述代谢综合症或其相关疾病是从由代谢综合症、肥胖症、胰岛素抗性、糖尿病、高血脂症、高血压、动脉硬化疾病、肝脏疾病、肝失疏泄、脑血管疾病、局部缺血性心脏病、心力衰竭、痴呆症、脑溢血、神经症、肾脏疾病、脂肪细胞因子分泌异常以及血液游离脂肪酸量异常组成的组中选择的至少一种。
20.根据权利要求12-19中任意一项所述的治疗药剂，其中，所述对象是人。
21.根据权利要求12-19中任意一项所述的治疗药剂，其中，所述对象是非人类的哺乳动物或鸟类。
22.根据权利要求21所述的治疗药剂，其中，所述对象是狗或猫。
23.一种用于预防或治疗代谢综合症或其相关疾病的方法，所述方法包括施用根据权利要求12-22中任意一项所述的治疗药剂的步骤。
24.一种生产AM抑制剂的方法，所述方法包括: 用蛋白酶处理AM以获得AM片段的步骤，以及 通过其中固定有结合到AIM的功能域或保守区域的抗AM抗体的亲和柱纯化所述AIM片段的步骤。
【文档编号】A61P3/06GK103648531SQ201180036214
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2011年5月20日 优先权日:2010年5月20日
【发明者】宫崎彻 申请人:宫崎彻, 大日本住友制药株式会社