专利名称：一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的dna疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的DNA疫苗及其应用，此种DNA疫苗可直接用于动物试验。
背景技术：
血吸虫病(schistosomiasis)是一种流行广泛、严重危害人类健康和社会经济发展的人畜共患寄生虫病。全球每年死于血吸虫病的人数超过2万。在我国流行的是日本血吸虫病。日本血吸虫(Schistosoma Japonicum, Sj)致病的主要原因是雌虫所产的大量虫卵沉积于肝、肠等组织中，形成虫卵肉芽肿、组织损伤和继发性肝纤维化，肝纤维化可进一步导致门脉高压综合症如食管胃底静脉曲张、肝脾肿大和脾功能亢进，患者可因并发上消化道出血、肝性昏迷及结肠息肉癌变等严重病症而致死。目前，血吸虫病疫苗的研究绝大多数集中在抗感染等预防性疫苗的研究上，而针对已经感染者，治疗性疫苗的研究则极少见。血吸虫感染人体后，雌虫产出虫卵为未成熟虫卵，部分沉积于肝脏，经过初产期、空泡期、胚胎期发育至成熟虫卵约需11日，虽然临床上可以使用高效的抗虫药吡喹酮杀虫治疗，但吡喹酮只能杀灭3d以上的童虫、成虫，而肝脏内的未成熟虫卵仍可继续发育，并引起组织内虫卵肉芽肿反应，目前血吸虫性肝纤维化研究的重点在于对已经形成的纤维化的治疗，尚无针对吡喹酮杀虫后由未成熟虫卵引起的肉芽肿反应的治疗方法。且血吸虫病患者发现时多已转为慢性，体内早已形成肉芽肿或肝纤维化，杀虫后病人依然有晚期转化的可能，虫卵等抗原的免疫病理反应并不因杀虫治疗而终止。因此，在血吸虫病患者杀虫化疗后，如何有效应对那些已经沉积在肝内的虫卵尤其是未成熟虫卵所产生的免疫病理反应而导致的肝纤维化的进一步发展则成为当务之急。现已证实，细胞免疫和体液免疫均参与日本血吸虫病性肝纤维化的发生、发展， 并以细胞免疫为主。肝纤维化的主要病理改变为血吸虫卵抗原的持续刺激引起TH2型反应持续存在，导致肝星状细胞异常激活转化为肌成纤维细胞并大量增殖，产生的细胞外基质(ECM)超过了机体的降解能力，致使ECM在肝内过量沉积。在肝肉芽肿、纤维化形成过程中，THZffl2极化及其免疫调节起到非常重要的作用。现已普遍认为TH1类细胞因子可以抑制肝星状细胞的增殖和胶原蛋白的合成。TH1类细胞因子中与抗纤维化作用相关主要有IFN-y、IL-12、IL-18。IL-18又名IFN-γ诱导因子，能强烈诱导NK细胞、T细胞产生 IFN-γ。Feng Wei等将含小鼠IL-18的质粒pVAX/IL-18与含日本血吸虫14kDa脂肪酸结合蛋白(SjFABP)的质粒pVAX/SjFABP、含日本血吸虫^kDa谷胱甘肽S转移酶(SB6GST) 的质粒pVAX/Sj26GST联合免疫小鼠。结果发现，联合注射pVAX/IL_18组均显著增加了 IFN- γ和IL-2产物，指示着IL-18能加强Th-I优势性免疫反应。^iang等将IL-18基因修饰的肝细胞经脾移植入感染日本血吸虫尾蚴的小鼠后，发现IL-2、IFN-Y的表达水平明显升高，而IL-4、IL-10表达水平却显著降低，形成典型的Th1型免疫应答。感染20周后， 检测发现羟脯氨酸等表达水平降低，肝脏I、III型前胶原、羟脯氨酸及胶原含量明显降低，说明IL-18可诱导日本血吸虫感染慢性期从促进肉芽肿、肝纤维化形成的Tti2型免疫应答转化为抗纤维化的Th1型应答优势，提示通过IL-18调控ThZft2极化的方向可减轻虫卵肉芽肿和肝纤维化的反应强度，以达到干预治疗肝纤维化的目的。目前抗纤维化治疗着力于消除和抑制炎症的发生发展，尚无有效治疗能明显改善或逆转纤维化相关的炎症进程。TH1细胞因子能直接抑制成纤维细胞的胶原合成，说明TH1 细胞因子是一种潜在的抗纤维化治疗靶点，其中能明显改善感染肝脏纤维化且已应用于临床的TH1细胞因子有IFN- γ。然而传统的细胞因子免疫治疗是将利用生物工程技术生产的细胞因子注入患者体内，通过血液循环到达免疫原局部而起作用，这种治疗必需连续、大剂量用药，这势必导致毒副作用增加及宿主体内细胞因子严重失衡。因此，理想的治疗方法是即能有效的利用此类细胞因子进行抗肝纤维化治疗，同时又能将其导致的毒副作用和其它部位正常组织的细胞因子失衡减至最低。单链抗体(single chain Fv antibody, scFv)作为基因工程抗体的一种，是具有完整抗原结合位点的最小功能片段，与完整抗体比较，具有更大的优越性分子量小，免疫原性低，组织穿透力强，定位迅速，清除快，易于基因工程制备和改造等，目前已有多种单链抗体用于肿瘤的临床检测，取得了较满意的效果。而且已有多个人源性单链抗体获美国FDA 的批准，但目前尚无单链抗体用于血吸虫病治疗的报道。本课题组利用噬菌体展示技术构建了日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原单链抗体库，集落挖掘法从中筛选得到一株与天然分子候选疫苗SIEA^5-28kDa特异性结合的scFv，通过大肠杆菌表达系统诱导可溶性单链抗体高效表达，并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein, EGFP) 与特异性SIEA^-28kDa单链抗体进行融合表达，通过对EGFP的绿色荧光检测显示，特异性单链抗体能与未成熟虫卵及雌虫生殖系统特异性结合，结合部位主要在未成熟卵卵胚、 雌虫卵黄腺、卵巢及与生殖系统邻近的肠壁内膜，与运用亲本抗体检测结果相似。Western blotting检测也发现此scFv蛋白不仅能与SIEA，而且能与成熟虫卵可溶性抗原(SEA)和成虫抗原(AWA)特异性结合，说明此scFv对日本血吸虫从雌成虫到未成熟虫卵、成熟虫卵各个阶段都具有高特异性靶向免疫识别能力。随后，我们利用高度纯化的scFv为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库，获得两个编码SIEA^-28kDa疫苗候选分子的基因，通过构建真核重组质粒免疫小鼠，获得了较好的抗日本血吸虫感染的免疫保护效果。证实了此抗 SIEA26-28kDa的scFv具有潜在应用价值。细胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技术是当今疾病免疫研究的一个热点方向。该方法是利用基因工程技术将两种或多种具有相同或相关功能活性但各自作用靶点不同的细胞因子融合在一起，使融合基因表达的产物既具有各因子独特的生物学活性或使其某些活性显著提高，又可能通过协同效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具备的复合生物学功能。在此基础上，将抗体分子的片段与细胞因子融合，表达的融合蛋白不但可以保留抗体分子片段与抗原特异性结合的特性，还具有细胞因子的多功能免疫学活性， 从而可借助抗体将细胞因子导向到特定的靶部位发挥高效生物学功能，同时减轻全身毒副作用。Heuser等构建了抗黏蛋白的scFv-Fc-IL-2融合蛋白(C595scFv-Fc-IL_2)，证实此融合蛋白能同时特异性地结合MUCI+的肿瘤细胞和CD25+的免疫效应细胞。Halin等采用抗纤连蛋白(fibronectin，FN)的scFv L-19与IL-12融合，发现应用该融合蛋白治疗比应用等量的IL-12具有更强的抗转移效应。Helguera等将鼠GM-CSF与HER2抗体融合，观察到该融合蛋白既保持了与人HER2/neU抗原的特异性结合能力，同时也保持了与重组鼠 GM-CSF相似的生物学活性，在小鼠体内能够明显抑制表达HER2/neU的肿瘤细胞生长，能同时增强Th1和Ttl2型细胞的免疫应答。
发明内容
本发明的目的是提供一种对日本血吸虫病肝纤维化具有有效治疗作用的DNA疫苗及其应用方法。一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的DNA疫苗，以具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体scFv与细胞因子IL-18DNA融合，转入真核表达载体构成，所述的具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO :1。所述的DNA疫苗制备如下以具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体scFv和细胞因子 IL-18DNA为模板，同时根据两个模板和两个模板之间45bp的链接片段glycine-rich linker[(GlyJer)3]设计特异性引物(含5’或3’酶切位点)，经PCR扩增分别得到scFv+1 inker和lingker+IL_18DNA，随后经重叠PCR扩增得到scFv和IL-18融合 DNA:scFv-IL18 ；将其转入真核表达载体pVAXl即得。扩增scFv+1 inker的引物序列为SEQ ID NO 2 Pl :5，-CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3’SEQ ID NO 3 P2
5 ‘ - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC
CCGTTTGATTTCCA-3‘；扩增lingker+IL-18的引物序列为SEQ ID NO 4 P3
5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCG
ATGGCTGCTGAACCAGTAG-3‘SEQ ID NO 5 P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3‘。所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18融合DNA: scFv_IL18的核苷酸序列为SEQ ID NO :6。所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18融合DNA: scFv_IL18的氨基酸序列为SEQ ID NO :7。所述的DNA疫苗可用于制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物。传统的细胞因子免疫治疗需要连续、大剂量的注射，对人体正常器官损伤较大。因此本发明旨在利用scFv对日本血吸虫从雌成虫到未成熟虫卵、成熟虫卵各个阶段均具有高特异性靶向免疫识别能力的特性，同时具有抗生殖产卵和卵胚发育的效果，将该单链抗体与对血吸虫性肝纤维化具有免疫调理作用的细胞因子IL-18融合表达，产生scFv-IL18融合蛋白，借助scFv的靶向和免疫作用，通过IL-18对虫卵肉芽肿和肝纤维化形成的干扰， 诱导日本血吸虫感染慢性期从Tti2型免疫应答转化为Th1型优势的免疫应答，在病灶局部调控ThZft2极化的方向以减轻虫卵肉芽肿和肝纤维化的反应强度，同时还能大大降低IL-18 对其它正常组织器官的毒副作用，达到增强scFv-IL18治疗日本血吸虫病肝纤维化的效果。
图1是本发明全套scFv、IL-18基因的PCR扩增图；图2是本发明全套scFv_IL18基因的S0E-PCR扩增图；图3是本发明构建的真核质粒pVAXl/SjscFv-ILlS双酶切鉴定图；图4是本发明在正常小鼠体内表达后产生的IL-18图；图5是本发明对日本血吸虫性肝纤维化BALB/c鼠体内Thl/Th2型细胞因子表达的影响；图6是本发明对日本血吸虫性肝纤维化BALB/c鼠肝肉芽肿大小和胶原纤维含量的影响。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明日本血吸虫病肝纤维化治疗性DNA疫苗pVAXl/Sj scFv-IL18进行详细说明，而不会构成对本发明的限制。实施例11、scFv+1 inker 禾口 1 ingker+IL—18 的扩增根据具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体scFv(其氨基酸序列见 SEQ ID NO :8)、IL-18基因序列和链接片段(Gly4Ser)3]序列设计特异性引物，用引物Pl 和 P2 扩增 scFv+1 inker [即(Gly4Ser)3],反应条件为-MV 预变性 5min ； 94 °C 50sec, 58°C 30sec,72°C Imin ；共30个循环。最后72°C延伸5min。引物P3和P4扩增linker [即 (GlyJer) J+IL-18，反应条件为94°C预变性 5min ；94°C 50sec,76°C 30sec,72°C Imin ；共 30个循环。最后72°C延伸5min。产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。引物序列如下(下划线代表酶切位点，粗体部分为加入的连接片段序列)Pl :5，-CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3’ (EcoR I)P2
5 ‘ - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC
CCGTTTGATTTCCA-3‘P3
5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCG
ATGGCTGCTGAACCAGTAG-3‘P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3‘ (XhoI)2、SOE-PCR 扩增 scFv_IL18 融合 DNA上述scFv+1 inker和lingker+IL-18片段经琼脂糖凝胶电泳后使用PCR产物纯化试剂盒纯化后，纯化产物(各50ng)按1 1混合，行SOE-PCR进行连接，反应条件如下94°C延伸 5min，94°C 50sec,60°C lmin,72°C Imin 30sec，共 10 个循环，72°C延伸 8min。得到scFv-IL18融合DNA，1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。3、真核质粒 pVAXl/Sj scFv_IL18 的构建从过夜培养的LB (含Kana终浓度50mg/L)平板上挑取单个含有pVAXl质粒的大肠杆菌菌落(PVAXl质粒购于hvitrogen公司)，接种于5ml LB/Kana液体培养基，37°C振摇培养过夜，按Takara公司质粒小量提取试剂盒说明书进行质粒的小量提取纯化。将scFv_IL18和pVAXl质粒分别进行EcoR I和Xho I双酶切，酶切体系如下表所示，37°C酶切4h后，在紫外灯下切下酶切片段，用Takara的琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化酶
切产物。
权利要求
1.一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的DNA疫苗，其特征在于，以具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体scFv与细胞因子IL-18DNA融合，转入真核表达载体构成，所述的具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO=I0
2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗制备如下以具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体scFv和细胞因子IL-18DNA为模板，同时根据两个模板和两个模板之间45bp的链接片段glycine-rich linker [ (Gly4Ser) 3]设计特异性引物，经PCR扩增分别得到scFv+1 inker和lingker+IL_18DNA，随后经重叠PCR扩增得到scFv 和IL-18融合DNA:scFv-IL18 ；将其转入真核表达载体pVAXl即得。
3.根据权利要求2所述的DNA疫苗，其特征在于 扩增scFv+1 inker的引物序列为SEQ ID NO 2 Pl 5' -CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3‘ SEQ ID NO 3 P2 5' - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCCGTTTGATTTCCA-3‘；扩增lingker+IL-18的引物序列为 SEQ ID NO 4 P3 5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCGATGGCTGCFGAACCAGTAG-3 SEQ ID NO 5 P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3'。
4.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18 融合DNA:scFv-IL18的核苷酸序列为SEQ ID NO :6。
5.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18 融合DNA:scFv-IL18的氨基酸序列为SEQ ID NO :7。
6.权利要求1-5任意一项所述的DNA疫苗的应用方法，其特征在于，用于制备治疗日本血吸虫病肝纤维化药物。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体为一种对日本血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的DNA疫苗及其应用。利用自行研制的具有免疫靶向和抗血吸虫卵胚作用的单链抗体scFv，将其与细胞因子IL-18融合，利用特异性单链抗体的免疫靶向作用和抗血吸虫卵卵胚的作用，结合IL-18的免疫调理，增强了对血吸虫病肝纤维化的治疗效果。
文档编号A61K48/00GK102526761SQ20121001131
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者何卓, 冯其梅, 周云飞, 尹铁球, 张树菊, 汪世平, 田智 申请人:中南大学