专利名称：多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法
技术领域：
本发明属于生物组织和器官的人工制造技术领域，特别涉及利用合成高分子材料、细胞基质材料制备组织器官前体的工艺方法，属于生物组织工程技术领域。
背景技术：
世界上每年患有组织缺损或器官衰竭的病人数逾千万。然而，活体供体器官有限，现有的机械装置不具备器官的所有功能，不能防止患者的病情进一步恶化。据此，以提高此类疾患治疗水平为宗旨的组织工程(Tissue Engineering)技术应运而生。组织工程学是由美国国家科学基金委员会于1987年正式提出和确定的，是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的科学。组织工程是一门由生物学、医学、材料学、工程学等多学科交叉产生的高新技术学科。其含义是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物。Wolter在1984年正式提出“组织工程” 一词，1987年美国国家科学基金委员会正式确定组织工程学成为一门新学科。多年来科学家们运用组织工程技术，利用人体残余器官的少量正常细胞进行体外繁殖，希望获得患者所需的、具有相同功能的器官，并不存在排斥反应，取得了可喜的成果。但现存的组织工程技术面临许多困难和限制，组织工程应用研究所取得的成功均是在那些结构与生理功能较为简单的组织器官如骨骼、软骨、皮肤。传统组织工程方法一般先制备结构支架，在进行细胞培养过程中由于上层细胞消耗大部分的氧气和营养，限制了这些组分向底层扩散，从而限制了细胞向支架深层的迁移等，达不到及时治疗临床病人的要求。传统的单一组织支架制备技术很难形成具有营养供应通道分层组织并可诱导分化的组织器官前体。同时传统的组织工程技术不能满足将不同的细胞在空间准确定位与定点放置，构建复杂组织器官的功能梯度结构的需求。据统计中国已成为器官移植第二大国，每年接受器官移植的患者在一万例左右，但我国每年约有一百五十万例患者需要进行器官移植，急需新型科技手段出现用以大量快速有效的培育出自体器官。一种多通道多细胞复合组织器官前体的制备方法恰好可以满足这一巨大市场的前期关键需求，并为随后的完整组织器官生长提供了必要的准备
发明内容
本发明的目的是提供一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，旨在前人工作的基础上，利用组合模具分步灌注，实现多层细胞结构和支架材料在空间的准确定位，成形多营养物质通道多种生长因子的复合组织器官前体。利用模具组合、高分子凝固成形等原理实现复杂组织器官的重建，本发明可成形含不同细胞基质材料与合成高分子支架的复杂三维结构，克服了组织工程存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长、细胞分布不均匀，细胞很难渗入到内层结构中等缺点。
本发明的技术方案如下—种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤进行I)将合成高分子材料溶于有机溶剂中，制成质量百分浓度为20% 50%的合成高分子溶液；2)分别制备质量百分浓度为1% 30%的多种天然高分子溶液，将多种天然高分子溶液与不同种类动物细胞悬浮液分 别按I 99 I体积比混合制成多种细胞基质溶液；动物体细胞悬浮液中细胞浓度为I X IO4个/mL I X IO7个/mL ；3)预先设计好主模具和与主模具周向内表面贴合的内模具，所述主模具底部设有阵列布置的棒状结构，将内模具嵌入主模具形成组合模具，将一部分合成高分子溶液罐注到组合模具中，通过干膜法或湿膜法除去有机溶剂，形成底层合成高分子材料支架；4)将一种或多种细胞基质溶液分层罐注到组合模具中，再经物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，形成多层稳定的细胞基质层结构；5)将内模具从组合模具中移除，将合成高分子溶液灌入内模具遗留的缝隙和多层细胞基质层结构的上表面，通过干膜法或湿膜法除去有机溶剂，然后去除主模具，制成多通道及多层细胞结构的复杂组织器官前体。所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸与乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一种或几种材料的复合物。所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的至少一种。所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于在细胞基质溶液中还加入体积百分比为1% 30%的冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于在细胞基质溶液中加入体积百分比为O. 001% O. I %细胞生长因子；所述生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子和肝细胞生长因子中的一种或几种。所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述动物体细胞采用干细胞或成体细胞，所述干细胞为脂肪干细胞、血液干细胞或骨髓干细胞，所述成体细胞为肝细胞、心肌细胞或神经细胞。所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于步骤I)中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或1，4- 二氧六环；步骤2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化钠、3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液。所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述的主模具由金属或硬质高分子材料制成，所述的主模具及内模具的截面形状为圆形、椭圆形、多边形，或类似器官表面形状的结构。本发明所制备的带有多通道多层细胞结构的复合组织器官前体中合成高分子支架材料具备优异的机械性能，这种内部细胞基质外部复合高分子材料中间孔隙贯通的结构可避免单纯细胞基质植入体内散落进而被自体吞噬这一难题。其中细胞基质溶液具有优异的生物相容性，多层细胞结构可以在其中形成多种组织。本发明可以实现多层细胞结构/天然高分子材料与合成高分子支架材料在空间的准确定位，克服了组织工程存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长、细胞种类单一、细胞分布不均匀、细胞层超过一定厚度后密闭其中的细胞不易成活、无营养液通道、干细胞分层分化困难、支架外形局限性强等缺点。本发明利用组合模具法、高分子凝固成形等原理达到复杂器官中不同部位不同细胞类型及结构类型的要求，为实现复杂组织器官的重建打下基础。
图I是本发明中主模具与内模具的 三维示意图(以圆柱体形状为例)。图2a是本发明中组合模具的主视图(以圆柱体形状为例)。图2b是图2a的A-A剖视图。图3a是本发明中主模具的主视图(以圆柱体形状为例)。图3b是图3a的A-A剖视图。图4是多通道多层细胞结构复合组织器官前体的剖面分层图(以双层细胞基质层为例)。在图I至图4中I-内模具；2_主模具；3_底层高分子材料支架；4_细胞基质层结构。具体实施方法本发明提供的一种多通道多细胞复合组织器官前体的制备方法，其具体工艺步骤如下I)将合成高分子材料溶于有机溶剂中，制成质量百分浓度为20% 50%的合成高分子溶液；2)分别制备质量百分浓度为1% 30%的多种天然高分子溶液，将多种天然高分子溶液与不同种类动物细胞悬浮液分别按I 99 I体积比混合制成多种细胞基质溶液；动物体细胞悬浮液中细胞浓度为I X IO4个/mL I X IO7个/mL ；3)预先设计好主模具2和与主模具周向内表面贴合的内模具1，所述主模具底部布置有阵列的棒状结构，将内模具I内嵌入主模具2形成组合模具，将合成高分子溶液罐注到组合模具中，通过干膜法或湿膜法除去有机溶剂，形成底层合成高分子材料支架3 ；4)将一种或多种细胞基质溶液分层罐注到组合模具中，再经物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，形成多层稳定的细胞基质层结构4 ；5)将内模具I从组合模具中移除，再将合成高分子溶液灌入内模具I遗留的缝隙与多层细胞基质层结构上表面，通过干膜法或湿膜法除去有机溶剂，去除主模具2，制成多通道及多层细胞结构的复杂组织器官前体。本发明的优选方案是在所述的细胞基质溶液中还加入体积百分比为1% 30%的冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。在所述的细胞基质溶液中加入体积百分比为O. 001% O. 1%细胞生长因子。所述的细胞生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子或肝细胞生长因子等单一或复合生长因子。所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸与乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一种或几种材料的复合物。所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的至少一种。所述动物体细胞采用干细胞或成体细胞，所述干细胞为脂肪干细胞、血液干细胞或骨髓干细胞，所述成体细胞为肝细胞、心肌细胞或神经细胞。步骤I)中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇 或1，4- 二氧六环；步骤2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的O. 09M氯化钠、3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液。所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述的主模具2由金属或硬质高分子材料制成，所述的主模具2及内模具I的截面形状为圆形、椭圆形、多边形，或类似器官表面形状的结构。实施例I :1)制备一系列尺寸不等的黄铜材质配套组合模具；2)配制50% (W/V)的PLGA/—四二氧六环溶液，加入I % (W/W)的肝素，灌入主模具内。使用自然风干的干膜法形成PLGA底层支架；2)配制纤维蛋白原溶液，将内模具套入主模具内部，在组合模具中注入明胶/纤维蛋白原与内皮细胞的混合物，细胞密度为IXlO7个/mL;3)加入肝细胞生长因子(HGFO. 5ng/mL)、人血小板衍化生长因子(BB或TOGF-BB 50ng/mL)、转化生长因子β KTGF^ I 10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(b_FGF 2. 5ng/mL)。使细胞天然高分子材料分布均匀，注入凝血酶溶液(20IU/mL)使细胞/天然高分子材料层形成稳定结构；4)移除内模具，在细胞/天然高分子材料层上表面及内模具遗留空隙处灌注PLGA/ —四二氧六环溶液，风干形成PLGA表层及周向支架；5)移除主模具，用缝合线贯穿通道固定，完成多通道多细胞复合组织器官前体的制备。实施例2 1)用硅橡胶制备多通道组织器官前体的配套组合模具；2)配制25%的聚氨酯/乙二醇溶液，加入5%的紫杉醇搅拌均匀，灌入主模具内。使用细胞培养液萃取法形成外层聚氨酯层，套入内模具；3)配制含5%紫杉醇的纤维蛋白原/内皮细胞混合物(细胞密度为I X IO7个/mL)，灌注至组合模具中加凝血酶溶液(20IU/mL)，形成第一层主体材料；4)在第一层主体材料上注入明胶/纤维蛋白原与脂肪干细胞的混合物，细胞密度为
IX IO6个/mL，形成第二层主体材料；5)在第二层主体材料上注入纤维蛋白原/肝细胞混合物(细胞密度为I X IO7个/mL)，用凝血酶溶液(10IU/mL)浸泡成形物I分钟，形成三层结构材料；6)移除内模具，在细胞/天然高分子材料层上表面及内模具遗留空隙处灌注聚氨酯/乙二醇溶液，经过细胞培养液萃取形成表层及周向聚氨酯层支架；7)移除主模具，在通道处涂覆可诱导为血管的生长因子，促进附近组织血管化，完成可植入型人工肝脏前体的制备。实施例3 1)制备一系列尺寸不等的聚四氟乙烯配套组合模具；2)配制浓度为30%的聚乳酸/异丙醇溶液，加入30%的柠檬酸钠，搅拌均匀，灌入主模具内。使用PBS萃取法形成底层支架，套入内模具；3)配制I %柠檬酸钠的胶原/内皮细胞混合物(细胞密度为I X IO7个/mL)，灌注至组合模具中，37°C下放置10分钟，使胶原/内皮细胞混合物结构稳定，形成第一层主体材料；4)在第一层主体材料上注入胶原/平滑肌细胞混合物(细胞密度为I X IO7个/mL) ;37°C下放置10分钟，使胶原/平滑肌细胞混合物结构稳定，形成第二层主体材料；5)在第二层主体材料上注入胶原与脂肪干细胞/乳鼠心肌细胞(I I)的混合物，细胞密度为I X IO6个/mL，37°C孵化箱中放置10分钟，形成第三层主体材料；6)移除内模具，在细胞/天然高分子材料层上表面及内模具遗留空隙处灌注聚乳酸/异丙醇溶液，经过PBS萃取形成表层及周向支架；7)移除主模具，完成可植入型人工心脏前体的制备。实施例4 1)用聚四氟乙烯制备配套的主模具及内模具；2)配制30% PU/四乙二醇溶液，灌入主模具内。使用PBS萃取形成底层支架，套入内模具；3)配制下列溶液纤维蛋白原和明胶两种天然生物材料分别溶于磷酸缓冲液(PBS)溶液中制成10%和30%的高分子溶液，再按I : l(v/v)比例混合均匀。然后按体积比加入10%的二甲基亚砜、5%葡聚糖；将脂肪干细胞与肾小球细胞按I : I比例混合均匀，加至高分子溶液中，得到脂肪干细胞-肾小球细胞-明胶-纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物(细胞密度为I X IO4个/mL)，灌注至组合模具中，并用凝血酶溶液(30IU/mL)固定2分钟；4)移除内模具，在细胞/天然高分子材料层上表面及内模具遗留空隙处灌注PU/四乙二醇溶液，经过PBS萃取溶剂，形成表层及周向支架；5)移除主模具，将上述三维结构体在4°C下放置半小时，后置 于-20°C冰箱中半小时，最后放入-70°C低温冰箱液氮中低温保存，使用时快速复温，培养以备使用。实施例5 1)制备一系列尺寸不等的黄铜材质配套组合模具；2)配制含3%紫杉醇的30 %聚酯/四乙二醇溶液，灌入主模具内，经过PBS萃取溶剂，形成底层支架，套入内模具；3)将纤维蛋白原溶于磷酸缓冲液(PBS)溶液中制成10%高分子溶液。然后按体积比加入20%的甘油、5%葡聚糖；将脂肪干细胞与胰岛细胞按2 I比例混合均匀，加入高分子混合溶液中(细胞密度为I X IO7个/mL)，得到脂肪干细胞-胰岛细胞、明胶-纤维蛋白原-二甲基亚砜-葡聚糖混合物，灌注至组合模具中，用凝血酶溶液(10IU/mL)固定2分钟；4)移除内模具，在细胞/天然高分子材料层上表面及内模具遗留空隙处灌注聚酯/四乙二醇溶液，经过PBS萃取溶剂，形成表层及周向支架；5)移除主模具，将上述三维结构体在4°C下放置半小时，后置于-20°C冰箱中半小时，最后放入_196°C液氮中低温保存，使用时快速复温，加入培养液于37°C、5% CO2条件下培养备用。
权利要求
1.一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤进行 1)将合成高分子材料溶于有机溶剂中，制成质量百分浓度为20% 50%的合成高分子溶液； 2)分别制备质量百分浓度为1% 30%的多种天然高分子溶液，将多种天然高分子溶液与不同种类动物细胞悬浮液分别按I 99 I体积比混合制成多种细胞基质溶液；动物体细胞悬浮液中细胞浓度为I X IO4个/mL I X IO7个/mL ； 3)预先设计好主模具(2)和与主模具周向内表面贴合的内模具(1)，所述主模具底部设有阵列布置的棒状结构，将内模具(I)嵌入主模具(2)形成组合模具，将一部分合成高分子溶液罐注到组合模具中，通过干膜法或湿膜法除去有机溶剂，形成底层合成高分子材料支架⑶； 4)将一种或多种细胞基质溶液分层罐注到组合模具中，再经物理或化学交联方法，使细胞基质溶液中的天然高分子交联，形成多层稳定的细胞基质层结构(4)； 5)将内模具(I)从组合模具中移除，将合成高分子溶液灌入内模具(I)遗留的缝隙和多层细胞基质层结构的上表面，通过干膜法或湿膜法除去有机溶剂，然后去除主模具(2)，制成多通道及多层细胞结构的复杂组织器官前体。
2.按照权利要求I所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述的合成高分子材料采用聚氨酯、乳酸与乙醇酸共聚物、聚乳酸和聚酯中的一种或几种材料的复合物。
3.按照权利要求I所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述的天然高分子材料采用明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤粘连蛋白中的至少一种。
4.按照权利要求I所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于在细胞基质溶液中还加入体积百分比为I % 30%的冻存保护剂，所述的冻存保护剂采用甘油、二甲基亚砜、乙二醇和葡聚糖中的一种或两种材料的混合物。
5.按照权利要求I或4所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于在细胞基质溶液中加入体积百分比为0. 001% 0. 1%细胞生长因子；所述生长因子采用内皮细胞生长因子、细胞转移因子、人血小板衍化生长因子、转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子中的一种或几种。
6.按照权利要求5所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述动物体细胞采用干细胞或成体细胞，所述干细胞为脂肪干细胞、血液干细胞或骨髓干细胞，所述成体细胞为肝细胞、心肌细胞或神经细胞。
7.按照权利要求I所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于步骤I)中用于溶解所述合成高分子材料的有机溶剂采用四乙二醇、乙二醇、异丙醇或1，4_ 二氧六环；步骤2)中用于溶解所述天然高分子材料的溶剂采用水、生理盐水、PBS溶液、pH = 6 8的0. 09M氯化钠、3-羟甲基氨基甲烷盐酸溶液或细胞培养液。
8.按照权利要求I所述的一种多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，其特征在于所述的主模具(2)由金属或硬质高分子材料制成，所述的主模具(2)及内模具(I)的截面形状为圆形、椭圆形、多边形，或类似器官表面形状的结构。
全文摘要
多通道多层细胞结构的复合组织器官前体的制备方法，该方法首先制备一种或多种细胞基质溶液和合成高分子溶液，将合成高分子溶液罐注到主模具中形成支架下表面，将一种或多种细胞基质溶液分层灌注到组合模具中交联形成多层细胞基质层；移除内模具，将合成高分子溶液灌注到细胞基质层外表面和周边空隙处形成外支架，去除组合模具即可。本发明可成形含均匀内部通道的不同细胞基质材料与合成高分子支架外壳结合的复杂多通道三维结构，克服了组织工程存在的在三维支架中诱导培养细胞需要时间长、细胞种类单一、细胞分布不均匀、细胞层超过一定厚度后密闭其中的细胞不易成活、无营养液通道、干细胞分层分化困难、支架外形局限性强等缺点。
文档编号A61L27/44GK102631710SQ201210110388
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者王小红 申请人:清华大学