专利名称：治疗感染性与恶性疾病的标靶化学治疗药物的形成方法
技术领域：
本发明涉及关于ー种融合蛋白，其用于结合前驱药物以治疗癌症。
背景技术：
人类表皮癌的主要特征在于表皮生长因子受体(EGFR)家族的生长因子与受体的功能活化。由生长因子-生长因子受体(EGF-EGFR axis)所主导的信息传递途径在癌细胞的增生、存活、转移、与血管新生中扮演了重要的角色(Ciardiello, F. , and Tortora,G. EGFR antagonists in cancer treatment,N Engl J Med 358,1160-1174,2008.)。相对较为安全的前驱药物5-氟胞卩密唳(5-fluorocytosine, 5-FC)可通过胞U密唳脱氨酶(cytosine deaminase)转化为常用的化疗药物5_氟尿卩密唳(5-fIuorouraciI, 5-FU)。相较于 5-FC, 5-FU 的毒性为 1000 倍(Miller, C. R.，Williams, C. R.，Buchsbaum,D. J. , and Gillespie, G. Y. Intratumoral5-fluorouraciI produced by cytosinedeaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental humanglioblastomas, Cancer Res 62, 773-780, 2002 ；Hamstra, D. A. , Rice, D. J. , Fahmy, S.,Ross, B.D. , and Rehemtulla, A. Enzyme/prodrug therapy for head and neck cancerusing a catalytically superior cytosine deaminase, Hum Gene Ther 10,1993—2003,1999.)。许多表皮生长因子受体过度表达的癌症，例如头颈癌、胰脏癌、大肠直肠癌等，经常以5-FU治疗。然而5-FU的高全身毒性为重要问题。因此，需要标靶型前驱药物/药物系统以将化疗药物集中于肿瘤所在位置。
发明内容
本发明提供ー种融合蛋白，其与前驱药物結合以治疗癌症，其中所述的融合蛋白包含(i)配体，其与选自由促血管生成素(Angiopoietin)、大脑衍生神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor)、睫状神经营养因子(Ciliary NeurotrophicFactor)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)、纤维母細胞生长因子(FibroblastGrowth Factor)、神经胶质衍生神经营养因子(Glial Derived Neurotrophic Factor)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor)、调蛋白(Heregulin)、类胰岛素生长因子(Insulin-like Growth Factor)、介白素(Interleukin)、角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor)、巨嗷细胞发炎蛋白(Macrophage InflammatoryProtein)、巨嗷细胞趋化蛋白(Macrophage Chemoattractant Protein)、神经生长因子(Nerve growth factor)、神经营养因子(Neurotrophin)、血小板衍生生长因子(PlateletDerived Growth Factor)、色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium Derived Factor)、血小板因子(Platelet Factor)、基质细胞衍生因子(Stromal Cell Derived Factor)、干细胞因子(Stem Cell Factor)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitorof metalloproteinase)、转型生长因子(Transforming Growth Factor)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor)、以及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor)所组成群组的生长因子受体特异性结合；(ii)前驱药物酵素，其可将所述的前驱药物转化为活性药物成分；以及(iii)连接子，其位于该配体与该前驱药物酵素之间。在一实施例中，本发明提供此处所述的融合蛋白与前驱药物结合以制备用于治疗癌症的药物组合物的用途。在另ー实施例中，本发明提供ー种DNA建构体，其包含(i) ー编码与生长因子受体特异性结合的配体的核苷酸序列，其中该配体选自由促血管生成素、大脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、表皮生长因子、纤维母细胞生 长因子、神经胶质衍生神经营养因子、肝细胞生长因子、调蛋白、类胰岛素生长因子、介白 素、角质细胞生长因子、巨噬细胞发炎蛋白、巨噬细胞趋化蛋白、神经生长因子、神经营养因子、血小板衍生生长因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基质细胞衍生因子、干细胞因子、基质金属蛋白酶组织抑制因子、转型生长因子、肿瘤坏死因子、以及血管内皮生长因子所组成的群组；以及(ii) 一编码前驱药物酵素的核苷酸序列。
实施例显示于附图中用以说明本发明。然而应理解的是，本发明不限于此处所显示的较佳实施例。在附图中图I为本发明的酵母菌表达建构体(yeast expression constructs)的示意图。图2a 为 pPICZ-a -Fcy-hEGF-myc-hiS6 的 DNA 建构体与序列(4198bp)。图2b 为 pPICZ-a -Fcy-Fur-hEGF-myc-his6 的 DNA 建构体与序列(4951bp)。图2c为针对酵母菌表达宿主而优化的pPICZ- a -Fcy- (VPGVG) 2-hEGF-cMyc_KKKRKV-6His (4213bp)的DNA建构体与序列。图2d 为 pPICZ-a -Fcy-hVEGFa-myc_his6 的 DNA 建构体与序列(4384bp)。图2e 为 pPICZ-a -Fcy-Fur-hVEGFa-myc_his6 的 DNA 建构体与序列(5137bp)。图3为本发明的E. coli表达建构体(E. coli expression constructs)的不意图。图4a 为 pET56-Fcy-hEGF-His6 的 DNA 建构体与序列(5785bp)。图4b 为 pET56-Fcy-Fur-hEGF-His6 的 DNA 建构体与序列(6538bp)。图4c 为 pET56-Fcy-hVEGFa_His6 的 DNA 建构体与序列(5971bp)。图4d 为 pET56-Fcy-Fur-hVEGFa-His6 的 DNA 建构体与序列(6742bp)。图4e 为 pET56-Fcy-Fur-hVEGFc-His6 的 DNA 建构体与序列(6685bp)。图4f 为 pET56-Fcy-mVEGFa-His6 的 DNA 建构体与序列(5977bp)。图4g 为 pET56-Fcy-Fur-mVEGFa-His6 的 DNA 建构体与序列(6730bp)。图4h 为 pET56-Fcy-Fur-mVEGFc_His6 的 DNA 建构体与氛基酸序列(6685bp)。图5显示经纯化的his6标记的Fcy、hEGF、以及Fcy-hEGF的考马斯蓝(Coomassieblue)染色凝胶与西方墨点法的結果。图6显示(a)经纯化的蛋白与经固定的表皮生长因子受体(EGFR)于体外结合的示意图，以及(b)his6标记的Fey、hEGF、以及Fcy-hEGF与EGFR于体外结合的饱和曲线(saturation curves)与亲和カ(affinity)。图7显示流式细胞分析的结果，用以评估抗EGFR抗体、经纯化的his6标记的Fey、hEGF、以及Fcy-hEGF 与 A431 (a)、MCF_7 (b)、MDA_468 (c)、以及MDA-231 (d)细胞的结合程度。图8显示通过经纯化的Fcy与Fcy-hEGF于体外将5_FC转化为5_FU的酵素活性結果。图9a至图9d显示MTT分析的結果，其用以评估受到Fcy-hEGF与5-FC影响的A431、MDA-468、MDA-231、MCF-7、以及 HUVEC 的细胞存活率。图10显示通过Fcy-EGF增进5_FC细胞毒性的結果。 图11显示MTT分析的結果，其用以评估在递增浓度的5-FC存在下受到Fcy-hEGF影响的HCT116与LS174T的細胞存活率。图12显示5-FC结合Fcy-hEGF对于HCT116大肠癌于体内生长的抑制效果。图13为癌症标靶前驱药物-生长因子融合建构体的克隆策略，其中“生长因子”部分的DNA序列可编码选自下列蛋白所組成群组的任一者促血管生成素(Angiopoietin)、大脑衍生神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor)、睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Factor)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)、纤维母細胞生长因子(Fibroblast Growth Factor)、神经胶质衍生神经营养因子(GlialDerived Neurotrophic Factor)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor)、调蛋白(Heregulin)、类膜岛素生长因子(Insulin-like Growth Factor)、介白素(Interleukin)、角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor)、巨嗷细胞发炎蛋白(MacrophageInflammatory Protein)、巨嗷细胞趋化蛋白(Macrophage Chemoattractant Protein)、神经生长因子(Nerve growth factor)、神经营养因子(Neurotrophin)、血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor)、色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium DerivedFactor)、血小板因子(Platelet Factor)、基质细胞衍生因子(Stromal Cell DerivedFactor)、干细胞因子(Stem Cell Factor)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(Tissueinhibitor of metalloproteinase)、转型生长因子(Transforming Growth Factor)、月中瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor)、以及血管内皮生长因子(Vascular EndothelialGrowth Factor);以及“前驱药物酵素”部分的DNA序列可编码选自由下列蛋白所組成群组的任一者酒精脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)、减性憐酸酶(Alkaline phosphatase)、乙型内酰胺酶-lactamase)、乙型葡糖苷酸酶-glucoronidase)、羧酸酯酶(Carboxyesterases)、羧妝酶A (Carboxypeptidase A)、羧妝酶G2 (Carboxypeptidase G2)、胞啼唳脱氨酶(Cytosine deaminase)、胞啼唳脱氨酶尿啼唳磷酸核糖转移酶(Cytosinedeaminase-uracil phosphor ibosy I transferase)、糖苷酶(Glycosidases)、石肖為还原酶(Nitroreductase)、青霉素酸胺酶(Penicillin amidase)、胸腺啼卩定激酶(thymidinekinase)0
具体实施例方式除非另有定义，此处所使用的技术性与科学性词汇具有本发明所属技术领域的技术人员所共同理解的意义。除非另有定义，当用于此处时下列词汇具有所认定的意义。此处所使用的冠词“一”或“该”代表其语法上的意义为ー或大于ー(亦即至少为一)。举例而言，一元素代表一元素或大于一元素。用于此处时,一 “个体”为具有癌症或可能具有癌症的任何动物，例如哺乳类且尤其包含人类。
此处所使用的词汇“聚胜肽”指通过胜肽键连结的氨基酸残基所组成的分子或聚合物。聚胜肽可由使用例如自动聚胜肽合成仪而合成。此处所使用的词汇“蛋白”典型地代表大型聚胜肽。“胜肽”典型地代表较短的聚胜肽。当用于此处吋，“融合蛋白”为透过结合编码ニ个或多个原始为不同蛋白的基因所创造的蛋白。当用于此处吋，“前驱药物”指在给药时，必须历经前驱药物酵素的化学转化才成为活性药剂的化合物。当用于此处吋，“前驱药物酵素”为能够将前驱药物转化为活性药剂的酵素。当用于此处吋，“连接子”为短片段的聚胜肽。当用于此处吋，“聚核苷酸”或“核酸”指核苷酸单元组成的聚合物。聚核苷酸包含自然产生的核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)与核糖核酸(RNA)以及核酸类似物，包含非自然合成的核酸，例如重组聚核苷酸。聚核苷酸可利用例如自动DNA合成仪来合成。词汇“核酸”典型地代表大型聚核苷酸。将被理解的是，当以DNA序列代表核苷酸序列时(亦即A、T、C、G)，其同时包含RNA序列(亦即A、U、C、G)，其中U取代T。词汇“cDNA”代表与mRNA互补或完全一致的DNA，无论是单股或双股形式。此处所使用的词汇“编码”代表聚核苷酸中特定核苷酸序列的固有性质(例如基因、cDNA、或mRNA)，以在生物过程中作为其它聚合物与巨分子的模板，该聚合物与巨分子具有核苷酸(亦即rRNA、tRNA、与mRNA)的定义序列、或是氨基酸的定义序列，以及由此产生的生物性质。因此，若由一基因转录所产生的mRNA于细胞或其它生物系统中进行转译而产生蛋白，则该基因可为此蛋白的编码。所属技术领域的技术人员可理解的是，由于基因密码简并的结果，因此许多不同的聚核苷酸与核酸可编码出相同的聚胜肽。亦可理解的是，所属技术领域的技术人员可使用常规使用的技术取代核苷酸而不影响所述聚核苷酸所编译出的聚胜肽序列，此反映了欲表达此聚胜肽的任何特定宿主有机体的密码子使用偏好。因此，除非另有特别指出，否则“可编译氨基酸序列的聚核苷酸”包含可编译出相同氨基酸序列的任何互为简并的聚核苷酸序列。编码蛋白与RNA的聚核苷酸可包含内含子(intixm)。此处所使用的词汇“重组聚核苷酸”意指具有非自然性相互结合序列的聚核苷酸。重组聚核苷酸可以载体(vector)的形式存在。“载体”可包含目标核苷酸序列以及调控序列。载体可用以表达给定的核苷酸序列或維持给定的核苷酸序列以将此序列复制、操控、或是于不同位置间转移(例如于不同有机体之间)。载体可为了上述的目的而导入适合的宿主细胞。载体的范例包含但不限于质体(plasmid)、黏质体(cosmid)、YAC、或PAC。典型地，在载体中给定的核苷酸序列与调控序列操作性地连结，故当载体导入宿主细胞中时，给定的核苷酸序列可在调控序列的控制下于宿主细胞中表达。举例而言，调控序列可包含促进子(promoter)、起始密码子(start codon)、复制区(replication region)序列、增强子(enhancer)、操纵子(operator)序列、分泌信号(secretion signal)序列(例如IL2信号胜肽)、以及其它调控序列。较佳地，载体可进ー步包含标记序列(例如抗生素抗性标记序列)以便于进行筛选。氨基酸可由三字母或单字母表达。表I列出了标准氨基酸縮写。表I :标准氨基酸缩写
氨基酸rwirr^i
Alanine(丙氨酸)AlaA
Arginine (精氨酸)ArgR
Asparagine (天冬醜氨酸)AsnN Aspartic acid(天冬氨酸)AspD
Cysteine (半胱氨酸)CysC
Glutamic acid(谷氨酸)GluE
Glutamine (谷氨酰氨)GlnQ
Glycine(甘氨酸)GlyG
Histidine (组氨酸)HisH
Isoleucine(异亮氨酸)IleI
Leucine (亮氨酸)LeuL
Lysine (赖氨酸)LysK
Methionine (甲硫氨酸)MetM
Phenylalanine(苯丙氨酸)PheF
Proline(脯[氨酸)ProP
Serine (丝氨酸)SerS
Threonine (苏氨酸)ThrT
Tryptophan (色氨酸)TrpW
Tyrosine (酪氨酸)TyrY
Valine(缴氨酸)ValV
本发明的特征在于一与前驱药物结合以治疗癌症的融合蛋白，其中该融合蛋白包含(i)与生长因子受体(growth factor receptor)特异性结合的配体(ligand),其选自由促血管生成素、大脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、神经胶质衍生神经营养因子、肝细胞生长因子、调蛋白、类胰岛素生长因子、介白素、角质细胞生长因子、巨噬细胞发炎蛋白、巨噬细胞趋化蛋白、神经生长因子、神经营养因子、血小板衍生生长因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基质细胞衍生因子、干细胞因子、基质金属蛋白酶组织抑制因子、转型生长因子、肿瘤坏死因子、以及血管内皮生长因子所组成的群组；(ii)前驱药物酵素，其可将该前驱药物转化为活性药物成分；以及(iii)连接子，其位于该配体与该前驱药物酵素之间。根据本发明的ー实施例，该融合蛋白包含的前驱药物酵素选自由酒精脱氢酶、碱性磷酸酶、こ型内酰胺酶、こ型葡糖苷酸酶、羧酸酯酶、羧肽酶A、羧肽酶G2、胞嘧啶脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶、糖苷酶、硝基还原酶、青霉素酰胺酶、胸腺嘧啶激酶所组成的群组。
在本发明的一实施例中，该前驱药物酵素位于该融合蛋白的氨基端且该配体位于该融合蛋白的羧基端。在本发明的特定实施例中，该配体为表皮生长因子(EGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)。具体地说，此处所使用的”配体”具有选自由SEQ ID NO = Il(EGF)与SEQ ID NO 2-5 (VEGF)所组成群组的氨基酸序列。根据ー实施例，用以治疗癌症的前驱药物为5-FC且前驱药物酵素为胞嘧啶脱氨酶或与尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合的胞嘧啶脱氨酶。具体地说，此处所使用的“前驱药物酵素”具有SEQ ID NO 6( “胞嘧啶脱氨酶”或“Fey”)或SEQ ID NO 7( “与尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合的胞嘧啶脱氨酶”或“Fcy-Fur”)的氨基酸序列。在本发明的一实施例中，该融合蛋白具有选自由SEQ ID NO : 8 (Fcy-hEGF)、SEQID NO 9 (Fcy-Fur-hEGF), SEQ ID NO 10 (Fcy- (VPGVG) 2-hEGF-cMyc-KKKRKV), SEQ ID NO:ll(Fcy-hVEGFa)、SEQ ID NO : 12 (Fcy-Fur-hVEGFa)、SEQ ID NO :13 (Fcy-hEGF)、SEQ ID NO:14 (Fcy-Fur-hEGF)、SEQ ID NO : 15 (Fcy-hVEGFa)、SEQ ID NO :16 (Fcy-Fur-hVEGFa)、SEQ IDNO 17(Fcy-Fur-hVEGFc)、SEQ ID NO 18 (Fcy-mVEGFa)、SEQ ID NO 19 (Fcy-Fur-mVEGFa)、以及SEQ ID NO 20 (Fcy-Fur-mVEGFc)所组成群组的氨基酸序列。在另ー实施例中，本发明提供一种此处所描述的融合蛋白与前驱药物结合以制备用于癌症治疗的医药组合物的用途。在又一实施例中，本发明提供ー种DNA建构体包含(i) ー编码与生长因子受体特异性结合的配体的核苷酸序列，其中该配体为选自由促血管生成素、大脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、神经胶质衍生神经营养因子、肝细胞生长因子、调蛋白、类胰岛素生长因子、介白素、角质细胞生长因子、巨噬细胞发炎蛋白、巨噬细胞趋化蛋白、神经生长因子、神经营养因子、血小板衍生生长因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基质细胞衍生因子、干细胞因子、基质金属蛋白酶组织抑制因子、转型生长因子、肿瘤坏死因子、以及血管内皮生长因子所组成的群组；以及(ii) 一编码前驱药物酵素的核苷酸序列。根据本发明另ー实施例，该DNA建构体包含编码前驱药物酵素的核苷酸序列，其选自由酒精脱氢酶、碱性磷酸酶、こ型内酰胺酶、こ型葡糖苷酸酶、羧酸酯酶、羧肽酶A、羧肽酶G2、胞嘧啶脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶、糖苷酶、硝基还原酶、青霉素酰胺酶、胸腺嘧啶激酶所组成的群组。在本发明的特定实例中，与生长因子受体特异性结合的配体的核苷酸序列编码为选自由 SEQ ID NO SEQ ID NO 21 (EGF)与 SEQ ID NO 22-25 (VEGF)所组成的群组。在本发明的特定实例中，编码前驱药物酵素的核苷酸序列为SEQ ID NO 26 (Fcy)或 SEQ ID NO 27 (Fcy-Fur)。在本发明的实施例中，本发明的DNA建构体具有选自由SEQ ID NO 28 (Fcy-hEGF)、SEQ ID NO 29 (Fcy-Fur-hEGF), SEQ ID NO 30 (Fcy- (VPGVG) 2-hEGF-cMyc-KKKRKV)、SEQ ID NO :31 (Fcy-hVEGFa)、SEQ ID NO 32 (Fcy-Fur-hVEGFa), SEQ ID NO:33 (Fcy-hEGF)、SEQ ID NO 34 (Fcy-Fur-hEGF)、SEQ ID NO 35 (Fcy-hVEGFa)、SEQ ID NO 36 (Fcy-Fur-hVEGFa)、SEQ ID NO :37 (Fcy-Fur-hVEGFc)、SEQ ID NO :38 (Fcy-mVEGFa)、SEQID NO :39 (Fcy-Fur-mVEGFa)、以及 SEQ ID NO :40 (Fcy-Fur-mVEGFc)所组成群组的核苷酸序列。本发明将以接下来的实施例进ー步说明，其提供以为示范的目的而非用以限制。实施例I :于酵母菌表达载体中 Fcy-hEGF-myc-hiS6、Fcy_Fur-hEGF-myc-his6、hEGF-myc_his6、以及 Fcy-myc_his6 的 DNA 克隆表达Fcy与Fur的基因序列使用来自酵母菌的cDNA基因库作为模板并以PCR加以扩增，其中人类EGF与VEGF使用源自人类癌症细胞株SK0V3-ip I的cDNA基因库作为模板并以PCR加以扩增。PCR的产物以限制酶BamHI与EcoRI处理，其目标序列已由PCR引子导入，且连接至以相同限制酶BamHI与EcoRI切割的蛋白表达载体pPICZ-a。Fcy与hEGF是个别克隆到此载体中，位于氨基端的a -分泌信号胜肽(a -secreting signalpeptide)之后,其中羧基端为已内建于pPICZ-a载体中的c_myc与六组氨酸(myc_his6)标签以便于蛋白辨识与纯化。另ー个Fcy的PCR产物于5’与3’两端均具有BamHI辨识序列，将此产物以BamHI切割后与同样以BamHI切割的pPIC-a -hEGF-myC-his6建构体接合，pPIC-a-hEGF-myC-his6在以BamHI切割后先以小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理避免载体再度接合。于酵母菌表达载体 pPICZ-a 中 Fcy-hEGF-myc-hiS6、Fcy-Fur-hEGF-myc_his6、hEGF-myc_his6、以及Fcy-myc_his6的示意图如图I所示。图2a至图2e显示图2a pPICZ- a -Fcy-hEGF-myc-hiS6 (4198bp)、图 2bpPICZ_a -Fcy-Fur-hEGF-myc-his6 (495lbp)、图2c 针对酵母菌表达优化的建构体 pPICZ- a -Fcy- (VPGVG) 2-hEGF-cMyc-KKKRKV_6His (4213bp)、图 2d pPICZ- a -Fcy-hVEGF-myc-his6 (4384bp)、以及图 2e pPICZ- a -Fcy-Fur-hVEGF-myc-his6(5137bp)所获得核苷酸与氨基酸序列的图谱。实施例2:于细菌表达载体中 Fcy-hEGF-myc-hi S6、Fcy-Fur-hEGF-myc_his6、hEGF-myc_his6、以及 Fcy-myc_his6 的 DNA 克隆为了探讨除了酵母菌之外宿主中的蛋白表达，发明人建构了与Fcy或Fcy-Fur融合的生长因子，例如EGF或VEGF。图3显示E. coli表达载体pET56中Fcy-hEGF(或VEGF) -hi s6, Fcy-Fur-hEGF (或 VEGF)-hi S6、hEGF (或 VEGF)-hi S6、以及 Fcy_his6 融合基因的示意图。与酵母菌表达建构体的克隆策略相似，所需的融合基因以PCR扩增且以不同组的限制酶NcoI与XhoI切割。经切割的片段克隆到以相同限制酶切割的载体pET56中。所获得的建构体显示于图4a至图4h中。实施例3 Fcy-hEGF-myc-hiS6> hEGF-myc_his6、以及 Fcy-myc_his6 的表达与纯化于pPICZ-a 建构体中的 Fcy-hEGF-myc-hiS6、hEGF-myc-hiS6、或 Fcy-myc-hiS6 转型(transformed)到野生型X-33毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中，于含有zeocin抗生素(200 u g/mL)的洋菜培养盘上培养3到4天直到出现菌落。以抗c_myc的抗体侦测筛选高蛋白表达的各个菌落。为了大量表达，将筛选出的菌落接种于含有0. 5升BMD培养基的摇瓶中、培养至OD6tltl为8-10、且每日添加甲醇以诱导蛋白表达。诱导3天之后，收集含有蛋白的培养基且于注入镍树脂管柱(nickel-resin column) (Qiagen)之前先行过滤。将管柱以10倍管柱体积且含有5mM咪唑(imidazole)的PBS清洗，且使用AKTAprimeplus纯化系统(人KTAprime plus purification system)增加咪唑的浓度以洗漆出蛋白。此蛋白以考马斯蓝(Coomassie blue)染色的SDS-PAGE凝胶(图5右侧)以及利用c-myc特异性抗体进行西方墨点分析加以鉴定(图5左側)。
实施例4 Fcy-hEGF-myc-hiS6> hEGF-myc-hiS6> 以及 Fcy-myc_his6 与经纯化的EGFR的体外结合图6显示测量Fcy-hEGF-myc-hi S6与固定在ELISA盘上经过纯化的EGFR于体外结合的示意图。Fcy-hEGF-myc-hi S6、hEGF-myc-hi S6 > 以及 Fcy-myc_his6 与固定在ELISA盘上经过纯化的EGFR的体外结合使用标记HRP (辣根过氧化酶)的抗His6抗体测量。Fcy-hEGF-myc-hiS6以及hEGF-myc_his6与EGFR的结合亲和力分别为5nM与9nM,而Fcy-myc-hi S6与EGFR之间则无法辨识有结合(图6右側)。实施例5 :Fcy-hEGF-myc_his6、hEGF-myc-hiS6> 以及 Fcy-myc_his6 结合具有不同EGFR表达量的细胞A431、MDA-468、MDA-231、以及MCF-7细胞中EGFR的表达量以荧光活化细胞分选仪(FACS)进行分析。将细胞表面以抗EGFR抗体cetuximab (尔必得舒(erbitux))染色,接着以标记FITC的抗人类IgG抗体结合cetuximab。为了测试经过纯化的Fcy-hEGF-myc-hiS6、hEGF-myc-hiS6、以及 Fcy-myc_his6 与 EGFR 的结合能力，将 A431、MCF-7、MDA-468、以及MDA-231分别与标记有his6的蛋白共同培养I小吋。稍后将细胞与标记FITC的his6特异性抗体共同培养，接着进行FACS分析。荧光强度代表由cetuximab侦测到的EGFR量、或是与癌症细胞连结具hiS6标记的蛋白量(见图7)。实施例6 Fcy-hEGF-myc-hiS6 与 Fcy-myc_his6 的体外酵素活性Fcy-hEGF与Fcy的酵素活性通过测量5-FU的产量而测得。将50nanomoIe的Fcy-hEGF-myc-his6(I. 25mg)或 Fcy-myc_his6(0. 75mg)加入 37°C含有递增 5-FC 浓度(O、0. 03、0. 1、0. 3、1、与3mM)的0. 3ml PBS中以启动5-FC转换为5-FU。每3分钟抽取2 yl的反应物且使用NanoDrop 2000分光亮度计(Thermo Scientific)测量5-FC与5-FU的荧光強度。5-FU的浓度通过Senter等人推导的公式[5_FU]mM = 0. 185x A255-0. 049xA290测量 255nm 与 290nm 的吸光值加以计算(Senter, P. D.，Su, P. C.，Katsuragi, T.，Sakai, T.，Cosand, ff. L. , Hellstrom,I. ,and Helistrom，K. E. (1991)Generation of 5—fluorouraci丄from 5-fluorocytosine by monoclonal antibody—cytosine deaminase conjugates,Bioconjug Chem 2,447-451)。不同浓度的 5-FC 下 5-FU 的生成率(V)是使用 Graphpadprism 5软件(圣地雅哥，美國)适配至Michaelis-Menten equation,如图8所不。纯化的Fcy-hEGF与Fcy蛋白对5-FC的km值分别为0. 25及0. 49mM。5-FU生成的Vmax对于Fcy-hEGF与Fcy蛋白分别为177及mrnin-1。实施例I MTT分析以测量经过Fcy-hEGF与5-FC处理的A431、MDA-468、HUVEC,MDA-231、以及MCF-7的细胞存活率为了验证 5-FC/Fcy-hEGF-myc-hi S6 对于细胞存活率的效果，A431、MDA-468、HUVEC、MDA-231、与 MCF-7 于 0. lmg/ml 的 5-FC 存在下与递增浓度的 Fcy-hEGF-myc-hiS6 共同培养(图9a与图9d)，同时另ー个实验使用固定量的FCy-hEGF-myC-his6(0. 2iig/ml)与递增浓度的5-FC(0-lmg/ml)进行(图9b与图9c)。在添加蛋白与5-FC达3天之后，培养于96 孔培养盘中的细胞以 MTT (3- (4, 5-Dimethylthiazol_2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoIiumbromide)分析存活率。将25 的MTT溶液(5mg/ml于PBS中)添加至96孔培养盘。作用2小时之后，移除MTT溶液、以PBS清洗细胞、且接着添加0. Iml萃取缓冲液(20%十二烷基硫酸钠于50%ニ甲基甲酰氨中)。在37°C经过4小时作用之后，使用盘式读取仪(Bio-Rad)于570nm测量吸光值，并以萃取缓冲液作为对照。相较于EGFR表达较少的HUVEC、MDA_231、 与 MCF-7，5-FC 与 Fcy-hEGF-myc-hiS6 对于 EGFR 过度表达的 MDA-468 与 A431 的 IC5tl 较低(见图10)。实施例8 =MTT分析以测量表达EGFR的大肠癌细胞LS174T及HCT116受Fcy-hEGF与5-FC抑制的细胞存活率与实施例7相似，以MTT分析测量受到Fcy-hEGF (0. 2 U g/ml)与递增浓度5-FC影响的表达EGFR大肠癌细胞LS174T与HCTl 16的细胞存活率。当5-FC的IC5tl分别为2. 5 y g/ml (10 PM)与6. 0 ii g/ml (24 ii M)时，可观察到对于LS174T与HCT116细胞有显着的效果。具体如图11所示。实施例9 Fcy-hEGF/5-FC于体内抑制HCT116的生长使用过度表达EGFR的大肠癌细胞HCT116进行动物实验。将细胞以皮下接种于balb/c裸鼠的后背双侧。当肿瘤于2周后到达3-5mm的长度时,姆3天以20 y g的Fcy或Fcy-hEGF处理小鼠。小鼠姆天注射IOmg的5_FC(500mg/kg)。2种处理组别的肿瘤尺寸如图12所示。相较于Fcy, Fcy-hEGF呈现较佳的抗肿瘤效果(p = 0. 03)。实施例10 :癌症标靶前驱药物-生长因子融合蛋白的示意图除了显示于图I到图4a_4h中的建构体，亦可建构如图13所示同时包含生长因子与前驱药物酵素的DNA建构体及其所生蛋白。“生长因子”部分的DNA序列可编码选自由促血管生成素、大脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、神经胶质衍生神经营养因子、肝细胞生长因子、调蛋白、类胰岛素生长因子、介白素、角质细胞生长因子、巨噬细胞发炎蛋白、巨噬细胞趋化蛋白、神经生长因子、神经营养因子、血小板衍生生长因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基质细胞衍生因子、干细胞因子、基质金属蛋白酶组织抑制因子、转型生长因子、肿瘤坏死因子、以及血管内皮生长因子所组成群组的其中任一者。“前驱药物酵素”部分的DNA序列可编码选自由酒精脱氢酶、碱性磷酸酶、こ型内酰胺酶、こ型葡糖苷酸酶、羧酸酯酶、羧肽酶A、羧肽酶G2、胞嘧啶脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶(在酵母菌中为Fcy-Fur)、糖苷酶、硝基还原酶、青霉素酰胺酶、及胸腺嘧啶激酶所组成群组的其中任一者。
权利要求
1.一种用于治疗癌症的融合蛋白，其特征在于，用干与癌症治疗的前驱药物結合，其中该融合蛋白包含 (i)配体，其与选自由促血管生成素(Angiopoietin)、大脑衍生神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor)、睫状神经营养因子(Ciliary NeurotrophicFactor)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor)、纤维母細胞生长因子(FibroblastGrowth Factor)、神经胶质衍生神经营养因子(Glial Derived Neurotrophic Factor)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor)、调蛋白(Heregulin)、类胰岛素生长因子(Insulin-like Growth Factor)、介白素(Interleukin)、角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor)、巨嗷细胞发炎蛋白(Macrophage InflammatoryProtein)、巨嗷细胞趋化蛋白(Macrophage Chemoattractant Protein)、神经生长因子(Nerve growth factor)、神经营养因子(Neurotrophin)、血小板衍生生长因子(PlateletDerived Growth Factor)、色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium Derived Factor)、 血小板因子(Platelet Factor)、基质细胞衍生因子(Stromal Cell Derived Factor)、干细胞因子(Stem Cell Factor)、基质金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitorof metalloproteinase)、转型生长因子(Transforming Growth Factor)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor)、以及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor)所組成群组的生长因子受体特异性结合； (ii)前驱药物酵素，其可将该前驱药物转化为活性药物成分；以及 (iii)连接子(linker)，其位于该配体与该前驱药物酵素之间。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，该前驱药物酵素选自由酒精脱氢酶(Alcohol dehydrogenase)、减性憐酸酶(Alkaline phosphatase)、乙型内酉先胺酶(& -lactamase)、乙型葡糖苷酸酶(P -glucoronidase)、羧酸酯酶(Carboxyesterases)、羧妝酶A (Carboxypeptidase A)、羧妝酶G2 (Carboxypeptidase G2)、胞啼唳脱氨酶(Cytosinedeaminase)、胞啼卩定脱氨酶尿啼卩定憐酸核糖转移酶(Cytosine deaminase-uracilphosphor ibosy I transferase)、糖苷酶(Glycosidases)、硝基还原酶(Nitroreductase)、青霉素酰胺酶(Penicillin amidase)、胸腺啼卩定激酶(thymidine kinase)所组成的群组。
3.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，该前驱药物酵素位于该融合蛋白的氨基端，且该配体位于该融合蛋白的羧基端。
4.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，该配体为表皮生长因子(EGF)。
5.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，该配体为血管内皮生长因子(VEGF)。
6.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，用于癌症治疗的前驱药物为5-氟胞啼唳(5-fluorocytosine)，且该前驱药物酵素为胞啼卩定脱氨酶(cytosine deaminase)或与尿啼卩定磷酸核糖转移酶(uracil phosphor ibosy I transferase)融合的胞啼唳脱氨酶(cytosine deaminase)。
7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，该配体具有SEQID NO: I所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，该配体具有SEQID NO :2-5所组成群组的氨基酸序列。
9.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，该前驱药物酵素具有SEQID N0:6或SEQ ID NO 7所不的氣基酸序列。
10.根据权利要求3的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白具有选自由SEQID NO 8-20所组成群组的氨基酸序列。
11.一种权利要求I所述的融合蛋白结合前驱药物用以制备癌症治疗的医药组合物的用途。
12.—种DNA建构体，其特征在于，包含 (i)ー编码与生长因子受体特异性结合的配体的核苷酸序列，其中该配体选自由促血管生成素、大脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、神经胶质衍生神经营养因子、肝细胞生长因子、调蛋白、类胰岛素生长因子、介白素、角质细胞生长因子、巨噬细胞发炎蛋白、巨噬细胞趋化蛋白、神经生长因子、神经营养因子、血小板衍生生长因子、色素上皮衍生因子、血小板因子、基质细胞衍生因子、干细胞因子、基质金属蛋白酶组织抑制因子、转型生长因子、肿瘤坏死因子、以及血管内皮生长因子所组成的群组；以及 (ii)一编码前驱药物酵素的核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的DNA建构体，其特征在干，该前驱药物酵素选自由酒精脱氢酶、碱性磷酸酶、こ型内酰胺酶、こ型葡糖苷酸酶、羧酸酯酶、羧肽酶A、羧肽酶G2、胞嘧啶脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶、糖苷酶、硝基还原酶、青霉素酰胺酶、胸腺嘧啶激酶所组成的群组。
14.根据权利要求12所述的DNA建构体，其特征在于，编码与生长因子受体特异性结合的配体的核苷酸序列选自由SEQ ID NO :21-25所组成的群组。
15.根据权利要求13所述的DNA建构体，其特征在于，编码前驱药物酵素的核苷酸序列为 SEQ ID NO 26 或 SEQ ID NO :27。
16.根据权利要求12所述的DNA建构体，其特征在于，该DNA建构体具有选自由SEQIDNO 28-40所组成群组的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供一种治疗感染性与恶性疾病的标靶化学治疗药物的形成方法，一种融合蛋白，其与前驱药物结合而用于癌症治疗，其中该融合蛋白包含(i)配体，其与生长因子受体特异性结合，(ii)前驱药物酵素，其可将该前驱药物转换为活性药物成分，以及(iii)链结子，其位于该配体与该前驱药物酵素之间。本发明亦提供一种DNA建构体，其包含(i)编码与生长因子受体特异性结合的配体的核苷酸序列，以及(ii)编码前驱药物酵素的核苷酸序列。
文档编号A61P35/00GK102807620SQ20121018104
公开日2012年12月5日 申请日期2012年6月4日 优先权日2011年6月2日
发明者蓝耿立, 施易升, 颜上惠, 张正, 蓝耿欣 申请人:台北荣民总医院