含有猪圆环病毒2型抗原与副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：含有猪圆环病毒2型抗原与副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪用疫苗组合物，具体涉及一种同时抵抗猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌(HPS)感染的疫苗组合物及其制备方法与应用。
背景技术：
猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCVl和PCV2。PCVl为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。PMWS的临床特征有消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、腹泻、黄疽等。病理变化可见全身淋巴结肿大，特别是腹股沟淋巴结肿大可达5 10倍；肺主要呈弥 散性、间质性肺炎变化，质地硬如橡皮，表面一般呈灰褐色的斑驳状外观；肾的变化较多，可见皮质和髓质散在大小不一的白色坏死灶，由于水肿而导致其呈现蜡样外观；脾轻度肿大；大多病猪的肝有不同程度的萎缩、纤维化。除PMWS外，猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2相关的猪病，死亡率达10% 30%不等，较严重的猪场在暴发时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。副猪嗜血杆菌病又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称Glasser氏病。该病是由副猪嗜血杆菌引起。副猪嗜血杆菌只感染猪，可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5 8周龄的猪，发病率一般在10% 15%，严重时死亡率可达50%临床症状取决于炎症部位，包括发热、呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪或死亡。母猪发病可流产，公猪有跛行。哺乳母猪的跛行可能导致母性的极端弱化。死亡时体表发紫，肚子大，有大量黄色腹水，肠系膜上有大量纤维素渗出，尤其肝脏整个被包住，肺的间质水肿。大量文献报道，猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染非常普遍(鲁杏华等，中国兽医杂志，2010，(03): 46 48 ;贾松涛等，中国畜牧兽医，2008，(08): 99 100;等等)。因此,需要能同时抵抗PCV2感染以及副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物。鲍春兴等〃浅析疫苗免疫失败的原因及对策〃(畜牧兽医科技信息2010，(02)8 12)，报道两种疫苗接种的间隔时间不够，或有些养殖户因防疫任务繁琐，为了省事，把两种疫苗同时接种，疫苗进入机体后，疫苗抗原之间可能产生竞争性抑制，造成免疫失败。为了避免免疫失败，猪场一般采取PCV2疫苗和副猪嗜血杆菌疫苗的分别免疫的策略，二种疫苗免疫的时间间隔15天以上，以避免两种抗原之间的干扰，这就造成多次重复注射，加大了动物应激并且提高了防疫成本，防疫效果也不确切。

发明内容
本发明通过大量的筛选研究，意外发现猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌的抗原制备的疫苗组合物，二种抗原相互并不会相互干扰或影响；相反地，猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌的抗原组合物和疫苗组合物不仅能够产生更佳的保护性免疫应答的同时，还意外发现副猪嗜血杆菌增强了猪圆环病毒2型抗原(PCV2)的免疫效果，特别是与副猪嗜血杆菌组合的情况下，即使PCV2抗原量减半仍能维持PCV2的免疫效果。因此本发明的第一方面在于提供预防或治疗猪圆环病毒2型(PCV2)抗原和副猪嗜血杆菌抗原感染的疫苗组合物。为了实现上述目的，本发明预防或治疗猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌感染的抗原组合物，其包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种副猪嗜血杆菌抗原。本发明的猪圆环病毒2型抗原是指含有至少一种PCV2抗原形式的任何组合物，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列(如0RF2蛋白)的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。PCV2抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原如梅里亚公司(Merial)的Circovac ;辉瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn鲁PCV2 ;哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亚单位疫苗(如勃林格 殷格翰公司(Boehringer-1ngelheim)的 Ingelvac CircoFLEX馨)优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原，其中优选使用PCV2 SH株，保藏号为CGMCC No. 23890，公开于专利文献CN101240264A。因PCV2基因组大小为1767bp或1768bp，不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90%以上，因此PCV2SH株(GenBank登录号为AY686763)、PCV2LG株(GenBank登录号为HM038034)、PCV2 DBN-SX07-2 (GenBank登录号为HM641752)的抗原组合物或疫苗组合物均在本发明保护范围之内。优选地，本发明的疫苗中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量至少为105_ 5TCID5tl更优选4. 5 X IO5 0TCID50 106_ tlTCID5tl ;再优选每剂量或每头份(2ml)含 PCV2 病毒 9X 105 CITCID5。。优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成份，更优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV20RF2蛋白。其中，本发明PCV2 0RF2蛋白，优选序列表SEQNO1. DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75%以上的、优选80%以上的、更优选90%以上的氨基酸序列的蛋白，为能达到本发明目的的蛋白序列。本发明对PCV2 0RF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV2 0RF2蛋白都可用作本文所述PCV2 0RF2DNA和/或多肽的来源。优选地，本发明的疫苗组合物中，所述PCV2 0RF2蛋白生物的含量为O. 5 20yg/头份，更优选5 10yg/头份副猪嗜血杆菌抗原是指含有至少一种副猪嗜血杆菌抗原形式的任何组合物，所述副猪嗜血杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。副猪嗜血杆菌为包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的I 15个血清型。优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌，优选为灭活形式，更优选，所述副猪嗜血杆菌抗原是灭活的血清型为4型和5型的混合抗原；最优选为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株，和灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株。其中，副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus parasuis Serotype 4, Strain JS)保藏号为CCTCC NO:M 2011172;副猪嗜血杆菌血清 5 型 ZJ 株(Haemophilus parasuisSerotype 5, Strain ZJ)的保藏号为:CCTCC Ν0:Μ 2011173;保藏日期均为2011年5月18日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。本发明的副猪嗜血杆菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1 ;海博莱公司(Hipra)的Hiprasuis-Glasser ;武汉科前动物生物制品有限责任公司的副猪嗜血杆菌灭活疫苗(4型MD0322株+5型SH0165株)。正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。因此，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA (16S rRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的副猪嗜血杆菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，
16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)因此，本发明包括与副猪嗜血杆菌两株菌株(JS株、ZJ株)16SrRNA的同源性在80%上以上的菌株，更优选与JS株或ZJ株16SrRNA同源性在至少90%以上，优选地至少95%以上，更优选地至少95% 99%以上的副猪嗜血杆菌菌株，即不改变副猪嗜血杆菌两株菌株(JS株、ZJ株)16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的副猪嗜血杆菌，获得与本发明副猪嗜血杆菌16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清4型副猪嗜血杆菌为JS株，保藏号为CCTCC No. M2011172。优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前前含量为IX IO9CFU/头份 8X IO9CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量为2 X IO9CFU/头份，再优选所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量I X IO9CFU/头份。优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清5型副猪嗜血杆菌为ZJ株，保藏号为CCTCC No. M2011173。优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为IX IO9CFU/头份 8X IO9CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为I X IO9CFU/头份，再优选所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量2 X IO9CFU/头份。本发明的优选方式涉及疫苗组合物的佐剂，优选为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Montanide Gel、蜂胶、ISA206、ISA760VG、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种的一种或几种组合物。
优选地，本发明提供的预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，含有PCV2106· tlTCID5tl/头份，血清4型副猪嗜血杆菌4 X IO9CFU/头份，含血清5型副猪嗜血杆菌4X IO9CFU/头份，疫苗佐剂为10% (V/V) Montanide Gel佐剂。疫苗组合物还可以包含其它猪的病原体的附加抗原。附加抗原优选猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原、猪肺炎支原体抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)抗原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪流感病毒(SIV)抗原及它们的组合。由上可见，本发明中预防和治疗猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物，不仅未产生两种抗原成份的相互免疫干扰，而且还意外发现副猪嗜血杆菌增强了猪圆环病毒2型抗原的免疫效果。作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述PCV2抗原为PCV2 0RF2蛋白。所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的全菌抗原。
优选地，本发明的疫苗组合物中，所述PCV20RF2蛋白生物的含量为O. 5 20 μ g/头份，更优选5 10yg/头份。优选地，本发明的疫苗组合物中，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌JS株的灭活抗原和副猪嗜血杆菌ZJ株的灭活抗原。优选地，本发明的疫苗组合物中，所述副猪嗜血杆菌JS株灭活抗原的含量为
IX 109^8X109CFU/头份和副猪嗜血杆菌ZJ株灭活抗原的含量为IX IO9 8 X IO9CFU/头份。优选地，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二 (辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种。优选地，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗佐剂为卡波姆、壳聚糖的一种或两种。作为本发明的另外一种实施方式在于提供另一种预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，其中，含有灭活的PCV2全病毒和灭活的血清4型及5型副猪嗜血杆菌，疫苗佐剂和其它赋形剂。优选地，本发明的疫苗组合物中所述PCV2病毒为PCV2SH株。优选地，本发明的疫苗中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量2. 2 X 105_ 0TCID50 106_ 0TCID50 ;更优地为每剂量或每头份(2ml)含PCV2病毒4. 5 X 105· 0TCID50优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清4型副猪嗜血杆菌为JS株，保藏号为CCTCC No. M2011172。优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量为I X IO9CFU/头份 4 X IO9CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量为I X IO9CFU/头份，再优选所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量2 X IO9CFU/头份。优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清5型副猪嗜血杆菌为ZJ株，保藏号为CCTCCNo. M2011173o
优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为IX IO9CFU/头份 4X IO9CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为
IX IO9CFU/头份，再优选所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量2 X IO9CFU/头份。本发明的优选方式涉及疫苗组合物的佐剂，优选为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GEL、蜂胶、ISA206、ISA760VG的一种或几种组合物。优选地，本发明提供的预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，含有PCV29 X 105_tlTCID5tl/头份，血清4型副猪嗜血杆菌2 X IO9CFU/头份，含血清5型副猪嗜血杆菌2 X IO9CFU/头份，疫苗佐剂为10%V/V GEL佐剂。本发明赋形剂是指补充疫苗体积的液体，包括但不限于生理盐水、PBS液。 本发明第二方面的疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤培养副猪嗜血杆菌4型和5型菌株，并灭活、浓缩；培养PCV2，并灭活、浓缩；将三种抗原成分按比例混合，辅以佐剂制备成疫苗。优选地，本发明的疫苗组合物的制备方法，所述浓缩方法为超滤法，浓缩3倍。优选地，本发明所述制备方法中，灭活方法为甲醛灭活法；更优地，本发明的甲醛溶液的终浓度为O.1 O. 3% (v/v)，灭活时间为24 48h。优选地，本发明所述制备方法中，三种抗原的混合比例为等量体积混合。本发明的菌株信息如下分类命名副猪嗜血杆菌血清4型JS (Haemophilus parasuis JS),保藏号为CCTCCΝ0:Μ 2011172;保藏日期2011年5月18日，保藏地址中国武汉,武汉大学，中国典型培养物中心；保藏单位中国典型培养物中心(简称CCTCC)。副猪嗜血杆菌病血清5型ZJ株分类命名副猪嗜血杆菌血清5型ZJ (Haemophilus parasuis ZJ),保藏号为CCTCCΝ0:Μ 2011173;保藏日期2011年5月18日，保藏地址中国武汉,武汉大学，中国典型培养物中心保藏单位中国典型培养物中心(简称CCTCC)。由上可见，本发明至少有以下优点I)发明人解决了现有技术的困难，改变了对联苗的认识偏见首次将猪圆环病毒2型抗原和副猪嗜血杆菌抗原联合使用，而在本发明之前，一直被认为这两种抗原会相互干扰；2)发明人发现本发明的猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物，不仅不会产生两种抗原成份的相互免疫干扰，而且还意外发现副猪嗜血杆菌抗原增强了猪圆环病毒2型抗原的免疫效果，而且如本发明后续实施例所证明的，在存在副猪嗜血杆菌抗原的情况下，即使PCV2抗原量减半仍能维持PCV2的免疫效果，而这出乎兽药领域普通技术人员预料的。3)发明人意外地发现上述预防和治疗猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物与猪圆环病毒2型或副猪嗜血杆菌的单价疫苗的效力相比，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此，本发明的疫苗组合物安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。4)发明人意外地发现上述预防和治疗猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物不仅可以是灭活的PCV2病毒抗原与灭活的副猪嗜血杆菌抗原组成的疫苗组合物，还可以是PCV2亚单位蛋白为抗原与灭活的副猪嗜血杆菌抗原组成的疫苗组合物，即PCV2 0RF2蛋白为抗原与灭活的副猪嗜血杆菌抗原组成的疫苗组合物；4)此外，本发明预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠并被用户接受，具有商业上成功的基础 。


图1为本发明的PCV2-0RF2目的片段大小；图2为本发明的重组猪圆环病毒2型0RF2蛋白SDS-PAGE电泳图；图3为本发明的的重组猪圆环病毒2型0RF2蛋白Western blotting图；图4为本发明的实施例1所述的疫苗组合物的制备流程图。
具体实施例方式本发明的实施例中所选用的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)毒株为PCV2SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期2008年3月4日，保藏号为CGMCC No. 23890。此毒株在中国专利公开CN101240264公开。本发明的实施例中所选用的血清4型副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, HPS)菌株为副猪嗜血杆菌JS株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏号为CCTCC No.M2011172。本发明的实施例中所选用的血清5型副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, HPS)菌株为副猪嗜血杆菌ZJ株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏号为CCTCC No.M2011173。本发明的实施例中，PCV2SH株的生产用毒的制备简便，效价较高为IO6 tlTCID5ci/ml以上，PCV2SH株的含量为IO6tlTCID5c/头份疫苗(Iml )。本发明还试验了含量低于IO6 0TCID50/头份的疫苗组合物，但试验证明至少需要达到IO5 5TCID5tl/头份才能具有较佳的免疫效果。本发明的灭活剂为甲醛溶液，其使用的终浓度为0.1 0. 3% (v/v)，灭活时间为24 48h。优选地，本发明实施例中使用了终浓度0.2%体积的甲醛灭活PCV2 SH株，灭活时间为18小时；使用了终浓度为0. 3%体积的甲醛溶液灭活副猪嗜血杆菌菌株JS株、ZJ株，灭活时间为24小时。本发明的实施例中使用了密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作3倍浓缩，如后续实施例证明，该方法和浓度可以使最后获得疫苗组合物获得较佳的疫苗效果；本发明还可以使用其他的超滤方法，如纤维素超滤法和多次超滤等方法。发明的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量，与“剂量”是等同的。优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为含有PCV2的免疫原性氨基酸序列，更优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV20RF2蛋白。其中，本发明PCV2 0RF2蛋白，优选序列表SEQN01.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白或与其同源75%以上的蛋白。本发明对PCV2 0RF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV2 0RF2蛋白都可用作本文所述PCV2 0RF2 DNA和/或多肽的来源。本发明实施例中使用的其他优选的PCV2 0RF2蛋白的优选例可以举出 W02006-072065 公开的 SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 4、SEQ IDNO. 6、SEQ ID NO. 9，其教导和内容全部引入本文作参考。本领域技术人员知晓可以在上述序列进行多达6-10%的序列同源性的变动，但仍保留其蛋白的抗原性，因而可用于本发明的组合抗原与疫苗组合物中表达出抗原性。经修饰的抗原与多核苷酸序列SEQID N0:3或 SEQ ID N0:4编码的PCV2 0RF2蛋白相比，能赋予至少70%、优选80%、更优选90%的保护性免疫力，就认为该经修饰的抗原仍保留了抗原性。本发明实施例中猪圆环病毒2型抗原成分量PCV2 0RF2蛋白为O.1 60微克/头份、优选O. 5 20微克头份；更优选5 10微克/剂量、最优选8微克/头份本发明实施例中“副猪嗜血杆菌抗原”是指含有至少一种副猪嗜血杆菌的抗原形式的任何抗原组合物，所述抗原当对猪给药时，可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌病毒，优选为灭活形式，更优选，血清型为4型和5型的混合抗原，最优选为副猪嗜血杆菌4型菌株为JS株，副猪嗜血杆菌5型菌株为ZJ株。本发明实施例中的副猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血杆菌5型ZJ株，通过试验发现和后续实施例试验例证明，这两株副猪嗜血杆菌灭活抗原与PCV2 0RF2相互配合可以对我国目前流行的副猪嗜血杆菌病和猪圆环病的联合发病有很好的预防和治疗效果，特别是可以解决现有疫苗治疗效果不佳，多次注射成本太高、程序繁复的问题。本发明实施例中的副猪嗜血杆菌抗原量为副猪嗜血杆菌4型含量至少为
2X IO9CFU/头份，更优选至少4 X IO9CFU/头份；最优选8 X IO9CFU/头份；副猪嗜血杆菌5型含量至少为2 X IO9CFU/头份，更优选至少4X IO9CFU/头份；最优选8 X IO9CFU/头份。本发明实施例中的所用“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷如Quil A、Q ;含有直链烷基的酸或醇的酯，更具体是植物油、油酸乙酯、二 (辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或二油酸丙二醇酯；支链脂肪酸或醇的酯，具体是异硬脂酸酯。将油与乳化剂联用以形成乳液。乳化剂优选非离子性表面活性剂，具体是山梨聚糖、二缩甘露醇(如油酸脱水甘露醇酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(任选乙氧基化)，以及聚氧丙烯.聚氧乙烯嵌段共聚物，具体是普朗尼克产品，尤其是L121。本发明实施例还使用了佐剂的另一个例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物的化合物。佐剂化合物宜为交联的、尤其是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物称为卡波姆(carbomer)。其它合适佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA) >SAF-M (Chiron, EmeryviIIe CA)、单憐酸基脂质 A、阿夫立定(Avridine)脂质.胺佐剂、大肠杆菌(E. coli)的热不稳定性肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS1314或胞
壁酸~■妝等等。本发明实施例的佐剂优选每剂量(头份)加入约100微克 10毫克量的佐剂。更优选每剂量加入约500微克-5毫克量的佐剂。更优选每剂量加入约750微克-2. 5毫克量的佐剂。最优选每剂量加入约I毫克量的佐剂在另一个技术方案中，二联物佐剂还可以加入是多糖，多糖包括但不限于黄芪多糖、刺五加多糖、香菇多糖、壳聚糖、环糊精、糊精以及SL-糊精，优选壳聚糖其中壳聚糖加入量，优选O.1-1Omg/剂量(头份)，更优选O.1 5mg/剂量,最优选Img/剂量。下面以具体的实施例对本发明进行进一步说明实施例1猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物的制备和检验1.1生产用菌(毒)种的制备猪圆环病毒2型SH的制备将毒种PCV2SH株用MEM液体培养基(用购自美国Invitrogen公司的MEM干粉培养基按说明书配制)作1:9稀释,然后按细胞培养液体积的5 %接种于PK15 (ATCC，保藏号为CCL-33 )单层细胞，37 °C吸附30分钟，加入细胞维持液(MEM液体培养基中添加4%犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，37°C培养4日，冻融2 3次，收获病毒，病毒滴度为106_5TCID5(l/ml。副猪嗜血杆菌菌种的制备将副猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血杆菌5型ZJ株划线接种于含5%新生牛血清和O. 005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美国BBI公司)的胰蛋白大豆琼脂(TSA，购自美国BD公司)平板(简称TSA/NAD平板)，37°C培养24 48小时，各挑选5个以上典型菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。一级种子挑取单个菌落，接入含5%新生牛血清和O. 005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美国BBI公司)的胰蛋白大豆肉汤(TSA，购自美国BD公司)(简称TSB/NAD液体培养基)，37°C摇床180rpm振荡培养12小 时，同时取样革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态均匀，符合副猪嗜血杆菌的形态特征，无任何杂菌生长，作为二级种子其中含5%血清的TSA/NAD平板的制备方法胰蛋白大豆琼脂(Tryptic SoyAgar, TSA, BD Difico产品)40克加入945ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121°C高压蒸汽灭菌15min，温度降至60°C左右，加入50ml过滤除菌的牛血清，5ml过滤除菌的1%NAD,充分摇匀后倒平皿。含5%新生牛血清的TSB/NAD液体培养基胰大豆蛋白肉汤(Tryptic Soy Broth,TSB, BD Difico产品)30克加入940ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121°C高压蒸汽灭菌15min，加入50ml过滤除菌的牛血清，IOml过滤除菌的O. 01%NAD即成。1. 2病毒液或菌液的培养制备猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞，倒去细胞培养液(MEM液体培养基中添加6%犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，将毒种液体积比按O.1 O. 2TCID5(I/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，旋转细胞瓶2周，37°C吸附30分钟，加入细胞维持液(步骤1.1所述)，置37°C旋转(1(Γ12转/小时)培养。每日观察广2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存。
副猪嗜血杆菌(4型JS株与5型ZJ株)菌液的制备将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型JS株与副猪嗜血杆菌5型ZJ株的二级种子分别按1:100 (v/v)接种于TSB/NAD液体培养基(步骤1.1所述)，置37°C摇床200rpm培养。培养至12 16小时，收获。1. 3病毒液或菌液的处理猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理将步骤1. 2的病毒液用中空纤维滤柱(Millipore公司孔径10 μ m与O. 45 μ m)过滤,除去细胞碎片。副猪嗜血杆菌(4型JS株与5型ZJ株)菌液的处理将将步骤1. 2的两种菌液(副猪嗜血杆菌ZJ株与JS株)分别以连续离心机(10000转/分钟)离心后再以PBS (pH值为7. 2 7. 4)复溶至离心前的体积。1.4浓缩将猪圆环病毒2型SH、副猪嗜血杆菌4型JS株、副猪嗜血杆菌5型ZJ 株分别用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作3倍(体积比)浓缩。1. 5含量测定1. 5.1猪圆环病毒SH株病毒含量测定将病毒液用MEM液体培养基(步骤1.1所述)按本领域技术人员通用方法作10倍系列稀释，取10_5、10_6、10_73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔O.1ml,同时设立阴性对照，在37°C含5% CO2的温箱中继续培养24小时，换细胞维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID5(I。1. 5. 2副猪嗜血杆菌ZJ株与JS株活菌数测定菌液取样，按本领域技术人员熟知的方法作10倍系列稀释，取10_6、10_72个稀释度接种于前述TSA/NAD固体培养基，每个平板接种O. 1ml，37 °C培养24小时后，选择菌落数在30和300之间的平板进行菌落计数。1. 6病毒液或菌液含量测定结果猪圆环病毒2型SH株、副猪嗜血杆菌4型JS株及副猪嗜血杆菌5型ZJ株分别培养三批病毒液或菌液，分别为K001、K002和K003批。病毒液或菌液含量见表I。表I含量测定
抗原各批次病毒液或菌液含量测定KOOlΚ002K003 I猪圖环病毒2型SH株I O6iiTCID50Zml106'5T€ID5O/mlIif2TCID 奸 ml副猪嗜血杆菌4型JS4.5xl09CFU/ml5xl09€FU/mi5xl09CFU/mi I副猪嗜血杆菌5型ZJ4.1OtFU ml5xl09CFU/ml5xl09CFU/ml |1.7病毒液或菌液的灭活猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活将检验合格的步骤1. 3处理的病毒液加入甲醛溶液(洛阳市化学试剂厂分析纯，含量为37% 40%)，使甲醛溶液的终浓度为O. 2% (V/V)，37°C灭活18小时，每4小时搅拌I次，每次lOmin，灭活结束后将灭活病毒液置2 8°C保存。
副猪嗜血杆菌(4型JS株与5型ZJ株)菌液的灭活将步骤3中二种不同血清型的菌液，加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为O. 3% (V/V)，37°C灭活24小时，其间每隔4小时搅拌I次，每次lOmin，灭活结束后将灭活病毒液置2 8°C保存。1.8灭活效果测定1. 8.1猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活检验取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37°C吸附I小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37°C培养2日，应无细胞病变(CPE)，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37°C培养2日，用间接免疫荧光法(IFA)检测，无绿色PCV2阳性细胞产生。1. 8. 2副猪嗜血杆菌灭活检验制备6个平皿的TSA/NAD固体培养基，无菌操作将灭活的菌液在其中3个TSA/NAD固体培养基平皿上滴加I滴，用接种环划线，置37°C普通温箱培养，同时设立3个不接菌的TSA/NAD固体培养基作对照。24小时后观察，平皿必须无任何细菌生长，同时对照未接菌的2个培养基也应无细菌生长，继续观察结果至48小时 6个平皿中都无细菌生长。1.8.3灭活结果3批猪圆环病毒2型SH株、副猪嗜血杆菌4型JS株及副猪嗜血杆菌5型JS株的灭活检验结果见表，灭活是彻底的，见表2。表2 3批抗原的灭活检验效果
抗原各批次灭活检验结果KOOlK002K003猪圆环病毒2型无绿色PCV2无绿色PCV2无绿色PCV2副猜嗜血杆菌4型无菌生长无菌生长无菌生长副猪嗜血杆菌5型无菌生长无菌生长无菌生长1.9配苗配方如表3，将浓缩后的三种抗原液按1:1 :1 (V/V)混合，然后混合液与GEL佐剂(法国赛比克SEPPIC公司生产)按90:10 (V/V)混合，以300转/分钟搅拌30分钟即可。表3疫苗的配方及含量
成份抗原有效含量% (v/v) IPC V 2 SHI OmTQDm/头份疫苗I抗原HPS 4型JS株4 X丨O9CFU/头份疫苗90%HPS 5型ZJ株4 X丨O9CFli/头份疫苗彻IGEL/10% I
以下为制备获得疫苗组合物的检验方法1. 10性状检验灰白色混悬液，长时间静置底部有少量沉淀。振荡后呈均匀混悬液。1. 11无菌检验按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录169 171页进行，应无菌生长。性状和无菌检验结果见下·结果见表4，三批疫苗批号为Y001、Y002、Y003，由上述批号Κ001、Κ002、Κ003的毒
(菌)株抗原制备获得，分别经过无菌检验及性状检验，结果三批疫苗成品均是合格。表4 3批疫苗的性状及无菌检验结果
权利要求
1.一种预防或治疗猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物，其特征在于，其包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种副猪嗜血杆菌抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪圆环病毒2型抗原选自灭活的全病毒抗原、减毒活病毒抗原、亚单位抗原、重组活载体和DNA载体抗原；副猪嗜血杆菌抗原选自灭活全菌抗原、减毒活菌抗原、亚单位抗原、重组活载体和DNA载体的抗原。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原为亚单位抗原；所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的全菌抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原为PCV20RF2蛋白；所述的副猪嗜血杆囷抗原为灭活的副猪嗜血杆囷JS株和灭活的副猪嗜血杆囷ZJ株。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述PCV20RF2蛋白的含量为O. 5^20 μ g/头份；所述灭活的副猪嗜血杆菌JS株抗原的含量为I X 109^8X109CFU/头份，所述灭活的副猪嗜血杆菌ZJ株抗原的含量为IX 1(T8X IO9CFU/头份。
6.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原为灭活的全病毒抗原；副猪嗜血杆菌抗原为灭活的全菌抗原。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原为灭活的猪圆环病毒2型PCV2 SH株，所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌JS株和灭活的副猪嗜血杆菌ZJ株。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌JS株含量为I X IO9CFU/头份，所述的副猪嗜血杆菌ZJ株含量为I X IO9CFU/头份。
9.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述抗原组合物中含有PCV24.5 X 105_ 0TCID50/头份，血清4型副猪嗜血杆菌I X 109CFU/头份，含血清5型副猪嗜血杆菌I X IO9CFU/头份，疫苗佐剂为10%V/V GEL佐剂。
10.根据权利要求1 9任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于，还可包含其它的猪病原体的附加抗原。
11.根据权利要求10所述的抗原组合物，其特征在于，所述的其它的猪病原体附加抗原选自猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原、猪肺炎支原体抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)抗原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪流感病毒(SIV)抗原或它们的组合。
12.根据权利12所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、皂苷如Quil A和QS-21、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、卡波姆、Montanide Gel0
13.根据权利12所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂优选为Montanide Gel。
14.根据权利要求1-13任意一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病药物中的应用。
15.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC NO.M2011172 ;与副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC No. M2011173。
全文摘要
本发明涉及一种猪用多联疫苗组合物，具体涉及一种同时抵抗猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌(HPS)感染的疫苗组合物。疫苗组合物包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种副猪嗜血杆菌抗原及兽医学领域可得的载体、赋形剂及佐剂。所述疫苗组合物可用于预防和治疗猪圆环病毒2型相关疾病和副猪嗜血杆菌病。
文档编号A61P31/04GK102988978SQ20121018084
公开日2013年3月27日 申请日期2012年6月4日 优先权日2011年8月1日
发明者张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司