专利名称：一种预防龋齿的疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，特别涉及一种预防龋齿的疫苗及其制备方法。
背景技术：
龋病是人类最普遍的疾病之一，发病率高，WHO将其与癌症和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病(Petersen PE. Community Dent Oral Epidemiol. 2003, 31Suppl1:3-23.)。世界卫生组织最新发布的《全球口腔健康报告》中，估计全球63亿人口有50亿人患过龋齿(Daniel J S. 2010，9 (I) : 1-3)，在发达国家中60% 90%的学龄儿童和大部分成人患过龋齿，在我国成人发病率为50%，儿童则高达70% 90%，它已然成为威胁人类口腔健康的全球性问题。龋病是以口腔微生物为主的多因素共同作用下牙体硬组织慢性进行性破坏的疾 病。细菌只有在形成牙菌斑后才发生致龋作用，而食物中碳水化合物特别是蔗糖，是引起龋病的主要原因。尤其是带粘性的食物黏附在牙齿上，通过口腔细菌发酵产酸，从而使牙齿的牙釉质表层无机物溶解，牙釉质和牙本质无机物不断矿化，牙齿硬组织随之松软丧失，继而形成龋洞。变形链球菌(s. Mutans)是人类主要的致龋微生物，它在口腔中的定植与龋病的发生密切相关(张志愿.《口腔科学》，人民卫生出版社，第七版，2008年，48;岳松龄.《现代龋病学》，科学技术文献出版社，2009年，53-54.)。现有对于龋病的预防主要采取氟化物、抗生素及限制糖等。氟化物防龋是通过抑制脱矿，促进再矿化干扰致龋菌代谢，抑制致龋菌多种代谢酶而达到防龋效果。但氟化物的使用具有潜在的毒性，不适宜学龄前儿童使用。抗生素能够达到控制菌斑的作用，但长期使用存在耐药性及毒副作用，而且对口腔微生物无选择抑制，在杀灭有害菌同时也抑制有益菌，一般不作为首选防龋方法。控制糖的摄入及糖替代品的使用也可起到预防效果，虽在一定程度上降低龋齿发生率，但不能从根本上阻断龋病发生。因此研制ー种安全、有效的龋齿疫苗已显得尤为必要。自20世纪80年代以来，人们就开始用变形链球菌的有效抗原成分来制备亚单位防龋疫苗。传统的灭活死疫苗和减毒活疫苗虽可抑制变形链球菌对牙面的粘附，但全细胞诱导的抗体与心肾组织有交叉反应，减毒活疫苗具有减毒不充分或毒力回复则可造成对机体的伤害而均难以应用于临床。已有多种防龋疫苗(如变形链球菌蛋白疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗)在开展研究，但迄今为止，国内外尚无预防S. Mutans感染定植的龋病疫苗上市。多种以S. Mutans抗原为基础的防龋疫苗可显著降低动物龋齿发生率，抗原主要有表面蛋白抗原I/II(Ag 1/11)、葡糖基转移酶(GTF)和葡聚糖结合蛋白(GBP)等抗原分子(Hajishengallis G. Infect Immun, 1998, 66 (4) : 1740-1743; Katz J. Infect Immun, 1993,61 (5):1964-1971. ;Childers NK. Oral Microbiol Immunol, 2006, 21 (5):309-313. ;Childers NK. J Dent Res, 2002，81(I):48-52. ;Peacock ZS.Oral MicrobiolImmunol, 2005，20(1) :60-64. ; Smith DJ. Infect Immun, 2005，73 (5) : 2797-2804. )。SMU862是S. Mutans全基因组测序发现的ー种蛋白，功能未知，理论预测为膜蛋白，假定为透明质酸酶。该蛋白序列高度保守，在已完成全基因组测序的s. Mutans UA159和S. MutansNN2025菌株中，相似性达99%，与S.Mutans LJ23菌株中，相似性达100% (NCBI Blast);同时特异性高，与其他细菌的相似性均低于55%。将其作为抗原的研究未见报道。防频疫苗需要能诱导机体在唾液中持续产生特异性IgA抗体,影响S. Mutans在牙面的黏附定植，从而预防龋病的发生。単一的可溶性蛋白抗原或多肽抗原难以达到此目的，必须辅以能有效诱发黏膜免疫的佐剂来增强机体针对抗原的免疫应答能力，才能产生大量分泌型IgA，获得有效的免疫保护效果。霍乱毒素(CT)及大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)已被证实具有很强的黏膜免疫佐剂作用，但因其毒性而在应用上受到限制。近年来在原核表达体系中，谷胱甘肽S转移酶(GST)表达纯化系统的应用极为普遍，它的来源是日本血吸虫的25kDa大小的GST蛋白。GST标签系统具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便，以及利于GST抗体制备等特点和优势。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可从细菌裂解液中提取，在不变性的条件下通过亲和层析得到。GST融合蛋白可被位点特异性蛋白酶裂解，从而除去GST蛋白。正是由于以上的优点，商品化的GST融合蛋白表达体系 以及GST标签抗体系统至今仍被广泛应用。
发明内容
本发明的ー个目的是提供ー种预防龋齿的疫苗。本发明所提供的预防龋齿的疫苗，其活性成分为如下I)或2)或3)所示的蛋白质I)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加ー个或几个氨基酸且与预防频齿相关的由I)衍生的蛋白质；3)序列表中序列2中第9位至第419位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述疫苗还包括佐剂；所述佐剂为粘膜佐剂。所述粘膜佐剂为LTS63K。所述疫苗由序列表中序列2所示的蛋白与LTs63k佐剂组成,所述蛋白与所述LTs63k佐剂的质量比为I: f 25:1，优选5: I。所述频齿为由S. Mutans感染所致的频齿。本发明的另ー个目的是提供预防龋齿的疫苗的制备方法。本发明所提供的预防龋齿的疫苗的制备方法，其特征在于用如下I)或2)或3)所示的蛋白质作为活性成分，与药物可接受的辅剂组合I)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加ー个或几个氨基酸且与预防频齿相关的由I)衍生的蛋白质；3)序列表中序列2中第9位至第419位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述预防龋齿的疫苗的制备方法，包括如下步骤(I)通过PCR方法，从S. mutans UA159基因组扩增smu_862基因片段；(2)将所述smu_862基因片段构建到含有GST基因的表达载体上，与GST形成融合基因，测序鉴定，得到重组质粒；
(3)将所述重组质粒转化表达菌，诱导表达重组融合蛋白并鉴定；(4)纯化所述重组融合蛋白，通过酶切去除GST纯化标签后得到疫苗抗原蛋白；(5)将所述疫苗抗原蛋白与粘膜佐剂LTs63k混合，即得到所述预防龋齿的疫苗。所述步骤(2)中的含有GST基因的表达载体为PGEX-6P-2质粒；所述步骤(3)中的表达菌为Ecoli BL21 (DE3)。本发明的又ー个目的是提供ー种蛋白在制备预防龋齿的疫苗中应用。本发明所提供的ー种蛋白在制备预防龋齿的疫苗中应用，所述蛋白为如下I)或
2)或3)所示
I)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与预防龋齿相关的由I)衍生的蛋白质；3)序列表中序列2中第9位至第419位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述龋齿为由S. Mutans感染所致的龋齿。本发明所提供的预防S. Mutans感染所致龋齿的重组蛋白疫苗，以ー种S. Mutans膜蛋白SMU 862作为抗原，所述重组蛋白来源于变形链球菌膜蛋白SMU_862，采用基因工程方法去除跨膜区，保留膜外区，具有免疫保护功能。所述SMU_862重组蛋白氨基酸序列如序列表中序列2所示第9位至第419位所示。本发明通过分子生物学方法从S.Mutans UA159中克隆重组基因，构建重组表达质粒，表达得到重组融合蛋白，融合蛋白纯化后通过酶切方式去除纯化标签。从实施例2的结果可以看出，该重组融合蛋白具有良好的免疫原性，能够刺激实验鼠产生抗SMU_862的特异性免疫反应，而Al (OH)3注射组及PBS组没有产生抗SMU_862的抗体。本领域技术人员根据本发明提供的基因序列，能够构建出表达重组蛋白疫苗的重组质粒、工程菌，用于生产本发明要求保护的重组蛋白疫苗。由于本发明提供的预防S.Mutans感染所致龋齿的重组蛋白疫苗主要用于预防
S.Mutans感染，考虑到黏膜免疫佐剂用于人体的毒性问题，因此本发明优选采用被证明为无毒且具较高的LTs63k作为佐剂。以重组蛋白SMU_862抗原和LTs63k佐剂制备的疫苗免疫大鼠，大鼠能生成抗S.Mutans的特异性抗体(图9，10)及抗原特异性抗体分泌细胞(图11)，井能降低大鼠龋齿发生率及龋损程度(表1，表2)，因此本发明可以作为预防S. Mutans感染所致龋齿的候选疫苗。综上所述，本发明利用S. Mutans膜蛋白SMU_862作为抗原，通过GST表达纯化系统制备疫苗抗原，以LT无毒突变体LTs63k作为佐剂，得到预防S. Mutans感染所致龋齿的疫苗。该疫苗通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体。该疫苗具有可溶性表达、易纯化、纯度高、制备方法简便等优点，具有显著的经济效益。可以作为预防变形链球菌感染所致龋齿的候选疫苗。
图I为PCR扩增SMU_862琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道I为核酸(DNA)分子量标准(TIANGEN，MD115)，泳道2为SMU_862 PCR产物(1263bp)。
图2为Sma I和Not I双酶切SMU_862 DNA与pGEX_6P_2质粒的酶切鉴定结果图；其中泳道I为核酸(DNA)分子量标准(Thermo，#SM0311/2/3*)，泳道2为PGEX-6P-2质粒双酶切产物(497 Ibp)，泳道3为smu_862双酶切产物(124lbp)。图3为Sma I和Not I双酶切鉴定重组质粒的酶切鉴定结果；其中泳道I为核酸(DNA)分子量标准(Thermo，#SM0311/2/3*)，泳道2为重组质粒pGEX-6P-2/smu_862 双酶切产物(497 Ibp、1241bp )。图4为SDS-PAGE电泳鉴定重组工程菌表达的结果图；其中泳道I为空载体对照菌E coli BL21 (DE3) (pGEX_6P_2)诱导前，泳道2为空载体对照菌诱导12h，泳道3为空载体对照菌诱导12h破菌上清，泳道4为空载体对照菌诱导12h破菌沉淀，泳道5为蛋白质分子量标准(Fermentas，#SM0671)，泳道6为重组工程菌 EcoliBL21 (DE3) (pGEX-6P_2/smu_862)诱导前，泳道7为重组工程菌诱导12h，泳道8为重组工程菌诱导12h破菌上清，泳道9为重组工程菌诱导12h破菌沉淀。泳道7、8箭头所指为重组融合蛋白。图5为SDS-PAGE电泳鉴定纯化蛋白的结果图；其中泳道广3为PreScission Protease酶切后重组蛋白SMU_862,泳道4为蛋白质分子量标准(Fermentas，#SM0671)，泳道5为酶切前融合蛋白GST_SMU_862。图6为Western检测重组蛋白的免疫反应性的结果图；泳道广3均为重组蛋白SMU_862。图7为Nde I和BamH I双酶切鉴定重组质粒pETllc/LTS63K的酶切鉴定结果；其中泳道I为核酸(DNA)分子量标准(Thermo，#SM0311/2/3*)，泳道2为重组质粒pETllc/LTS63K 双酶切产物(5. 6kb、l. 2kb)。图8为SDS-PAGE电泳鉴定LTs63k纯化蛋白的结果图；其中泳道I为重组工程菌诱导4h破菌上清，泳道2、4为纯化LTs63k蛋白上样缓冲液不含DTT，泳道3为纯化LTs63k蛋白上样缓冲液含DTT，泳道5为蛋白质分子量标准(Fermentas, #SM0671)。图9为唾液抗原特异性SlgA检测的结果；经统计学分析(t检验)，疫苗免疫组唾液抗原特异性SlgA水平比LTs63k佐剂组及PBS组显著升高(* :与LTs63k佐剂组相比较，p〈0. 01 ；# :与PBS组相比较，p〈0. 01)。图10为血清抗原特异性IgG检测的结果；经统计学分析(t检验)，疫苗免疫组血清抗原特异性IgG水平比LTs63k佐剂对照组及PBS对照组显著升高(* 与LTs63k佐剂组相比较，p〈0. 01 ；# :与PBS组相比较，p〈0. 01)。图11为抗原特异性抗体分泌细胞检测的结果经统计学分析(t检验)，疫苗免疫组抗原特异性抗体分泌细胞(ASC)数比LTs63k佐剂组及PBS组显著升高(* 与LTs63k佐剂组相比较，p〈0. 01 ；# :与PBS组相比较，p〈0. 01)。
具体实施例方式实施例I、制备预防S. Mutans感染所致龋齿的疫苗的抗原蛋白一、PCR 扩增 smu_862 DNA
I.引物设计及合成以 GenBank 公布的 S. mutans UA159 基因组(GenBank:AE014133. I)中 “smu_862”核酸序列(812323.. 813030)设计引物，上游引物5’端引入Sma I酶切位点，下游引物5’端引入NotI酶切位点。引物设计如下smu_862-F 5，-TCC '^CCGGG]i GCTATTTTGATAGTATTAGGCC-3，Sma I酶切位点 smu_862-R 5，-TTTTCCTTTT '^iCGGCCGC} TCACCTCTTTTCATTAGCCTTA-3，Not I酶切位点
引物由生エ生物工程(上海)有限公司合成。2. PCR 扩增目的 DNAI)模板的制备用“细菌基因组DNA提取试剂盒”(TIANGEN，DP302)抽提S. mutans UA159 (购自美国标准菌种收藏所American Type Culture Collection, Streptococcus mutans ATCC1'700610 )基因组，操作按说明书进行。2) PCR 扩增以S. mutans UA159基因组DNA为模板，分别用smu_862_F和smu_862_R引物扩增smu_862。采用宝生物工程(大连)有限公司(RaKaRa)高保真DNA聚合酶(PrimeSTARliHSDNA Polymerase, Code DR010A)进行 PCR 扩增，反应体系如下
权利要求
1.ー种预防龋齿的疫苗，其活性成分为如下I)或2)或3)所示的蛋白质 1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与预防龋齿相关的由I)衍生的蛋白质； 3)序列表中序列2中第9位至第419位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于 所述疫苗还包括佐剂；所述佐剂为粘膜佐剂。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于 所述粘膜佐剂为LTS63K。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于 所述疫苗由序列表中序列2所示的蛋白与LTs63k佐剂组成，所述蛋白与所述LTs63k佐剂的质量比为1:广25:1。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于所述龋齿为由S.Mutans感染所致的龋齿。
6.权利要求I所述疫苗的制备方法，其特征在于用如下I)或2)或3)所示的蛋白质作为活性成分，与药物可接受的辅剂组合 1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与预防龋齿相关的由I)衍生的蛋白质； 3)序列表中序列2中第9位至第419位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
7.权利要求5所述疫苗的制备方法，包括如下步骤 (1)通过PCR方法，从S.mutans UA159基因组扩增smu_862基因片段； (2)将所述smu_862基因片段构建到含有GST基因的表达载体上，与GST形成融合基因，测序鉴定，得到重组质粒； (3)将所述重组质粒转化表达菌，诱导表达重组融合蛋白并鉴定； (4)纯化所述重组融合蛋白，通过酶切去除GST纯化标签后得到疫苗抗原蛋白； (5)将所述疫苗抗原蛋白与粘膜佐剂LTs63k混合，即得到所述预防龋齿的疫苗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于 所述步骤(2)中的含有GST基因的表达载体为pGEX-6P-2质粒； 所述步骤(3)中的表达菌为E coli BL21(DE3)。
9.一种蛋白在制备预防频齿的疫苗中应用，所述蛋白为如下I)或2)或3)所不 1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加ー个或几个氨基酸且与预防频齿相关的由I)衍生的蛋白质； 3)序列表中序列2中第9位至第419位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于 所述频齿为由S. Mutans感染所致的频齿。
全文摘要
本发明公开了一种预防龋齿的疫苗及其制备方法。本发明提供的预防龋齿的疫苗，其活性成分为如下1)或2)或3)所示的蛋白质1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与预防龋齿相关的由1)衍生的蛋白质；3)序列表中序列2中第9位至第419位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。该疫苗具有可溶性表达、易纯化、纯度高、制备方法简便等优点，具有显著的经济效益。可以作为预防变形链球菌感染所致龋齿的候选疫苗。
文档编号A61K39/39GK102772792SQ20121020289
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者刘开云, 卢陆, 孙红武, 张卫军, 张怡, 樊绍文, 解庆华, 邹全明, 郭刚 申请人:中国人民解放军第三军医大学, 重庆原伦生物科技有限公司