金颗粒负载二氧化硅基多模式造影剂及hifu增效剂的制作方法

金颗粒负载二氧化硅基多模式造影剂及hifu增效剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可兼用作增强药物释放、超声造影剂和HIFU增效剂的金纳米粒子负载的介孔二氧化硅纳米胶囊基多模式造影剂及HIFU增效剂及其制备方法。所述多模式造影剂及HIFU增效剂包括表面修饰有聚乙二醇、金纳米粒子增效的介孔二氧化硅纳米胶囊以及装载在所述介孔二氧化硅纳米胶囊中用于HIFU增效的客体分子。
【专利说明】金颗粒负载二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米材料【技术领域】，特别涉及医用纳米生物材料【技术领域】，具体涉及一种可兼用作增强药物释放、超声造影剂和HIFU增效剂的金纳米粒子负载的介孔二氧化娃纳米胶囊基杂化材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤是严重威胁人民生命健康的重大疾病，其发病率和死亡率呈持续上升趋势，2008年占疾病致死总人数的27.12%以上(中国统计年鉴，2009)。手术、放疗和化疗在过去、现在人类与肿瘤的斗争中已起到巨大的作用，但毒副作用也不容忽视。影像引导下射频、微波消融肝癌等部分恶性肿瘤尽管减少了创伤性，但依然需要经皮插入辐射天线或电极。发展能特异性、靶向性杀灭肿瘤，而对正常组织和机体影响非常小，甚至无创的肿瘤治疗方法是医学发展的重要方向。其中高强度聚焦超声(HIFU)消融提供了一个可精确聚焦治疗肿瘤却没有皮肤切口的无创治疗方法，且超声消融治疗肿瘤，副作用将显著下降(《自然新闻》(“Nature News”)，2004，二月 17 日)。
[0003]聚焦超声治疗因具有无辐射、无创(保留器官和肢体)、部分肿瘤可门诊手术、设备市场和医疗市场前景广阔等特点，引起了国际上许多国家政府、高校、科研机构和GE、西门子(Siemens)、飞利浦(Philips)等医疗器械巨头关注，并不断加大科研投入。2009年3月美国专门立项鼓励开展“非侵入性聚焦超声技术和其它有创、微创治疗技术的比较研究”。上世纪90年代末，我国率先将聚焦超声用于临床治疗肝癌、乳腺癌、肾癌、骨肿瘤，展示出良好的有效性和安全性(《自然癌症综述》(“Nature ReviewsCancer”)，2005, 5，321)。聚焦超声已在肿瘤治疗方面形成了蓬勃的发展趋势。
[0004]然而，由于缺乏有效的增强引导成像的造影剂及增效消融的增效剂，其对组织成像的空间/时间分辨率仍较低，不能满足一些早期疾病的诊断，且肿瘤消融效率较低，其应用仍受到较大的限制。
[0005]目前国内外研究的造影剂主要集中在采用聚合物或有机脂质体等包裹温敏型氟碳化合物的微泡，其由于稳定性差在血管内存留时间短而影响靶向物质与受体的结合，且粒径较大(多为微米级)，而肿瘤部位的血管内皮间隙至多允许直径小于700nm的颗粒穿过(《美国科学院进展》(“Proc.Natl.Acad Sci USA”)，1998，95，4607)，因此微泡造影剂不能穿透血管内皮间隙，属于血池显像，限制了它们对血管外疾病的诊断与治疗(《超声学》(“Ultrasonics”)，2004, 42，343);用于HIFU消融的增效剂更是由于HIFU设备的新兴及稀缺性，其研究仅限于采用当前商用的有机微泡造影剂(Sono Vue等)来减少HIFU消融时间、增强消融效率以提高治疗安全性 。因此，寻找稳定、高效、纳米HIFU及与HIFU联用(CT、MR1、超声)共享型造影剂/增效剂已成为分子显像领域的一个重要研究方向，也成为临床诊断和疾病治疗的迫切需要。
[0006]纳米生物技术是国际生物【技术领域】的前沿和研究热点课题，在人类健康、医药卫生领域有着重大的应用价值和产业化前景。近年来粒径在几十至几百纳米范围内可调控纳米造影剂引起人们极大的关注(《德国应用化学杂志》(“Angew.Chem.1nt.Ed.0, 2003,42,3218)，它可以穿越血管内皮间隙，而微泡类造影剂/增效剂仅能发生血池内超声显像的局限，从而大大提高了对血管外病变组织的早期诊断能力。其中最为重要的即介孔纳米材料，例如介孔二氧化硅空心纳米材料具有巨大的空腔纳米结构、高比表面积、大孔容、可以负载客体分子而可用于吸附剂、催化剂载体和药物载体等相关领域。
[0007]目前国内外对介孔二氧化硅纳米材料在超声成像引导下HIFU增效治疗领域的应用鲜有报道(《先进材料》(“Adv.Mater.”)，2009，21，3949)。本发明发明人研究了这种具有介孔结构的粒径300nm薄壁的纳米介孔二氧化硅胶囊材料对于超声的响应，结果表明其本身对于超声就有一定的超声增强作用(《材料化学杂志》(“J.Mater.Chem.”)，2012，22，12553)。同时结合其本身所具有的大比表面积、高孔容量、良好的可修饰性、优异的化学及热稳定性、大的内核空腔体积及壳层介孔孔道、良好的生物相容性和可降解性等优点(《纳米快报》(“Nano Lett.”)，2003，3，609 ;《生物材料》(“Biomaterials”), 2010, 31, 1085),装载温敏的氟碳化合物(全氟己烧),在超声的作用下温敏氟碳化合物汽化成大量气泡，增强超声成像及增效HIFU的消融治疗(《德国应用化学杂志》，2011，50，12505 ;《先进材料》，2012，6，785)。
[0008]该研究尚属于起步阶段，有关无机SiO2纳米超声造影剂的生物学效应以及与超声之间的相互作用机制还未涉及。超声成像是一个多功能、非侵入性、低风险、低价、便携的实时成像技术，是目前世界上应用最广泛的成像技术之一。然而，由于缺乏有效的造影剂，其对组织成像的空间/时间分辨率仍较低，不能满足一些早期疾病的诊断，其应用仍受到较大的限制。同时由于本身纳米尺度材料对于超声的响应比较小，造影效果差，因此装载氟碳化合物的SiO2复合纳米胶囊材料的超声成像性能还有待于进一步提高,而对于多模式成像引导下，更高效的HIFU增效治疗研究还未见报道，更无相关专利可寻，有待进一步研究。

【发明内容】

[0009]面对现有技术存在的上述问题，本发明人经过锐意的研究，在新型的有机无机复合的超声造影剂及HIFU增 效剂发展的基础上，通过化学键合方法修饰嫁接功能纳米粒子，提高超声成像性能及实现多模式成像引导下的增效HIFU消融治疗，有效地提高HIFU治疗过程中的安全性和有效性。
[0010]本发明人意识到可对介孔二氧化硅纳米胶囊材料进行表面改性，使其表面带有巯基等活性官能团，然后一步法还原金种子，通过硫-金化学在纳米胶囊表面嫁接上丰富的纳米金颗粒(2_4nm)。
[0011]同时，还可以对介孔二氧化硅纳米胶囊材料进行氨基等活性官能团改性，通过柠檬酸盐还原法制备出羧基改性的金纳米颗粒(10nm)，然后通过酰胺反应化学在纳米胶囊表面嫁接上丰富的纳米金颗粒。
[0012]此外，本发明人还意识到介孔纳米材料由于具有大的空腔结构(空心球)，可以装载大量的客体分子(氟碳化合物、亲疏水抗癌药物)，有望用于HIFU增效治疗与化疗的协同治疗模式。
[0013]最后，对纳米金负载的胶囊表面进行表面修饰(聚二乙醇、透明质酸及凝脂分子)连接可增加其分散性进而可增加其超声成像效果。[0014]在此，本发明提供一种金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂，它包括:
[0015]表面修饰有聚乙二醇、金纳米粒子增效的介孔二氧化硅纳米胶囊；以及
[0016]装载在所述介孔二氧化硅纳米胶囊中的用于造影及HIFU增效的客体分子。
[0017]在本发明一个实施方式中，所述介孔二氧化硅纳米胶囊粒径为100~lOOOnm，孔径为2.5~5nm，孔容为0.2~1.4cm3/g。
[0018]在本发明一个实施方式中，所述金纳米粒子为所述介孔二氧化硅纳米胶囊质量的I~10%,所述客体分子为所述介孔二氧化娃纳米胶囊质量的1.7~8.5%。
[0019]在本发明一个实施方式中，所述客体分子包括全氟己烷、全氟溴辛烷和客体药物分子、染料分子。
[0020]在本发明一个实施方式中，所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载有荧光标记物。
[0021 ] 在本发明一个实施方式中，所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载有抗肿瘤药物。
[0022]另一方面，本发明提供一种制备所述金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂的方法，所述方法包括:
[0023]对介孔 二氧化硅纳米胶囊进行表面改性，以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面
带有氨基、羧基或巯基；
[0024]使所述介孔二氧化硅纳米胶囊表面负载不同粒径及含量的金纳米颗粒；以及
[0025]使所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于造影或HIFU增效的客体分子；以及
[0026]利用化学嫁接法对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。
[0027]在本发明一个实施方式中，通过挥发浸溃或真空灌注使所述金纳米粒子负载的介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于HIFU增效的客体分子。
[0028]在本发明一个实施方式中，所述介孔二氧化硅纳米胶囊通过选择性蚀刻法合成，包括:
[0029]采用去离子水和乙醇作为溶剂、氨水作为碱化剂、正硅酸乙酯作为硅源、以及采用硅烷偶联剂作为结构导向剂制得实心二氧化硅纳米球；以及
[0030]采用碳酸钠水溶液作为蚀刻剂蚀刻所述实心二氧化硅纳米球。
[0031]在本发明一个实施方式中，所述硅烷偶联剂包括十八烷基三甲基硅烷、十六烷基三甲基溴化铵和全氟十七烷三甲基氧硅烷。
[0032]具体的说，本发明所述金功能纳米粒子修饰的二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂包括表面嫁接不同粒径的金纳米粒子、修饰有聚乙二醇的介孔二氧化硅纳米胶囊以及装载在所述介孔二氧化硅纳米胶囊中的用于HIFU增效的客体分子。
[0033]采用本发明，很好地结合能增加超声散射性能、HIFU热效应的金功能纳米粒子，无机介孔二氧化硅纳米粒子与有机氟碳化合物的优势，可提供纳米有机无机复合的增强超声造影、CT成像、光声成像引导下的高效HIFU增效剂材料，得到更加稳定、生物相容性更好、多模式成像性能更为优良、HIFU增效明显的诊疗剂。而且选用生物相容性优良的介孔二氧化硅纳米胶囊作为基体材料可进一步提高了本发明的临床应用性。
[0034]优选地，所述介孔二氧化硅空心纳米胶囊的粒径可为100~lOOOnm，孔径可为
2.5~5nm。这种大比表面积和大孔径的空心载体结构可以更高效地装载客体分子用于HIFU增效。担载的金纳米粒子大小为2-10nm，担载量为1-10%
[0035]用于HIFU增效的客体分子可为有机氟碳化合物或者有机氟碳气体，包括全氟己烷(PHO和全氟溴辛烷(PFOB )。
[0036]在本发明中，所述介孔二氧化硅纳米胶囊还可装载有荧光标记物。这样，可更方便地跟踪试验和诊疗。
[0037]本发明的二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂还可包括装载在所述介孔纳米颗粒中的抗肿瘤药物。空腔结构和孔道结构可以赋予该纳米材料药物包覆和传输的性能，使得化疗和HIFU治疗一体化成为可能。所述抗肿瘤药物包括但不限于阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、长春新碱、氟尿嘧啶、甲氨喋呤、米托蒽醌、环磷腺苷、环磷酰胺、培洛霉素、硝卡介、亚胺醌、阿柔比星、卡莫司汀、替莫唑胺、洛莫司汀、卡莫氟、替加氟、放线菌素D、丝裂霉素、安吖啶、安磷汀、顺钼、阿拉瑞林、安鲁米特、氮芥中的一种或两种以上的混合物。
[0038]另一方面，本发明提供一种制备上述金纳米功能粒子负载的二氧化硅基多模态造影剂及HIFU增效剂的方法，所述方法包括对介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面改性以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面带有氨基、羧基或巯基，负载不同粒径及含量的金纳米粒子；使所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于HIFU增效的客体分子；以及利用化学嫁接法对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。
[0039]本发明的方法通过对介孔二氧化硅纳米材料进行表面改性和表面修饰嫁接功能金纳米粒子，装载HIFU增效的客体分子形成有机无机复合多功能材料，可增加超声的散射信号及消融的热效率，提高超声成像性能及实现CT/光声成像多模式引导成像下的增效HIFU消融，最终实现HIFU治疗的安全性和有效性的提高。本发明的方法，合成工艺简单易行、无污染、成本低。
[0040]在本发明中，所述介孔二氧化硅纳米胶囊可通过传统的选择性蚀刻法合成，包括:采用去离子水和乙醇作为溶剂、氨水作为碱化剂、正硅酸乙酯TEOS作为硅源、以及采用硅烷偶联剂作为结构导向剂制得实心二氧化硅纳米球；以及采用碳酸钠水溶液作为蚀刻剂蚀刻所述实心二氧化娃纳米球。
[0041]在本发明中，对介孔二氧化硅纳米胶囊材料进行表面改性，使其表面带有巯基、氨基等活性官能团，通过硫-金化学、酰胺反应化学在纳米胶囊表面嫁接上丰富的不同粒径纳米金颗粒，实现多模式成像及增效HIFU热效应消融治疗。
[0042]采用该方法，可在纳米胶囊表面负载粒径可调、含量可调的金纳米颗粒，合成无机有机复合二氧化硅纳米材料后易于进行表面改性和表面修饰，制备工艺简单、易行。
[0043]再一方面，本发明还提供一种制备上述金纳米粒子增效的二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂的方法，包括采用传统选择性蚀刻法合成介孔二氧化硅纳米胶囊lOOmg，在乙醇中搅拌分散，加入100 μ 1-500 μ I巯基硅烷偶联剂70°C下回流4~12小时，得到巯基修饰的空心纳米胶囊。取0.01-0.1M的氯金酸溶液，用0.01M的NaOH调节pH=8_10之间，加入上述巯基空心纳米胶囊，之后加入金还原剂硼氢化钠还原金颗粒，通过硫-金化学嫁接金颗粒；对所述的金纳米 颗粒嫁接的介孔二氧化娃纳米胶囊装载氟碳化合物及客体分子；以及利用化学嫁接法对所述金颗粒负载的介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。[0044]再一方面，本发明还提供另一种制备上述金纳米粒子增效的二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂的方法，包括采用传统选择性蚀刻法合成介孔二氧化硅纳米胶囊lOOmg，在乙醇中搅拌分散，加入100 μ 1-500 μ I氨基硅烷偶联剂70°C下回流4~12小时，得到氨基修饰的空心纳米胶囊。取0.01-0.1M的氯金酸溶液，加入柠檬酸钠溶液还原金颗粒，最后采用酰胺反应化学在纳米胶囊表面嫁接上丰富的纳米金颗粒；对所述的金纳米颗粒嫁接的介孔二氧化硅纳米胶囊装载氟碳化合物及客体分子；以及利用化学嫁接法对所述金颗粒负载的介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。
[0045]本发明所用的金还原剂包括硼氢化钠、柠檬酸钠。调节还原剂的种类和加入量以及PH值，有利于得到合适粒径大小及含量金负载的纳米胶囊复合材料。
[0046]可通过挥发浸溃或真空灌注使所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于HIFU增效的客体分子。本发明装载用于HIFU增效的客体分子的方式简便、易行。
[0047]本发明合成工艺简单易行、无任何污染(无污染物排放)、产量高、成本低、效率高、易工业化生产；制得的金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂可以有效地给肿瘤组织显影，并且可显著提高HIFU治疗的效果，因此显示出广阔的应用前景。此外，该造影剂/增效剂比表面积高、孔容大、孔径分布均一，有利于药物在其中的高效担载，有利于实现化疗与HIFU无创治疗的一体化。
【专利附图】

【附图说明】
[0048]图1是制备本发明的金颗粒负载二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂的示意流程图。
[0049]图2是以表面活性剂C18TMS作为结构导向剂制得的介孔SiO2纳米胶囊及负载2-4nm金颗粒的纳米胶 囊的透射电镜照片。
[0050]图3是金纳米粒子负载介孔SiO2纳米胶囊的氮吸附曲线及粒径分布曲线(a)、平均粒径(b)、红外表征(C)和紫外表征(d)。
[0051]图4是本发明的金纳米粒子负载二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂在超声作用下(1MHz, 2ff/cm2, 50%工作周期(duty cycle) , 30s, d=25mm)温敏现象的共聚焦照片。
[0052]图5是本发明的装载模型染料芘的金纳米粒子负载二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂在超声作用下，增强L929细胞吞噬的共聚焦照片。
[0053]图6是本发明的不同增效剂材料在超声作用下温度升高曲线。
[0054]图7是本发明的金颗粒负载的二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂与细胞共培养后在超声作用下的细胞的消亡情况。
[0055]图8是体外评价本发明的金颗粒负载的二氧化硅基增效剂材料的超声显像结果。
[0056]图9是体外评价本发明的金颗粒负载的二氧化硅基增效剂材料的CT显像结果。
[0057]图10是瘤兔体内评价本发明的金颗粒负载的二氧化硅基增效剂材料的超声显像结果。
[0058]图11是采用荷有肿瘤的兔子模型评价本发明的金纳米粒子增效的二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂在HIFU治疗中的增效结果。【具体实施方式】
[0059]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明。需要注意的是，本发明的内容并不限于这些具体的实施方式。在不背离本发明背景和精神的前提下，本领域技术人员在阅读本发明的内容的基础上可以进行等价替换和修改，其内容也包括在本发明要求保护的范围内。
[0060]参见图1，其示出本发明的模型染料负载、金纳米粒子嫁接的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂的两种方法的示例制备流程。
[0061]首先，可采用不同的制备工艺制备具有不同孔道结构和表面特性的介孔SiO2纳米载体。例如采用传统的碱性条件选择性蚀刻法，通过蚀刻实心SiO2纳米球制得介孔SiO2纳米载体。也可通过保护法、酸性条件选择性蚀刻法合成介孔SiO2纳米载体。
[0062]选择性刻蚀法合成不同的介孔SiO2纳米胶囊载体:制备过程可以去离子水和乙醇作为溶剂，氨水作为碱催化剂，可采用不同的硅烷偶联剂(例如，十八烷基三甲基硅烷(C18TMS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、全氟十七烷三甲基氧硅烷(PDES)等)作为结构导向剂，加入正硅酸乙酯(TEOS)作为硅源在一定的温度下反应一定的时间并处理，得到介孔SiO2纳米载体材料。
[0063]制备上述金纳米粒子增效的二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂的方法:将采用传统选择性蚀刻法合成介孔二氧化硅纳米胶囊lOOmg，在乙醇中搅拌分散，加入100 μ 1-500 μ I巯基硅烷偶联剂70°C下回流4~12小时，得到巯基修饰的空心纳米胶囊。取0.01-0.1M的氯金酸溶液，用0.01M的NaOH调节pH=8_10之间，加入上述巯基空心纳米胶囊，之后加入硼氢化钠还原金颗粒，通过硫-金化学嫁接金颗粒；对所述的金纳米颗粒嫁接的介孔二氧化硅纳米胶囊装载氟碳化合物及客体分子；以及利用化学嫁接法对所述金颗粒负载的介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。
[0064]制备上述金纳米粒子增效的二氧化硅基超声造影剂及HIFU增效剂的另一种方法:采用传统选择性蚀刻法合成介孔二氧化硅纳米胶囊lOOmg，在乙醇中搅拌分散，加入100 μ 1-500 μ I氨基硅烷偶联剂70°C下回流4~12小时，得到氨基修饰的空心纳米胶囊。取0.01-0.1M的氯金酸溶液，加入柠檬酸钠溶液还原金颗粒，最后采用酰胺反应化学在纳米胶囊表面嫁接上丰富的纳米金颗粒；对所述的金纳米颗粒嫁接的介孔二氧化娃纳米胶囊装载氟碳化合物及客体分子；以及利用化学嫁接法对所述金颗粒负载的介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。
[0065]上述制备方法采用正硅酸乙酯(TEOS)作为硅源，但应理解，也可采用其它非功能性的硅源。本发明的方法可通过采用不同表面活性剂制备具有不同表面特性的介孔SiO2纳米材料，例如采用新型的表面活性剂PDES，由于其具有较强的结合有机氟碳化合物的能力，可增加制得的纳米材料负载有机氟碳化合物的能力，进而提高HIFU的增效作用。通过不同的制备工艺(例如，选择性腐蚀、一步法合成空心胶囊)、采用不同的表面活性剂材料C18TMS、CTAB和TOES作为结构导向剂，可制备出不同形貌(空心胶囊，杂化介孔材料)、粒径大小(100~lOOOnm)、介孔结构(有序/无序，孔径2.3~5nm,孔容0.2~1.4cm3/g)。
[0066]接着,对制得的金纳米粒子负载的介孔SiO2纳米材料进行染料分子或者客体药物分子的超声振荡装载，乙醇或水溶液反复清洗，除去胶囊外表面吸附的客体分子后干燥。[0067]同时，采用不同的装载工艺(例如，挥发浸溃法，真空灌注法)装载用于HIFU增效的客体分子(有机氟碳化合物或氟碳气体)得到无机有机复合纳米材料。装载的大致过程可如下所示:将不同条件制备出的客体药物分子装载的、金纳米粒子负载介孔SiO2纳米胶囊粉体经过一定的预处理过程(例如,溶解,脱气),加入一定量(例如I~10yL/mg空心纳米胶囊材料(MSNCs))的有机氟碳化合物(PH1、PFOB)或者灌注入氟碳化合物气体，经过一定时间的搅拌或超声，得到复合的纳米诊疗剂(MSNC-PFH，PMSNC-PFH)ο
[0068]对装载客体分子的胶囊表面进行表面修饰以使其表面带有氨基、羧基或巯基等活性官能团。表面改性的操作可采用本领域技术人员熟知的常用方法。本发明所选用的表面修饰材料为公认具有良好生物相容性的生物大分子聚乙二醇。聚乙二醇的修饰方法可采用领域技术人员熟知的常用方法，例如采用由酰胺基活化的聚乙二醇，或者辅助采用合适的缩合剂或连接剂。经过一定表面修饰后纳米材料可分散到磷酸盐缓冲液(PBS)的溶液中，配制成不同浓度的溶液，封存。
[0069]本发明提供了一种简单、环境友好的方法制备出具有良好分散性、良好生物相容性、粒径可控和孔径可控、超声造影及CT性能优良、HIFU增效明显的多功能的纳米材料。
[0070]此外，本发明还可以整合其它功能模块，例如荧光成像、PET成像、光声成像、CT成像和超声成像等，得到更加智能化的纳米药物/造影剂输送体系。重要的是，利用介孔SiO2纳米基载体的可控孔结构和表面的可修饰性，在担载有机氟碳化合物之前还可以实现亲/疏水药物的担载，实现材料诊断、HIFU治疗、药物化疗、药物缓释和靶向作用的多种功能的复合，因此可以实现HIFU无创治疗和化疗的一体化，为肿瘤的治疗提供更好、更有效的治疗方案。
[0071]图2示出以表面活性剂C18TMS、CTAB、H)ES作为结构导向剂制得的介孔SiO2纳米材料以及一步法制得的 介孔SiO2纳米材料的透射电镜照片(TEM照片)。结果表明不同方法制备的载体材料均具有良好的分散性、可控的孔径和空腔体积。图2中(al_a3)是不同放大倍数空心纳米胶囊材料(MSNCs)的投射照片。图2中(bl-b3)是不同放大倍数的负载金颗粒纳米胶囊材料(MSNCOAu)的投射照片。其下的图为其扫描投射照片、元素线扫描和面扫描照片。
[0072]图3中，(a)MSNCs和MSNCOAu的N2吸附脱附曲线以及孔径分布曲线；(b)新型负载金颗粒介孔纳米胶囊基增效剂材料(MSNC@Au-PFH-PEG，MAPP)在水溶液中动态光散射粒径分布；(c)MSNCOAu和装载模型染料花(pyr)的金纳米粒子负载纳米胶囊材料(pyr_MSNC@Au)的紫外可见吸收光谱UV-vi s以及(d)红外光谱FTIR。
[0073]图4示出本发明的新型金纳米粒子增效的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂在超声作用下(1MHz，2ff/cm2, 50%工作周期，30秒(s)，d=25mm)声空化现象的共聚焦照片；从图中可以看出在室温下(a)，装载的全氟己烷(ΡΠΟ稳定存在于MSNCOAu中，进行一次超声辐照之后，超声敏感/温敏的PFH发生相变产生气泡(b)，即可以起到超声增强的作用；二次辐照之后可以观察到气泡长大等空化效应(c l-c4)。
[0074]图5示出本发明的带有荧光标记物(FITC)的装载模型染料芘、金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂被L929细胞吞噬后2小时的共聚焦显微照片；装载的模型染料芘呈现出蓝色斑点。MAPP被FITC标记呈现出绿色斑点。从图片中可以看出，超声作用前少量绿色的荧光出现在胞浆中，绿色和蓝色重合，证明MAPP纳米粒子可以少量被细胞吞噬，药物在载体中基本没有释放(al-dl);超声作用后，大量的蓝色出现在细胞中，表明药物的增强释放及被细胞捕获(a2_d2)，超声明显增强了药物在细胞中的释放。
[0075]图6示出本发明中涉及的不同介质(3mL，6mg/mL)在超声作用下(1MHz，2W/cm2)不同时间温度的上升曲线。从图中可以看出，负载金颗粒后的纳米胶囊材料(MSNCOAu)在超声作用下温度升高明显快于单纯的纳米胶囊材料(MSNCs)，而装载氟碳化合物之后的金纳米粒子负载纳米胶囊基增效剂材料(MSNC@Au-PFH-PEG，MAPP)具有最快的超声效应温度升高速率。
[0076]图7示出MAPP材料与L929共培养18小时后在超声作用条件下死亡率。从图中可以看出，尽管只作用30秒时间，但是由于加入了 MAPP增效剂材料，细胞的死亡率均在40%以上，体现出MAPP材料良好的超声增效消融的能力。
[0077]图8示出PBS对照组，聚乙二醇修饰的金纳米粒子负载纳米胶囊材料(MSNC0Au-PEGjMAP)及MAPP材料体外超声显像照片及其对应的灰度值图标。同样的，MAPP材料呈现出最为优良的超声显像结果，这可能由于负载金纳米粒子后材料对于超声的散射信号的增强。
[0078]图9示出不同浓度MAPP材料的CT成像效果。从图中可以看出，随着MAPP浓度的升高，CT的值也不断升高，这是由于担载金颗粒的含量的升高。这也表明，MAPP材料不仅可以增强超声的成像，同时还可以增强CT成像，实现了多模式引导的高效HIFU治疗。
[0079]图10示出兔VX2肿瘤在注射MAPP材料前后体内不同模式下超声显像照片。从图中可以看出，注射MAPP材料后，肿瘤的灰度值均有较明显的变化，尤其在成像模式(对照(Contrast))下效果最为显著。 [0080]图11示出采用荷有肿瘤的兔子模型评价本发明的金纳米粒子负载二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂(MAPP)在HIFU治疗中的增效结果。通过MAPP材料通过种植VX2肿瘤的瘤兔耳静脉注射后HIFU消融肿瘤后的超声成像的B超图可以看出肿瘤的位置，通过HIFU消融后肿瘤部位的灰度值明显增强，显示出HIFU消融产生声环境的变化。肿瘤消融前后数码图片说明了 MAPP可以有效实现HIFU消融肿瘤的能力。
[0081]体外和体内的实验结果表明本发明提供的这种多功能纳米粒子增效的诊疗剂材料可以有效地用作多模式(超声，CT等)造影剂，精确地为HIFU治疗定位肿瘤部位，并有效地提高HIFU的治疗效果。重要的是，这种新型的多功能材料还可以进行抗癌药物的担载和传输，因此可以将HIFU治疗和化疗进行相互辅助治疗,从而提高肿瘤的治疗效果。
[0082]本发明进一步例如以下实施例以更好地说明本发明。同样应理解，以下实施例是为了更好地说明本发明，而非限制本发明。
[0083]实施例1
[0084]合成介孔SiO2纳米胶囊:35.7mL乙醇，5mL去离子水和1.57mL氨水在30°C水域中搅拌30分钟。迅速加入3mL正硅酸乙酯(TEOS)搅拌I小时。之后，再加入2.5mL TEOS和ImL十八烷基三甲基硅烷(C18TMS)继续搅拌I小时，得到的白色沉淀离心。配制0.6M的Na2CO3水溶液，加入上述白色沉淀80°C搅拌刻蚀0.5小时。得到的沉淀水洗3次，干燥后550°C煅烧6小时。
[0085]实施例2
[0086]合成负载荧光的有序介孔SiO2纳米胶囊:35.7mL乙醇，5mL去离子水和1.57mL氨水在30°C水域中搅拌30分钟。迅速加入3mL正硅酸乙酯(TEOS)搅拌I小时。之后，再加Λ 2mL TEOS后反应后离心分散在14mL水中；取上述溶液2mL，75mg CTAB，去离子水15mL，乙醇15mL和氨水0.275mL搅拌0.5小时。最后加入0.125mL TEOS和150uL FITC-APTES在30°C下搅拌2小时。在IOmL水中加入212mg Na2CO3,加入离心产物，50°C反应10小时，甲醇中回流去除表面活性剂CTAB，得到负载荧光的有序介孔空心球载体。
[0087]实施例3
[0088]纳米胶囊上负载5%含量的2-4纳米金颗粒:重复实施例1的方法，得到空心纳米胶囊IOOmg分散在乙醇中，在乙醇中搅拌分散，加入100 μ I巯基硅烷偶联剂70°C下回流8小时，得到巯基修饰的空心纳米胶囊。取0.01M的氯金酸溶液，用0.01M的NaOH调节pH为9，加入上述巯基空心纳米胶囊，之后加入硼氢化钠还原金颗粒，通过硫-金化学嫁接金颗粒。
[0089]实施例4
[0090]重复实施例3的方法，用0.01M的NaOH调节pH为11，得到负载10%含量的2_4纳米金颗粒纳米胶囊。
[0091]实施例5
[0092]纳米胶囊上负载5%含量的10纳米金颗粒:重复实施例1的方法，得到空心纳米胶囊IOOmg分散在乙醇中，在乙醇中搅拌分散，加入100 μ I氨基硅烷偶联剂70°C下回流8小时，得到氨基修饰的空心纳米胶囊。取0.025M的氯金酸溶液，加入柠檬酸钠溶液(5ml，I重量％)反应30分钟还原金颗粒，最后采用酰胺反应化学在纳米胶囊表面嫁接上丰富的纳米金颗粒
[0093]实施例6
[0094]重复实施例3的方法，将得到的金负载纳米胶囊乙醇清洗并干燥后，放入到模型染料芘的四氢呋喃溶液中(6mg/mL)，超声振荡I小时，之后离心分散、清洗、干燥得到装载花染料分子的金负载纳米胶囊。
[0095]实施例7
[0096]重复实施例6的方法，产物干燥后封装在带橡胶盖的小瓶中，用针筒将瓶中抽真空后加入一定量的全氟己烷(ΡΠΟ 10 μ L/mg MSNCOAu。
[0097]实施例8
[0098]重复实施例7的方法，产物分散在MES缓冲溶液中，加入1:1的巯基聚乙二醇(SH-PEG)，室温搅拌8小时后放入配制的PBS溶液中透析24小时，配制成相应浓度的溶液。
[0099]实施例9
[0100]通过共聚焦显微镜进行细胞吞噬观察:首先将FITC标记好的Pyr-MAPP分散到细胞培养基中(200μ g/mL)。再将细胞接种到共聚焦显微镜专用培养皿中，待细胞密度长到60%-70%时，去掉培养基，加入含有Pyr-MAPP纳米粒子的细胞培养基再共培养。去掉培养基，用PBS溶液尽量清洗掉没有被细胞吞噬的纳米粒子，转移到共聚焦显微镜下观察。图5示出本发明的带有荧光标记物(FITC)的装载模型染料芘、金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂被L929细胞吞噬后2小时的共聚焦显微照片；装载的模型染料芘呈现出蓝色。MAPP被FITC标记呈现出绿色。从图片中可以看出，超声作用前少量绿色的荧光出现在胞浆中，绿色和蓝色重合，证明MAPP纳米粒子可以少量被细胞吞噬，药物在载体中基本没有释放(al-dl);超声作用后，大量的蓝色出现在细胞中，表明药物的增强释放及被细胞捕获(a2-d2 )，超声明显增强了药物在细胞中的释放。
[0101]实施例10
[0102]将担载Pm后的MAPP的PBS溶液0.3mL封装在玻底培养皿中，超声作用后产生气泡并出现气泡融合长大过程；将材料注入塑料管中，埋入导电胶中，在超声作用下不同时间后量取溶液中的温度升高数据，与PBS或者未担载金纳米颗粒的纳米胶囊材料相对比，MAPP具有较好的超声热效应(参见图6)。
[0103]实施例11
[0104]将材料注入橡皮膜中，放入脱气水中，在不同模式超声作用下(MI=L I)体外成像，与PBS的超声成像的结果相对比，MAPP的具有较好的超声成像效果(参见图8)。
[0105]实施例12
[0106]将MAPP的PBS溶液通过瘤兔的耳静脉注入到瘤兔体内，经过30分钟的循环，采用超声扫描瘤兔肝部，定位肿瘤后，采用HIFU消融肿瘤，记录消融前后的不同灰度值并对消融之后的损伤体积进行计算。参见图11，从图中可以显著地看出在肿瘤部位，经过HIFU消融之后，肿瘤部位的灰度值明显增强，显示出HIFU消融产生损伤。肿瘤消融前后数码图片说明了 MAPP可以有效实现HIFU消融肿瘤的能力。
[0107]产业应用性
[0108]本发明提供一种制备具有良好的生物相容性的金纳米粒子增效的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂及其制备方法。本发明的制备工艺简单易行、无任何污染、产量高、成本低、效率高 ，得到的增效剂材料可以有效地给肿瘤组织显影，并且显著提高HIFU治疗的效果，因此显示出广阔的应用前景。此外，该多动能材料比表面积高、孔容大、孔径分布均一可调，有利于药物在其中的高效担载，有利于实现化疗与HIFU无创治疗的一体化。
【权利要求】
1.一种金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂，它包括: 表面修饰有聚乙二醇、金纳米粒子增效的介孔二氧化硅纳米胶囊；以及 装载在所述介孔二氧化硅纳米胶囊中的用于造影及HIFU增效的客体分子。
2.根据权利要求1所述的金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米胶囊粒径为100~lOOOnm，孔径为2.5~5nm，孔容为0.2 ~1.4cm3/g。
3.根据权利要求1所述的金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂，其特征在于，所述金纳米粒子为所述介孔二氧化硅纳米胶囊质量的I~10%，所述客体分子为所述介孔二氧化娃纳米胶囊质量的1.7~8.5%。
4.根据权利要求1所述的金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂，其特征在于，所述客体分子包括全氟己烷、全氟溴辛烷和客体药物分子、染料分子。
5.根据权利要求1所述的金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载有荧光标记物。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂,其特征在于,所述介孔二氧化娃纳米胶囊装载有抗肿瘤药物。
7.一种制备权利要求1~6中任一项所述金纳米粒子负载的二氧化硅基多模式造影剂及HIFU增效剂的方法，所述方法包括: 对介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面改性，以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面带有氣基、竣基或疏基； 使所述介孔二氧化硅纳米胶囊表面负载不同粒径及含量的金纳米颗粒；以及 使所述介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于造影及HIFU增效的客体分子；以及 利用化学嫁接法对所述介孔二氧化硅纳米胶囊进行表面修饰以使所述介孔二氧化硅纳米胶囊的表面修饰有聚乙二醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过挥发浸溃或真空灌注使所述金纳米粒子负载的介孔二氧化硅纳米胶囊装载用于HIFU增效的客体分子。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述介孔二氧化硅纳米胶囊通过选择性蚀刻法合成，所述选择性蚀刻法包括: 采用去离子水和乙醇作为溶剂、氨水作为碱化剂、正硅酸乙酯作为硅源、以及采用硅烷偶联剂作为结构导向剂制得实心二氧化硅纳米球；以及 采用碳酸钠水溶液作为蚀刻剂蚀刻所述实心二氧化硅纳米球。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂包括十八烷基三甲基硅烧、十TK烷基二甲基漠化按和全氣十七烧二甲基氧硅烷。
【文档编号】A61P35/00GK103845743SQ201210518109
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】王霞, 陈航榕, 施剑林, 黄贤良, 金智渊 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所, 北京三星通信技术研究有限公司