专利名称：肌氨肽苷脂质体注射剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肌氨肽苷的新制剂，具体涉及一种肌氨肽苷脂质体注射剂及其制法，属于医药技术领域。
背景技术：
肌氨肽苷是以健康家兔肌肉和心肌为原料，采用生物学技术分离提取精制而成，其富含多肽、氨基酸、核苷剂核苷酸等多种生物活性物质和多种微量元素，主要检测成分为多肽和次黄嘌呤，肌氨肽苷具有扩张冠状动脉，增加冠脉流量，增加心肌收缩力，改善血液循环障碍，活化心脑细胞，促进机体代谢等作用。广泛用于心功能不全、心绞痛、心肌梗死、脑梗死、肌萎缩及神经衰弱综合症等，且作用显著。目前上市的肌氨肽苷制剂有肌氨肽苷注射液和肌氨肽苷冻干粉针剂。专利文献CN1611261A公开了一种注射用肌氨肽苷药用制剂及其制备方法，将动物的心脏的肌肉经过组织处理和匀浆，反复冻融，加热离心超滤制得肌氨肽苷原料将肌氨肽苷原料用水、丙酮、氯仿、乙醇、乙醚中的至少一种溶剂进行溶解，同时加入右旋糖酐、甘露醇、氯化钠、乳糖、甘氨酸、山梨醇、枸橼酸中的至少一种辅料，过滤，干燥制得粉针剂；专利CN1824294A公开了一种肌氨肽苷注射液的制备工艺，在生产过程中加入壳聚糖寡糖后，可吸附变性蛋白质、月旨肪等易析出的杂质，形成沉淀，提高产·品纯度；CN1939533A公开了一种注射用肌氨肽苷粉针剂及其制备方法，以多肽、次黄嘌呤为主要成分与赋形剂制成的微黄色或深黄色的块状固体或无定形物；CN102266351A公开了一种肌氨肽苷注射液药物组合物及其制备方法，由肌氨肽苷溶液、乙酮可可碱、果糖二磷酸钠、聚乙二醇制成；CN1522757A公开了一种肌氨肽苷粉针剂及其制备方法，其由多肽、次黄嘌呤和赋形剂组成，采用现代生物提取技术制得肌氨肽苷溶液，病运用低温冻干制剂技术制成无菌冻干粉针剂。然而上述制剂中的多肽、氨基酸、核苷及核苷酸等物质在运输、贮藏、销售过程中易受环境因素影响，造成产品质量不稳定，导致有效成分的含量降低，生物利用度下降，影响临床应用。脂质体(liposomes)最早是1965年被英国Banghan等作为研究生物膜的模型提出的。是指将药物包封于类脂质双分子形成的薄膜中间所制成的超微型球状定向药物载体制剂，属于靶向给药系统的一种新剂型。脂质体作为药物载体，具有诸多优点如脂质体既能包封脂溶性药物，又能包封水溶性药物；减轻变态反应和免疫反应；延缓释放，降低体内消除速度；能有效地保护被包裹药物，提高生物利用度；改变药物在体内的分布，并能靶向性释药，能降低药物的毒副作用；适合多途径给药等。人们通过研究发现，脂质体作为药物的载体能够控制药物的释放，提高药物靶向性，减少药物毒性和副作用，提高药物疗效。为了提高肌氨肽苷的稳定性，增强其靶向性，本发明人对肌氨肽苷的脂质体注射剂进行研究，取得了预料不到的效果，克服现有的肌氨肽苷制剂存在的一系列问题，提高药物的稳定性，延长药物在体内的保留时间，长久发挥药效，提高生物利用度，降低毒副作用，降低不良反应的发生率，改进治疗速度和治疗效果。
制备脂质体的挑战在于选择适当的脂质体组成成分和制法。由于脂质体的性质如稳定性、包封率、起效时间、在体内的循环时间、生物利用度和毒副作用等与脂质体的组成直接地密切相关，而脂质体的组成与所要包封的药物性质直接地密切相关，因此，选择什么样的成分形成具有良好品质的肌氨肽苷脂质体是首要解决的问题。
发明内容
为了形成品质优良的肌氨肽苷脂质体注射剂，重要的是寻找能与肌氨肽苷良好相容从而将其良好包封且不渗漏的成膜材料，以及寻找能使脂质体形成稳定注射剂的赋形剂成分。为了实现上述目的，本发明人进行的大量研究和试验，发现特定重量配比的肌氨肽苷多肽、肌氨肽苷核苷、蛋黄磷脂酰肌醇、胆固醇、吐温80、右旋糖酐或氯化钠能制成品质优异的肌氨肽苷脂质体注射剂，其中，药物活性成分的包封率高，脂质体粒径小且分布均匀，与现有技术中的肌氨肽苷注射剂相比，本发明制剂的药物活性成分在体循环中的保留时间显著延长，药物的生物相容性高，生物利用度明显提高，疗效明显提高。本发明中所述的肌氨肽苷脂质体注射剂，其规格为2ml:3. 5mg(多肽)与O. 5mg (次黄嘌呤)、5ml:8. 75mg (多肽)与O. 5mg (次黄嘌呤)、5ml: 8. 75mg (多肽)与1. 25mg (次黄嘌呤)、IOml: 17. 5mg (多肽)与2. 5mg (次黄嘌呤)或多肽3. 5mg与次黄嘌呤O. 5mg、多肽7. Omg与次黄嘌呤1. Omg、多肽17. 5mg与次黄嘌呤2. 5mg、多肽8. 75mg与次黄嘌呤1. 25mg。一方面，本发明提供一种肌氨肽苷脂质体冻干粉针注射剂，其主要由以下重量配比的成分制成
肌氨肽苷多肽(以多肽计)3. 5份
肌氨肽苷核苷(以次黄嗓呤计)O. 2-0. 5份
蛋黄磷脂酸肌醇60-150份
胆固醇30-100份
吐温8020-80份
右旋糖酐40份优选地，根据本发明的肌氨肽苷脂质体冻干粉针注射剂，主要由包括以下重量配比的成分制成
肌氨肽苷多肽(以多肽计)3. 5份
肌氨肽苷核苷(以次黄嘌呤计)O. 2-0. 5份
蛋黄磷脂酰肌醇80-120份
胆固醇50-80份
吐温8030-60份
右旋糖酐40份
另一方面，本发明提供一种肌氨肽苷脂质体注射液，其主要由以下重量配比的成分制成
肌氨肽苷多肽(以多肽计)3. 5份
肌氨肽苷核苷(以次黄嘌呤计)O. 2-0. 5份
蛋黄磷脂酰肌醇60-150份
胆固醇30-100份
吐温8020-80份
氯化钠18份优选地，根据本发明的肌氨肽苷脂质体注射剂主要由包括以下重量配比的成分制
成
肌氨肽苷多肽(以多肽计)' 气份
肌氣狀鲁核苦(以次黄嗓吟计)O. 2-0. 5份
蛋黄磷脂酰肌醇80-120份
胆固醇50-80份
吐温8030-60份
氯化钠18份作为用于形成脂质体的磷脂，可以使用天然磷脂和合成磷脂。天然磷脂包括磷脂酰乙醇胺、蛋黄卵磷脂、蛋黄磷脂酰肌醇、蛋黄磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、大豆磷脂酰甘油、大豆磷脂酰丝氨酸、和大豆磷脂酰肌醇等。合成磷脂为二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二豆蘧酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蘧酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油等。本发明中，根据肌氨肽苷的特点，发现蛋黄磷脂酰肌醇特别适于作为基础磷脂成膜材料。蛋黄磷脂酰肌醇作为一种天然磷脂，其含量非常高，容易获得，价格低廉。蛋黄磷脂酰肌醇的相变温度较高，易于形成稳定的脂质体膜。当使用其他磷脂时，难以形成品质优良的脂质体，脂质体的包封率、稳定性和渗漏
率等性质差。为了改善脂质体的稳定性，所用蛋黄磷脂酰肌醇的纯度为98%以上，优选99%以上。在本发明的肌氨肽苷脂质体注射剂中，相对于3. 5重量份的多肽而言，蛋黄磷脂酰肌醇的用量为60-150重量份。如果蛋黄磷脂酰肌醇的用量低于60重量份，则无法形成稳定的脂质体；反之，如果蛋黄磷脂酰肌醇的用量的用量高于150重量份，则药物活性成分的包封率下降，注射剂的品质以及疗效降低。在本发明的肌氨肽苷脂质体注射剂中，胆固醇和吐温80用于调节脂质体的膜稳定性。胆固醇是一种双亲性分子，与蛋黄磷脂酰肌醇相结合，阻止其凝聚成晶体结构。胆固醇掺入蛋黄磷脂酰肌醇双层，类似于“缓冲剂”一样起到调节膜结构“流动性”的作用。当低于相变温度时，胆固醇可以使膜减少有序排列，增加流动性；当高于相变温度时，胆固醇可以增加膜的有序排列，从而降低膜的流动性。胆固醇能使脂质体双分子层膜固化，从而减少自由基的生成，降低氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。在本发明的肌氨肽苷脂质体注射剂中，相对于3. 5重量份的多肽而言，吐温80的用量为30-60份重量份。如果吐温80的用量低于30重量份，则由于其用量过低导致对肌氨肽苷脂质体注射剂的稳定性改进不够，反之，如果吐温80的用量高于60重量份，则用于其用量过高而导致脂质体膜易于泄露。研究发现，当使用上述特定量的肌氨肽苷多肽、肌氨肽苷核苷、蛋黄磷脂酰肌醇、胆固醇、吐温80时，可以得到品质优良的肌氨肽苷脂质体，其包封率和稳定性都很高，毒性低，生物利用度高。另一方面，本发明还提供一种肌氨肽苷脂质体注射剂的制备方法，具体包括如下制备步骤A.肌氨肽苷原料的制备(I)取新鲜或冷冻兔的肌肉，净选(除去脂肪、结缔组织)；用冷注射用水洗净，力口2-5倍注射用水，用胶体磨匀浆，置于_80°C冷冻6-12小时；然后置于40-60°C的水浴锅中融化，反复冻融三次；将融化的匀浆液置于90-100°C的水浴锅中30分钟，冷却至室温；加入O. 05-0. 5%的药用炭70-90°C保温搅拌吸附10-15分钟，过滤除炭；调节pH值至6. 0-8. 0，超滤，收集分子量小于5KD的超滤液，冷冻干燥，测定多肽纯度；(2)取新鲜或冷冻兔心脏`，净选(除去脂肪、结缔组织)；用冷注射用水洗净，加2-5倍注射用水，用胶体磨匀浆，调节PH值为4. 0-6. O ;匀浆液以2500rpm离心30分钟，收集上清液；加入乙醇，使含醇量达到65%，冷藏静置24小时；2500rpm离心30分钟，弃去上清液，用O. 9%的氯化钠溶解沉淀，再以2500rpm离心30分钟；取上清液加入O. 05-0. 5%的药用炭70-90°C保温搅拌吸附10-15分钟，过滤除炭；调节pH值至6. 0-8. 0，超滤，收集分子量小于5KD的超滤液，冷冻干燥，测定次黄嘌呤纯度。B.肌氨肽苷脂质体注射剂的制备(I)将蛋黄磷脂酰肌醇、胆固醇、吐温80溶于适量的有机溶剂中，然后将将其置于茄形瓶中旋转蒸发，直至形成均匀的薄膜；(2)将肌氨肽苷多肽、肌氨肽苷核苷溶于适量的缓冲盐溶液中，然后将缓冲盐溶液加入上述茄形瓶中搅拌数分钟，再在30°C水浴中搅拌数小时即得到肌氨肽苷脂质体；(3)向上述制得的肌氨肽苷脂质体中加入右旋糖酐，用探头超声10分钟，定容，过
O.22um微孔滤膜过滤，分装，冷冻干燥，轧盖，制得肌氨肽苷脂质体冻干粉针注射剂；或者，向上述制得的肌氨肽苷脂质体中加入氯化钠，用探头超声10分钟，定容，过
O.22um微孔滤膜过滤，快速冷冻，然后恢复到室温，灌封，灭菌，制得肌氨肽苷脂质体注射液。上述所述的制备方法，其中所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醚和乙酸乙酯中的一种或几种，优选为丙酮。
上述所述的制备方法，其中所述的缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲溶液、枸橼酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液中的一种。上述所述的制备方法，其中所述的缓冲盐溶液为pH为6. 8的磷酸盐缓冲溶液。制备脂质体的挑战在于如何使脂质体膜形成适当大小、适当结构材料的包封率高的囊泡。而且这些材料在形成脂质体不漏出。本发明人通过选择适当的材料成分、采用合适的制备工艺，获得了品质优良的肌氨肽苷脂质体注射剂，脂质体粒径小，粒径分布均匀，包封率高，稳定性高。研究发现，脂质体的大小是影响脂质体在体内分布和停留时间的主要因素，脂质体的粒径越小，体内停留时间越长。通过本发明方法制备的肌氨肽苷脂质体颗粒小，粒径大小分布均匀，这是其在体内代谢率低、生物利用度高的因素之一。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。实施例1肌氨肽苷原料的制备(I)取20kg新鲜兔的肌肉，净选(除去脂肪、结缔组织);用冷注射用水洗净，加50L注射用水，用胶体磨匀浆， 置于_80°C冷冻6-12小时；然后于50°C的水浴融化，反复冻融三次；将融化的匀浆液置于90°C水浴30分钟，冷却至室温；加入30g的药用炭80°C保温搅拌吸附15分钟，过滤除炭；调节pH值至7. 0，超滤，收集分子量小于5KD的超滤液，冷冻干燥，测定多肽纯度为98. 4% ；(2)取IOkg新鲜或冷冻兔心脏，净选(除去脂肪、结缔组织)；用冷注射用水洗净，加20L注射用水，用胶体磨匀浆，调节pH值为4. O ;匀浆液以2500rpm离心30分钟，收集上清液；加入乙醇，使含醇量达到65%，冷藏静置24小时；2500rpm离心30分钟，弃去上清液，用O. 9%的氯化钠溶解沉淀，再以2500rpm离心30分钟；取上清液加入IOg药用炭80°C保温搅拌吸附10分钟，过滤除炭；调节pH值至7. 0，超滤，收集分子量小于5KD的超滤液，冷冻干燥，测定次黄嘌呤纯度为96. 8% ；实施例2肌氨肽苷脂质体注射液
肌氨肽苷多肽(以多肽计)3. 5g
肌氨肽苷核苷(以次黄嘌呤计)O. 5g
蛋黄磷脂酰肌醇IOOg
胆固醇30g
吐温8045g
氯化钠18g
制备过程(I)将IOOg蛋黄磷脂酰肌醇、30g胆固醇、45g吐温80溶于1500ml的丙酮中，然后将将其置于茄形瓶中旋转蒸发，直至形成均匀的薄膜；(2)将3. 5g肌氨肽苷多肽、O. 5g肌氨肽苷核苷溶于1500ml pH为6. 8的磷酸盐缓冲溶液中，然后将缓冲盐溶液加入上述茄形瓶中搅拌数分钟，再在30°C水浴中搅拌5小时即得到肌氨肽苷脂质体；(3)向上述制得的肌氨肽苷脂质体中加入18g氯化钠，用探头超声10分钟，用pH为6. 8的磷酸盐缓冲溶液定容至2000ml，过O. 22um微孔滤膜过滤，快速冷冻，然后恢复到室温，灌封，灭菌，制得1000支肌氨肽苷脂质体注射液。实施例3肌氨肽苷脂质体注射液
肌氨肽苷多肽(以多肽计)17
肌氨肽苷核苷(以次黄嘌呤计)2. Sg
蛋黄磷脂酰肌醇300g
胆固醇300g
吐温80400g
氯化钠9 Og制备过程(I)将300g蛋黄磷脂酰肌醇、300g胆固醇、400g吐温80溶于3000ml的丙酮中，然后将将其置于茄形瓶中旋转蒸发，直至形成均匀的薄 膜；(2)将17. 5g肌氨肽苷多肽、2. 5g肌氨肽苷核苷溶于5000ml pH为6. 8的磷酸盐缓冲溶液中，然后将缓冲盐溶液加入上述茄形瓶中搅拌数分钟，再在30°C水浴中搅拌5小时即得到肌氨肽苷脂质体；(3)向上述制得的肌氨肽苷脂质体中加入90g氯化钠，用探头超声10分钟，用pH为6. 8的磷酸盐缓冲溶液定容至10000ml，过O. 22um微孔滤膜过滤，快速冷冻，然后恢复到室温，灌封，灭菌，制得1000支肌氨肽苷脂质体注射液。 实施例4肌氨肽苷脂质体冻干粉针剂
肌氨肽苷多肽(以多肽计)7 Ug
肌氨肽苷核苷(以次黄嘌呤计)1. Og
蛋黄磷脂酰肌醇300g
胆固醇2 OOg
吐温804Og
右旋糖酐40g制备过程(I)将300g蛋黄磷脂酰肌醇、200g胆固醇、40g吐温80溶于1500ml的丙酮中，然后将将其置于茄形瓶中旋转蒸发，直至形成均匀的薄膜；(2)将7. Og肌氨肽苷多肽、1. Og肌氨肽苷核苷溶于1500ml pH为6. 8的磷酸盐缓冲溶液中，然后将缓冲盐溶液加入上述茄形瓶中搅拌数分钟，再在30°C水浴中搅拌5小时即得到肌氨肽苷脂质体；(3)向上述制得的肌氨肽苷脂质体中加入40g右旋糖酐，用探头超声10分钟，用pH为6. 8的磷酸盐缓冲溶液定容至2000ml，过O. 22um微孔滤膜过滤，分装，冷冻干燥，轧盖，制得1000瓶肌氨肽苷脂质体冻干粉针剂。对比例1-3肌氨肽苷脂质体注射剂的制备采用分别与实施例2-4相同的生产工艺，将如下表1-3中所示的对比例1-3中的成分分别制成肌氨肽苷脂质体注射剂表I对比例1-3中所用成分
权利要求
1.一种肌氨肽苷脂质体注射剂，其特征在于由肌氨肽苷多肽、肌氨肽苷核苷、蛋黄磷脂酰肌醇、胆固醇、吐温80、右旋糖酐或氯化钠制成。
2.根据权利要求1所述的肌氨肽苷脂质体注射剂，其特征在于其规格为2ml:3. 5mg (多肽)与0. 5mg (次黄嘌呤)、5ml:8. 75mg (多肽)与0. 5mg (次黄嘌呤)、5ml: 8. 75mg (多肽)与1.25mg (次黄嘌呤)、10ml: 17. 5mg (多肽)与2. 5mg (次黄嘌呤)或多肽3. 5mg与次黄嘌呤.0.5mg、多肽7. 0mg与次黄嘌呤1. 0mg、多肽17. 5mg与次黄嘌呤2. 5mg、多肽8. 75mg与次黄嘌呤1. 25mg。
3.根据权利要求1或2任一所述的肌氨肽苷脂质体注射剂，其特征在于由以下重量份数比的成分制成 肌氨肽苷多肽(以多肽计)3. 5份肌氨肽苷核苷(以次黄嘌呤计)0 2-0. 5份蛋黄磷脂酰肌醇60-150份胆固醇30-100份吐温8020-80份 右走糖酐40份。
4.根据权利要求1或2任一项所述的肌氨肽苷脂质体注射剂，其特征在于主要由以下重量份数比的成分制成 肌氨肽苷多肽(以多肽计)3.5份肌氨肽苷核苷(以次黄嘌冷计)0. 2-0. 5份蛋黄磷脂酰肌醇80-120份胆固醇50-80份吐温8030-60份 氯化钠18份。
5.一种制备肌氨肽苷脂质体注射剂的方法，其特征在于包括如下步骤 A.肌氨肽苷原料的制备 (1)取新鲜或冷冻兔的肌肉，净选(除去脂肪、结缔组织)；用冷注射用水洗净，加2-5倍注射用水，用胶体磨匀衆，置于_80°C冷冻6-12小时；然后置于40-60°C的水浴锅中融化，反复冻融三次；将融化的匀浆液置于90-100°C的水浴锅中30分钟，冷却至室温；加入.0.05-0. 5%的药用炭70-90°C保温搅拌吸附10-15分钟，过滤除炭；调节pH值至6. 0-8. 0，超滤，收集分子量小于5KD的超滤液，冷冻干燥，测定多肽纯度； (2)取新鲜或冷冻兔心脏，净选(除去脂肪、结缔组织);用冷注射用水洗净，加2-5倍注射用水，用胶体磨匀浆，调节PH值为4. 0-6. 0 ;匀浆液以2500rpm离心30分钟，收集上清液；加入乙醇，使含醇量达到65%，冷藏静置24小时；2500rpm离心30分钟，弃去上清液，用0. 9%的氯化钠溶解沉淀，再以2500rpm离心30分钟；取上清液加入0. 05-0. 5%的药用炭70_90°C保温搅拌吸附10-15分钟，过滤除炭；调节pH值至6. 0-8. 0，超滤，收集分子量小于5KD的超滤液，冷冻干燥，测定次黄嘌呤纯度；B.肌氨肽苷脂质体注射剂的制备 (1)将蛋黄磷脂酰肌醇、胆固醇、吐温80溶于适量的有机溶剂中，然后将将其置于茄形瓶中旋转蒸发，直至形成均匀的薄膜； (2)将肌氨肽苷多肽、肌氨肽苷核苷溶于适量的缓冲盐溶液中，然后将缓冲盐溶液加入上述茄形瓶中搅拌数分钟，再在30°C水浴中搅拌数小时即得到肌氨肽苷脂质体； (3)向上述制得的肌氨肽苷脂质体中加入右旋糖酐，用探头超声10分钟，定容，过O.22um微孔滤膜过滤，分装，冷冻干燥，轧盖，制得肌氨肽苷脂质体冻干粉针注射剂； 或者，向上述制得的肌氨肽苷脂质体中加入氯化钠，用探头超声10分钟，定容，过O.22um微孔滤膜过滤，快速冷冻，然后恢复到室温，灌封，灭菌，制得肌氨肽苷脂质体注射液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醚和乙酸乙酯中的一种或几种，优选为丙酮。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的选自磷酸盐缓冲溶液、枸橼酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液中的一种。
全文摘要
本发明提供一种肌氨肽苷脂质体注射剂，主要由肌氨肽苷多肽、肌氨肽苷核苷、蛋黄磷脂酰肌醇、胆固醇、吐温80、右旋糖酐或氯化钠制成。与现有制剂相比，本发明的制剂大大提高了制剂的稳定性和生物利用度，释药平稳，提高了制剂产品的质量，减少了毒副作用，提高了制剂产品质量，疗效更显著。
文档编号A61P9/00GK103040868SQ201210547959
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者王平 申请人:海南百思特医药科技有限公司