瘿蜂防治剂的制作方法

瘿蜂防治剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及昆虫物种中RNA介导的基因沉默领域。本发明部分地基于本发明人对来自桉树入侵物种瘿蜂害虫桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybe?invasa)(Li)和桉干瘿姬小蜂(Ophelimus?maskelli)(Om)的基因的测序。在某些方面，本发明提供Li和Om的核酸、其衍生物以及此类核酸和衍生物作为瘿蜂防治剂的用途。
【专利说明】瘿蜂防治剂
[0001]序列表
[0002]本申请包含以ASCII格式经EFS-Web提交的序列表，在此将其全部内容引入以作參考。将2012年3月30日制作的所述ASCII副本命名为34702W01.txt，其大小为312，664字节。
[0003]相关申请的交叉參考
[0004]本申请要求2011年3月30日提交的美国临时申请61/469，469和2012年I月30日提交的美国临时申请61/592，175的优先权。将前述临时申请各自的全部内容引入于此
以作參考。
【技术领域】
[0005]本发明涉及昆虫物种中双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默领域。
【背景技术】
[0006]在南北半球均发生了桉树的瘿蜂(gall wasp)侵扰,并且对中国、澳大利亚、以色列和巴西的商业桉树种植造成威胁。防治桉树感染瘿蜂的努力包括尝试分离天然抗性植物和天然捕食者。这些努力已遇到了限制或并未成功。瘿蜂产生的瘿瘤(gall)的保护性环境使化学杀虫剂防治瘿蜂产生困难。
[0007]即使可行，化学杀虫剂防治也具有劣势。化学杀虫剂可能不利于环境，不是选择性的，且可能对非目标作物和动物群有害。化学杀虫剂存留于环境中并通常代谢缓慢，或根本不代谢。化学杀虫剂在食物链中，`特别是在较高的捕食者物种内积累，它们可在较高的捕食者物种中充当诱变剂和/或致癌物以引起不可逆且有害的遗传修饰。此外，由于重复使用相同的杀虫剂或具有相同作用模式的杀虫剂可使作物害虫发展出对化学杀虫剂的抗性。
[0008]RNA干扰或“RNAi”为由与要下调的靶基因区序列互补的双链RNA(dsRNA)弓丨发的序列特异性下调基因表达的过程(还称作“基因沉默”或“RNA介导的基因沉默”)。多细胞生物中借助RNA干扰(RNAi)的靶基因下调已成为行之有效的技木。美国专利申请公布US2009/0285784 Al和US2009/0298787涉及dsRNA作为昆虫防治剂，并在此将其各自的全部内容引入于此以作參考。美国专利6，506，559号、美国专利申请公布2003/00150017 Al、国际公布 WO 00/01846,WO 01/37654,WO 2005/019408、TO 2005/049841、WO 05/047300 涉及RNAi保护植物抵抗昆虫的用途。在此将前述专利和公布的申请的全部内容分别引入于此以作參考。

【发明内容】

[0009]本发明部分地基于本发明人对来自桉树入侵物种瘿蜂害虫,桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybe invasa) (Li)和按干瘦姬小蜂(Ophelimus maskelli) (Om)的基因的测序。在某些方面，本发明由此提供Li和Om的核酸、其衍生物以及此类核酸和衍生物作为瘿蜂防治剂的用途。[0010]在某些方面,本发明提供在高严格杂交(high stringency hybridization)条件下与 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10,SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:12,SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQID NO:45-123, SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222 和 SEQ ID NO:234-244 中所示的序列及其互补序列选择性杂交的分离的核酸。[0011]在某些方面，本发明提供与SEQ ID NO: U SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ IDNO:4,SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:45-123,SEQ ID NO:127-132,SEQ ID NO:150-222和SEQ ID NO:234-244中所示的序列及其互补序列的同一1注(identical)为90-99.99%的分离的核酸。[0012]在某些方面，本发明提供包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4,SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID N0:45_123、SEQ ID NO:127-132,SEQ ID NO:150-222和SEQ ID NO:234-244中所示的序列及其互补序列的至少17个邻接核苷酸(contiguousnucleotides)的分离的核酸。[0013]在某些方面，本发明提供来自Li或Om的核酸，所述核酸包括如上所示的与所述核酸的蜜蜂直向同源物(ortholog)的同一‘丨生为约80%以下的核酸。[0014]在某些方面，本发明提供包括可操作地连接至表达调控序列(expressioncontrol sequence)的来自Li或Om的核酸或此类序列的反向互补体的载体。[0015]在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有包括可操作地连接至表达调控序列的来自Li或Om的核酸或此类序列的反向互补体的载体的宿主细胞。[0016]在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有包括可操作地连接至表达调控序列的来自Li或Om的核酸的载体的植物组织，例如叶组织和种子。[0017]在某些方面，本发明提供抑制Li或Om核酸表达的分离的小抑制性核糖核酸(siRNA)分子。[0018]在某些方面，本发明提供分离的双链核糖核酸(dsRNA)分子，所述分子包括SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ IDNO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12，SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26，SEQID NO:45-123, SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222 和 SEQ ID NO:234-244 中的至少17个邻接核苷酸基本上同一的第一链核苷酸和与第一链核苷酸基本上互补的第二链核苷酸。[0019]在某些方面，本发明提供双链核糖核酸(dsRNA)分子，其与来自Li或Om的mRNA(Li或Om靶dsRNA)高度同源(大于80%)，包括与dsRNA的蜜蜂直向同源物的同一性为约80%以下的上述所示的dsRNA分子。
[0020]在某些方面，本发明提供包括可操作地连接至为来自Li或Om的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列的载体。
[0021]在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有载体的宿主细胞，所述载体包括可操作地连接至为来自Li或Om的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列。
[0022]在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有载体的植物组织，所述载体包括可操作地连接至为来自Li或Om的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列。
[0023]在某些方面，本发明提供抑制Li或Om的必需基因的表达的分离的小抑制性核糖核酸(siRNA)分子。
[0024]在某些方面，本发明提供通过在植物中或者在植物的繁殖或生殖材料中表达Li或Om的dsRNA来生产抗害虫植物的方法。
[0025]在某些方面，本发明提供通过在桉树中或者在桉树的繁殖或生殖材料中表达Li或Om的dsRNA来生产抗害虫桉树的方法。
[0026]在某些方面，本发明提供通过在桉树中或者在桉树的繁殖或生殖材料中表达Li或Om的靶向dsRNA来生产抗瘿蜂感染和/或侵扰的桉树的方法。
[0027]在某些方面，本发明·提供抗植物病原害虫的植物的生产方法，所述方法用表达dsRNA的重组DNA构建体或构建体的组合来转化植物细胞；由转化的植物细胞再生植物；和在适于所述重组DNA构建体表达的条件下使转化的植物细胞生长。
[0028]本发明的一个或多个实施方案的细节将于下述附图和说明书中示出。从说明书和附图以及从权利要求来看，本发明的其他特征、目的和优势将显而易见。
【专利附图】

【附图说明】
[0029]图1描述了根据本发明的某些非限制性核酸。(A)构建有三个转基因的核酸构建体#I (SEQ ID NO: 37)的示意图。转基因P1-T1编码用于沉默Li外被体(Coatomer)亚单位a-样(a C0P)、染色质域-解旋酶DNA-结合蛋白M1-2同系物(Cdh3)和毒羧酸酯酶-6 同エ型 I (venom carboxyl esterase-6 isoforml) (VCE-F2)基因的发夹 RNA(hpRNA)。转基因P2-T2编码用于沉默Oma C0P、Cdh3和VCE-F2基因的hpRNA。转基因P3-T3编码具有Li a COP、Cdh3和VCE-F2基因以及0m a COP、Cdh3和VCE-F2基因的正义序列的mRNA。由转基因P3-T3转录的mRNA为细胞质增强沉默信号(cytoplasmic enhancement of thesilencing signal)的模板。(B)通过核酸构建体#I (左-Li RNAil, SEQ ID NO: 137 ;右-OmRNAil, SEQ ID NO: 138)转录产生的hpRNA分子。定义:Pl_CaMV35S启动子(SEQ ID NO:27)；P2-AtUBQl 启动子(SEQ ID NO: 28) ;P3 - At肌动蛋白 7 (AtActin7)启动子(SEQ ID NO: 29)；Tl-AtRiboProS40 终止子(SEQ ID NO:32) ;T2_AtUBQl 终止子(SEQ ID NO:33) ;T3_N0S 终止子(SEQ ID NO:34) ;i 1-lOObp Li a COP 基因(SEQ ID NO:1) ；i2-100bp Li VCE-F2 基因(SEQ ID NO:2) ；i3-100bp Li Cdh3 基因(SEQ ID NO:3);带有 A93C 置换(change)以消除预测的聚腺苷酸化位点的ml-lOObp Om a COP基因(SEQ ID NO:7) ;ml*(P3和T3之间的 ml)-1OObp Om a COP 基因(SEQ ID NO:234) ；m2-100bp Om Cdh3 基因(SEQ ID NO:8)；m3-100bp Om VCE-F2 基因(SEQ ID NO:9);带有 XhoI 位点的 L1-环 #1 (SEQ ID NO: 13)；带有 AscI 位点的 L2-环 #2 (SEQ ID NO: 14)。Poly A 尾如 SEQ ID NO: 245 所公开。
[0030]图2描述根据本发明的某些非限制性核酸。(A)构建有三个基因的核酸构建体#2 (SEQ ID NO: 38)的示意图。转基因P1-T4编码用于沉默Li几丁质合成酶、铁蛋白和保幼激素环氧化物水解酶(JHEH)基因的发夹RNA (hpRNA)。转基因P4至T5编码用于沉默Om几丁质合成酶、铁蛋白和JffiH基因的hpRNA。转基因P5-T3编码具有Li几丁质合成酶、铁蛋白和JHEH基因以及Om几丁质合成酶、铁蛋白和JHEH基因的正义序列的mRNA。由转基因P5-T3转录的mRNA为细胞质增强沉默信号的模板。(B)通过核酸构建体#2转录产生的hpRNA分子。(左-Li RNAi 2, SEQ ID NO: 141;右-Om RNAi 2, SEQ ID NO: 142)。定义:Pl_CaMV35S启动子(SEQ ID NO:27) ;P4 - At Y TI (AtGammTI) P2 启动子(SEQ ID NO:30) ；P5-sgFIMV B云カ子(SEQ ID N0:31) ；T4 - At 8 (AtDelta)TIP 终止子(SEQ ID NO:35) ；T5-AtGammTI P2終止子(SEQ ID NO:36) ;T3_N0S 终止子(SEQ ID NO:34) ；i4-100bp Li 几丁质合成酶基因(SEQ ID NO:4) ；i5-100bp Li铁蛋白基因(SEQ ID NO:5) ；i6-100bp Li JHEH基因(SEQ IDNO:6) ；m4-100bp Om 几丁质合成酶基因(SEQ ID NO: 10) ；m5-100bp Om 铁蛋白基因(SEQID NO: 11) ；m6-100bp Om JHEH 基因(SEQ ID NO: 12) ；L1 -环 #1 (SEQ ID NO: 13) ；L2 -环#2 (SEQ ID NO: 14)。Poly-A 尾如 SEQ ID NO:245 所公开。[0031]图3描述根据本发明的某些非限制性核酸。(A)构建有三个转基因的核酸构建体#3 (SEQ ID NO: 124)的示意图。转基因P1-T6编码用于沉默Limor-SWI/SNF复合体亚单位SMARCC2 (MOR)、真核转录起始因子3亚单位1-样(TIF)和蛋白质磷酸化酶PP2A 55 kDa调节亚单位样同エ型I (PPR)基因的发夹RNA(hpRNA)。转基因P6-T4编码用于沉默Om M0R、TIF和PPR基因的hpRNA。转基因P5-T3编码具有Om M0R、TIF和PPR基因以及Li M0R、TIF和PPR基因的正义序列的mRNA。由转基因P5-T3转录的mRNA编码非功能性蛋白质并且为细胞质增强沉默信号的模板。(B)通过核酸构建体#3转录产生的hpRNA分子。定义=Pl-CaMV35S 启动子(SEQ ID NO: 27) ;P6_AtDelta TIP 启动子(SEQ ID NO: 125) ;P5_sgFMV 启动子(SEQ ID N0:31) ;T6-At 肌动蛋白 7(AtActin7)終止子(SEQ ID NO: 126) ;T4_AtDeltaTIP 终止子(SEQ ID NO:35) ;T3_N0S 终止子(SEQ ID NO:34) ；i7-100bp Li MOR(SEQID NO: 127) ；i8-100bp Li TIF 基因(SEQ ID NO: 128) ；i9-100bp Li PPR 基因(SEQ IDNO: 129) ；m7-100bp Om MOR基因(SEQ ID NO: 130) ;m8_100bp 带有 C98G置换以消除 SacI 位点的Om TIF基因(SEQ ID NO: 131 ;相当于把序列中的C472G) ;m9_81bp带有T2C置换以消除 XbaI 位点的 Om PPR 基因(SEQ ID NO: 132) ；L1 -环 #1 (SEQ ID NO: 13) ；L3 -环 #3 (SEQID NO: 139)。Poly-A 尾如 SEQ ID NO:245 所公开。
[0032]各图中相似的參考符号表示相似的元件。
【具体实施方式】
[0033]本发明涉及使用双链RNA(dsRNA)介导的技术来防治植物的昆虫感染和侵扰。本发明人已进行了天然桉树害虫桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂(Om)的转录组测序，并发掘各自的转录组来鉴定对应于Li和Om mRNA的Li和Om基因的开放阅读框。Li和OmRNA的鉴定允许设计介导Li和Om基因下调(沉默)的siRNA和dsRNA。因此，将此类siRNA和dsRNA用作生物防治剂来杀灭或抑制Li和Om进展，并抑制由Li和Om造成的植物感染。
[0034]因此，本发明描述基于核酸来防治瘿蜂害虫的方法。活性成分为核酸，例如双链RNA (dsRNA)或可促进或导致产生dsRNA的核酸，可将其用作杀虫制剂。dsRNA可在宿主植物、植物部分(plant part)、植物细胞或种子中表达以保护植物抵抗瘿蜂。dsRNA的序列对应于瘿蜂必需基因的部分或全部，并经RNA干扰(RNAi)引起昆虫靶基因的下调。作为mRNA下调的結果，dsRNA阻止昆虫靶蛋白的表达并引起昆虫的死亡、生长停滞或不育。
[0035]本发明的方法发现在期望抑制瘿蜂的活力、生长、发育或生殖，或者降低昆虫的病原性或感染性的任何【技术领域】实际应用。本发明的方法进ー步发现在期望具体下调瘿蜂昆虫中的ー种或多种靶基因表达的情况中实际应用。特别有用的实际应用包括，但不限于保护植物抵抗瘿蜂害虫侵扰(pest infestation)。
[0036]用于防止昆虫侵扰敏感细胞或植物的昆虫侵扰的siRNA对昆虫生长的防治通过使昆虫与通过退火互补链产生的dsRNA接触来起作用，所述互补链之一具有与昆虫靶基因的至少部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。dsRNA在被昆虫摄食然后由昆虫经肠吸收的植物组织中表达，从而控制生长或防止侵扰。參见Huvenne等，2010，J InsectPhysiol56:227-350
[0037]用于siRNA介导的干扰的瘿蜂靶基因包括优选非冗余的活力基因(vital gene)。活力靶基因可为当被抑制时干扰昆虫生长或存活或病原性或感染性的任何基因。此类活カ靶基因对于昆虫的活力、生长、发育或生殖是必需的，或者是參与昆虫病原性或感染性，以致特异性抑制靶基因导致致死表型或降低或停止昆虫侵扰的任何基因。此类活力靶基因的下调(其活性不能由其他相关基因补充)导致害虫幼虫的严重损伤并提供针对无柄(sessile)瘿蜂害虫的有效的害虫防治系统。靶基因可为在此所述的任何靶基因，例如害虫活力、生长、发育或生殖所必需的靶基因。靶基因的实例包括，例如參与蛋白质合成和/或新陈代谢和/或RNA合成和代谢和/或细胞进程的基因。这些靶基因的微小敲除将对许多其它基因和进程产生影响，最終导致对靶害虫的致死效应。此类下调靶基因将导致昆虫的死亡，或停止或延迟昆虫的生殖或生长。此类靶基因对于昆虫活力是至关重要的并称为活力基因。
[0038]潜在的靶基因可基干与其它昆虫物种基因的同源性来鉴定。公布的全基因组RNAi介导的基因干扰库(15，16)可用于鉴定当基于这些基因的RNAi表达并通过摄食或任何其它手段引入靶害虫有机体时使其它有机体致死的基因。因此，果蝇中鉴定为RNA1-致死的基因可用于筛选膜翅目物种的直向同源物。此类膜翅目直向同源物可进ー步用于筛选用于潜在靶标的瘿蜂物种。
[0039]Li和Om是无柄害虫。因此，Li和Om活力靶基因不能仅基于在非无柄害虫中显示为活力基因的基因来预测。无柄害虫，例如不能迁徙至可替代的进食源(feed source) 0在Li和Om的情况中，发育中的害虫禁闭于瘿瘤且在80-120天内进食相同的来源。这种发育模式导致缓慢但持续吸收dsRNA的可能性，其可具有对非无柄害虫不起作用的累积效应。因此，尽管如此，推定的靶基因，例如蠕虫中并未描述为活力的靶基因，也可为瘿蜂中的活力靶基因。
[0040]靶基因的实例包括但不限于a COP, COPI囊泡外被体复合体的a亚单位；染色质域-解旋酶-DNA-结合蛋白3(Cdh3);几丁质合成酶，毒羧酸酯酶-6同エ型I ;保幼激素环氧化物水解酶；和铁蛋白。瘿蜂靶基因的核苷酸序列包括，例如SEQ ID NOiUSEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ IDNO: 127-132,SEQ ID NO: 150-222和SEQ ID NO: 234-244中所列的序列，此类序列的互补体，以及在高严格杂交条件下与此类序列和互补体选择性杂交的序列。 [0041]用于dsRNA介导的瘿蜂靶基因下调的核苷酸序列包括，例如(i)SEQ ID NO: USEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132,SEQ ID NO: 150-222和 SEQ ID NO: 234-244 中所列的序列，和此类序列的互补体；Qi)与 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11或 SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:25 或 SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222 和SEQ ID 勵:234-244中所列的序列同ー性为至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%or99.9%的序列，和此类序列的互补体；(iii)包括SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID N0:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222和SEQ ID NO:234-244的至少17个邻接核苷酸的序列，和此类序列的互补体；和(iv)在高严格杂交条件下与此类序列和互补体选择性杂交的序列。
[0042]本文所使用的“分离的”核酸为已从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的核酸。
[0043]本文所使用的“防治害虫”是指杀死害虫，或防止害虫发育或生长，或防止害虫感染或侵扰。本文所使用的防治害虫还包括防治害虫的后代(发育的卵)。本文所使用的防治害虫还包括抑制害虫活力、生长、发育或生殖，或降低害虫的病原性或感染性。本文所使用的化合物和/或组合物可用于保持有机体健康并可治疗性、预防性或系统性地用于防治害虫或避免生长或发育或感染或侵扰。
[0044]特别地，设想的通过本文所述方法防治的害虫为植物病原性有害昆虫。因此本文所使用的“防治昆虫”包括防治昆虫后代(例如发育中的卵)。本文所使用的防治昆虫包括抑制昆虫的活力、生长、发育或生殖，或降低昆虫的病原性或感染性。如本文所使用的，防治昆虫可指抑制昆虫的生物学活性，产生ー种或多种下列属性:昆虫进食減少、昆虫活力减少、昆虫死亡、昆虫的分化和发育抑制、昆虫有性生殖能力的缺失或降低。[0045]本文所述的化合物和/或组合物可用于保持有机体健康并可治疗性、预防性或系统性地用于防治昆虫或避免昆虫生长或发育或感染或侵扰。因此，本发明可允许预先易感的有机体发育出抵抗昆虫有机体侵扰的抗性。
[0046]术语“与......的至少部分互补”是指与在超过10个核苷酸上，例如在至少15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24或更多个邻接核苷酸上的靶标的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。尽管有上述，但“与……的至少部分互补”还可包括在超过20个核苷酸的长度上，例如在至少20、21、22、23、24或更多个邻接核苷酸长度上与靶标序列的核苷酸序列的互补大于80%的互补序列[13，14]。
[0047]在某些方面，本发明提供下调昆虫中靶基因表达的方法，所述方法包括使昆虫与dsRNA接触，其中，dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与要下调的昆虫靶基因的核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列，从而使dsRNA摄入昆虫内，进而下调昆虫靶基因的表达。
[0048]术语“昆虫”包括所有类型和处于包括卵、幼虫或稚虫、蛹和成虫阶段的所有发育阶段的昆虫。
[0049]如本文所使用的，术语“植物”包括期望治疗以预防或降低昆虫生长和/或昆虫侵扰的任何植物材料。其包括尤其是全植物、秧苗、繁殖或生殖材料如种子、插条、接枝、外植体等，以及植物细胞和组织培养物。植物材料应表达或具有表达RNA分子的能力，所述RNA分子包括为害虫有机体的至少ー种靶基因的正义链的至少部分核苷酸序列的RNA互补体或表示其RNA等同物(equivalent)的至少ー种核苷酸序列，以使RNA分子在植物-害虫相互作用时被害虫吸收，所述RNA分子能够通过RNA干扰抑制靶基因或下调靶基因的表达。
[0050]术语“基因表达下调”和“基因表达抑制”可交換使用，并且是指在来自靶基因的蛋白质产物和/或mRNA产物水平上，基因表达的可測量或可观察的減少，或可检测的基因表达的完全消除。dsRNA对基因表达的下调效果可计算为与正常基因表达相比时的至少30%、40%、50%、60%，优选70%、80%，或甚至更优选90%或95%。根据靶基因的性质，昆虫细胞中基因表达的下调或抑制可通过细胞或整`个昆虫的表型分析，或者通过使用分子技术如RNA液相杂交(solution hybridization)、PCR、核酸酶保护、RNA 杂交(Northern hybridization)、反转录、利用微阵列的基因表达监控、抗体结合、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(Western blotting)、放射免疫测定(RIA)、其他免疫测定或荧光激活细胞分析(FACS)测量mRNA或蛋白质表达来证实。
[0051]必需基因的下调导致生长抑制。取决于所使用的试验，与已用对照dsRNA处理的害虫有机体相比，生长抑制可定量为大于约5%、10%，更优选约20%、25%、33%、50%、60%、75%、80%,最优选约90%、95%，或约99%。
[0052]“靶基因”可为期望受到抑制的必需的任何基因，因为其干扰昆虫的生长或病原性或感染性。例如，如果本发明的方法被用于防止昆虫生长和/或侵扰，则优选筛选对昆虫活力、生长、发育或生殖必需的靶基因，或者參与昆虫病原性或感染性的任何基因，以致靶基因的特异性抑制导致致死表型或降低或停止昆虫侵扰。
[0053]根据ー个非限制性实施方案，靶基因为当使用本发明的方法其表达下调或受抑制时昆虫死亡或者昆虫的生殖或生长停止或迟缓的此类靶基因。这种靶基因被认为是对昆虫活力所必需的，并称为必需基因。因此，本发明包括如此处所述的方法，其中所述靶基因为必需基因。
[0054] 在不受理论束缚下，靶基因为当其下调时使得昆虫的侵扰或感染、昆虫引起的损害、和/或昆虫侵扰或感染宿主有机体和/或引起此类损害的能力降低的此类靶基因。术语“侵扰”(动词，infest)和“感染”(动词，infect)或者“侵扰”(名词，infestion)和“感染”(名词，infection)通常全文可交換使用。这种靶基因被认为參与昆虫的病原性或感染性。因此，本发明延伸至此处所述的方法，其中所述靶基因參与昆虫的病原性或感染性。选择后ー种类型的靶基因的优势在干，阻断昆虫进ー步感染植物或植物部分，并且抑制形成下一代。
[0055]在防治特定昆虫在宿主细胞或宿主有机体内或上生长或侵扰的dsRNA-介导的方法中，优选dsRNA不与任何宿主基因分享，或至少不与宿主的任何必需基因分享任何显著同源性。由此而言，优选dsRNA显示小于30%、更优选小于20%、更优选小于10%和甚至更优选小于5%的与与宿主细胞的任何基因的核酸序列同一‘注。百分序列同一‘丨生应以dsRNA区的全长计算。如果宿主有机体的基因组序列数据是可获得的，则可使用标准生物信息学エ具再确认与dsRNA的序列同一性。在一个实施方案中，在dsRNA和宿主序列之间的21个邻接核苷酸上没有序列同一性，意味着由此而言，优选dsRNA的21个邻接碱基对未出现在宿主有机体的编码序列(CDS)中。在另ー实施方案中，在dsRNA的24个邻接核苷酸上与来自宿主物种的任何核苷酸序列的序列同一‘丨生小于约10%或小于约12%。
[0056]dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与要下调的靶基因的靶核苷酸序列相对应的核苷酸序列。dsRNA的另ー链能够与第一链碱基配对。
[0057]靶昆虫基因的“靶区”或“靶核苷酸序列”的表述可为基因的任何适合的区域或核苷酸序列。祀区应包括祀基因的至少17、至少18或至少19个连续核苷酸(consecutivenucleotide),更优选祀基因的至少20或至少21个核苷酸,仍更优选祀基因的至少22、23或24个核苷酸。
[0058]优选(至少部分)dsRNA将与昆虫靶基因的靶区分享100%的序列同一性。然而，将理解，在双链区全长上的100%序列同一性对于功能性RNA抑制不是必需的。相对于靶基因具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现对RNA抑制是有效的。
[0059]术语“对应干”或“与……互补”在此可交換使用，并且当这些术语用于指dsRNA与革巴基因的祀区之间的序列对应性(sequence correspondence)时，它们可以相应地解读为，即不绝对要求100%的序列同一性。然而，dsRNA与靶区之间的百分序列同一性通常为至少80%或85%同一，优选至少90%、95%、96%，或更优选至少97%、98%，并仍更优选至少99%。当两条核酸链的至少85%的碱基配对时，这两条核酸链“基本上互补”。
[0060]本文所使用的术语“互补”涉及DNA-DNA互补、RNA-RNA互补和DNA-RNA互补的全部。在同此类推中，术语“RNA等同物”基本上是指在DNA序列中，碱基“T”可由核糖核酸中通常存在的相应碱基“U”所代替。
[0061]尽管dsRNA包含对应于靶基因的靶区的序列，但对应于靶区序列的整个dsRNA不是必要的。例如，dsRNA可包含位于特异性靶序列侧翼的短的非靶区，条件是此类序列在RNA抑制中不对dsRNA的性能影响到实质程度(material extent)。
[0062]dsRNA可包含一种或多种置换碱基以便优化在RNAi中的性能。如何依次改变dsRNA的各碱基并(例如在适合的体外试验体系中)测试所得dsRNA的活性从而优化所的dsRNA的性能，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
[0063]dsRNA可进ー步包含DNA碱基、非天然碱基或糖-磷酸骨架的非天然骨架连接或修饰，从而例如增强保存期间的稳定性或增强被核酸酶降解的抗性。
[0064]约21bp的干扰RNA (siRNA)对于基因沉默的是有用的。优选将dsRNA的长度增加到至少约SO-1OObp可提高dsRNA被害虫有机体吸收的效率。此类较长的片段可在基因沉默中更加有效，可能是由于这些长dsRNA被无脊椎动物更有效地吸收。
[0065]由具有29bp莖区(stem)和2_nt3’突出端的27-mer平端的或短发夹(sh)RNA的RNA双链体(duplex)也可用作siRNA。因此，基于上述鉴定的靶标且为具有29bp茎区和2-nt3’突出端的27-mer平端或短发夹(sh)RNA的靶标的分子也包括在本发明的范围内。
[0066]因此，在一个实施方案中，dsRNA片段(或区域)本身将优选为至少17bp长，优选18或19bp长,更优选至少20bp,更优选至少21bp、或至少22b、或至少23bp、或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp长。“双链RNA片段”或“双链RNA区”的表述是指对应于靶基因(的部分)的dsRNA的小实体(entity)。
[0067]更普遍地，双链RNA优选在约17_1500bp之间、甚至更优选在约80_1000bp之间，并最优选在约17-27bp之间或在约80-250bp之间；例如约17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、lOObp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、lOObp、llOObp、1200bp、1300bp、1400bp 或1500bp的双链RNA区。
[0068]dsRNA长度的上限可取决于i) dsRNA被昆虫吸收的要求和ii) dsRNA在细胞中被加エ成指导RNAi的片段的要求 。所选长度还可受到RNA合成方法和RNA运送至细胞的模式的影响。优选在本发明的方法中要使用的dsRNA将为小于10，OOObp长，更优选1000bp以下、更优选500bp以下、更优选300bp以下、更优选IOObp以下。对于任何给定的靶基因和昆虫，为了有效抑制的dsRNA的最佳长度可通过实验确定。
[0069]dsRNA可完全或部分双链化。部分dsRNA可在双链部分的一端或两端包含短单链突出端，条件是RNA仍能够被昆虫吸收并指导RNAi。dsRNA还可包含内部非互补区。
[0070]本发明的方法包括向同一昆虫同时或连续供给两种或更多种不同的dsRNA或RNA构建体，以便实现多种靶基因的下调或抑制，或者实现单个靶基因更强有力的抑制。
[0071]可选地，通过提供中多种靶序列的ー种dsRNA来命中多种靶标，通过存在对应于靶基因的双链RNA片段的超过ー个拷贝来更有效地抑制单个靶标。因此，在某些方面，dsRNA构建体包括多个dsRNA区，每ー个dsRNA区的至少一条链包括与昆虫靶基因的靶核苷酸序列的至少部分互补的核苷酸序列。RNA构建体中的dsRNA区可与相同或不同的靶基因互补和/或dsRNA区可与来自相同或不同昆虫物种的靶标互补。
[0072]术语“命中(hit、hits和hitting) ”是表示至少一条dsRNA链与祀基因或核苷酸序列互补并且其本身可结合至靶基因或核苷酸序列的可选词汇。
[0073]在一个实施方案中，双链RNA区包括与靶基因互补的核苷酸序列的多个拷贝。可选地，dsRNA命中相同靶基因的超过ー个靶序列。本发明因而包括包含与昆虫靶标的核苷酸序列的至少部分互补的所述核苷酸序列的至少两个拷贝的分离的双链RNA构建体。
[0074]如本文所述的术语“多个(种)”是指至少两个(种)、至少三个(种)、至少四个(种)、至少五个(种)、至少六个(种)等。[0075]“其它靶基因”或“至少ー种其它靶基因”的表述是指例如第二种、第三种或第四种
等革El基因。
[0076]开发命中超过ー种上述靶标的dsRNA或者与上述靶标不同的不同dsRNA的组合并用于本发明的方法。
[0077]双链RNA中的dsRNA区(或片段)可如下组合:a)当靶向单个靶基因的多个dsRNA区组合时，它们可以在RNA构建体中以原始顺序组合(即，其中所述区域出现在靶基因中的顺序)山)可选地，片段的原始顺序可忽略，以便它们以任何顺序随机或有意地颠倒(scrambled)和组合为双链RNA构建体中；c)可选地,在dsRNA构建体中一个单独片段可重复多次，例如1-10次，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或d) dsRNA区(靶向单个或不同革巴基因)可以以正义或反义方向組合。
[0078]靶向单个或不同弱基因(weak gene)的多个dsRNA区可组合来获得更强的RNAi效果。“昆虫特异性”基因或序列，例如瘿蜂特异性、特别是Li或Om特异性基因和序列，包括当可通过生物信息学同源性检索，例如通过BLAST检索来确定时，在非昆虫有机体中不具有实质上同源的对应物(counterpart)的基因。特异性靶基因的选择产生种特异性RNAi效果，而对非IE标有机体(non-target organism)没有效果或没有实质(不利)效果。“保守基因”包括在靶标有机体和非靶标有机体之间保守(在氨基酸水平上)的基因。为了减少对非靶标物种可能的作用，分析此类有效但保守的基因，并选择来自这些保守基因的可变区的序列被RNA构建体中的dsRNA区靶向。在核酸序列水平上评价保守性。此类可变区因而至少包括保守靶基因的在核酸序列水平上的保守部分。根据本发明的RNA构建体从不同的生物学途径靶向多基因，导 致广泛的细胞RNAi效果和更佳有效的昆虫防治。在某些实施方案中，dsRNA由例如与蜜蜂直向同源物，例如但不限于SEQ ID N0:39_44和SEQ IDNO: 134-136中所列的本文所公开的Li和Om序列的蜜蜂直向同源的序列的同一性为80%以下的Li和Om转录组的序列构建。
[0079]在某些方面，dsRNA构建体构建有影响不同类型细胞功能的基因序列。此类细胞功能类型的实例包括，但不限干，(i)蛋白质合成和代谢，(ii)RNA合成和代谢，和(iii)细胞进程。在某些实施方案中，dsRNA构建体包括来自前述各权利要求即三种类型的序列。在某些实施方案中，dsRNA构建体包括来自前述类型中的两种类型，如蛋白质合成和代谢以及RNA合成和代谢；蛋白质合成和细胞进程；或RNA合成和代谢以及细胞进程的序列。
[0080]dsRNA区包括与本文所记载的任ー种靶基因的核苷酸序列的至少部分或一部分互补的至少一条链。然而，假如双链RNA区之一包括与本文所记载的任ー种靶基因的核苷酸序列的一部分互补的至少一条链，则其它双链RNA区可包括与任何其它昆虫靶基因(包括已知的靶基因)的一部分互补的至少一条链。
[0081 ] 在某些构建体中，dsRNA可包括附加序列和任选的连接子。附加序列可包括，例如(i)促进dsRNA构建体大規模生产的序列；(ii)影响dsRNA稳定性的提高或降低的序列；
(iii)允许蛋白质或其他分子结合以促进RNA构建体被昆虫吸收的序列；(iv)为结合昆虫表面上或胞质中的受体或分子以促进被昆虫吸收、内吞和/或胞转的适配体(aptamer)的序列；或(V)催化dsRNA区加工的附加序列。在一个实施方案中，连接子为附有条件地自剪切RNA序列，优选pH敏感性连接子或疏水敏感性连接子。
[0082]dsRNA构建体的多个dsRNA区可直接连接或者通过ー个或多个连接子连接。连接子可存在于RNA构建体中的位点，将dsRNA区与另ー个感兴趣区分隔。dsRNA构建体的多个dsRNA区可在没有连接子的情况下连接。
[0083]当连接子存在时，其可用于断开害虫有机体中的较小的dsRNA区。有利地，在该情况下，连接子序列可在特定情况下促使长dsRNA分成较小的dsRNA区，导致在这些情况下分离的dsRNA区的释放，并由这些较小的dsRNA区产生更有效的基因沉默。适合的附有条件的自剪切连接子的实例为在高PH条件下自剪切的RNA序列。此类RNA序列的适合的实例由 Borda 等人记载(Nucleic Acids Res.2003Mayl5 ;31 (10): 2595-600)，将该文献引入于此以作參考。该序列源自锤头状核酶HH16的催化中心。
[0084]连接子还可定位于dsRNA构建体的位点，将dsRNA区与另一例如感兴趣的附加序列分隔，所述感兴趣的附加序列优选为RNA构建体提供某些附加功能。
[0085]dsRNA构建体可包括适配体以促进dsRNA被昆虫吸收。将适配体设计结合被昆虫吸收的物质。此类物质可来自昆虫或植物来源。适配体的ー个具体实例为结合跨膜蛋白，例如昆虫的跨膜蛋白的适配体。可选地，适配体可结合被昆虫吸收的(植物)代谢物或营养素。
[0086]连接子可在内涵体中进行自剪切。当本发明的构建体经胞吞或胞转被昆虫吸收，并且因而在昆虫物种的内涵体中被区室化时这可是有利的。内涵体可具有低PH环境，导致连接子的剪切。
[0087]当疏水条件下自剪切的连接子用于经细胞壁运输从ー个细胞转移至另ー个细胞时，例如当穿过有害昆虫有机体的细胞壁时，其在dsRNA构建体中特别有用。
[0088]内含子可用作连接子。本文所使用的“内含子”可为信使RNA的任何非编码RNA序列。
·[0089]还可将范围在约I碱基对至约10，000碱基对的非互补性RNA序列用作连接子。
[0090]在不希望受任何特定理论或机理的束缚下，认为长dsRNA被昆虫从它们的附近环境中吸收。dsRNA被吸收进入肠并转移至肠上皮细胞，然后在细胞中通过内源核酸内切酶的作用加工成短dsRNA，称为小干扰RNA (siRNA)。所得siRNA然后通过形成称为RISC或RNA干扰沉默复合体的多组分RNase复合体来介导RNAi。
[0091]为了实现昆虫细胞内靶基因的下调，添加至细胞壁外部的dsRNA可为可吸收进入细胞，接着在细胞内加工成siRNA，进而介导RNAi的任何dsRNA或dsRNA构建体，或者添加至细胞外部本身可为可吸收进入细胞且从而指导RNAi的siRNA的RNA。
[0092]siRNA通常为长度在19-25碱基对或20_24碱基对范围内的短的dsRNA。在优选实施方案中，可使用对应于要下调的靶基因，具有19、20、21、22、23、24或25个碱基对、特别是21或22个碱基对的siRNA。然而，本发明不意欲限制此类siRNA的用途。
[0093]siRNA可包括在双链部分的侧翼的一端或两端的单链突出端。siRNA可包含3’突出核苷酸，优选两个3’突出胸苷(dTdT)或尿苷(UU)，如果包括在dsRNA双链部分中的序列的紧接上游靶基因序列为AA，则3’TT或UU突出端可包括在siRNA中。这使得siRNA中的TT或UU突出端与靶基因杂交。尽管3’ TT或UU突出端还可位于siRNA的另一端，但是包括在siRNA双链部分中序列的靶序列的下游序列不必具有AA。由此而言，为RNA/DNA嵌合体的siRNA也是预期的。这些嵌合体包括，例如如上所述包括具有DNA碱基3’突出端(如，dTdT)的dsRNA以及为其中ー个或多个RNA碱基或核糖核苷酸、甚至整个链上的所有核糖核苷酸被DNA碱基或脱氧核糖核苷酸代替的多聚核苷酸的dsRNA的siRNA。
[0094]dsRNA可由两个单独的(正义和反义)RNA链通过(非共价)碱基配对退火在一起而形成。可选地，dsRNA可具有折回茎-环或发夹结构，其中dsRNA的两个退火链共价连接。在该实施方案中，dsRNA的正义和反义链由部分自补的单个多核苷酸分子的不同区域形成。如果dsRNA通过在体内例如在宿主细胞或有机体中表达,或者通过体外转录来合成，则具有该结构的RNA是便利的。连接两个RNA链的“环”的确切性质和序列，除了不应损害分子的双链部分介导RNAi的能力以外，对本发明通常是不重要的。用于RNAi的“发夹”或“茎-环” RNA的特征通常是本领域已知的(例如參见WO 99/53050，将其内容引入于此以作參考)。在本发明的其他实施方案中，环结构可包括如上所述的连接子序列或附加序列。
[0095]在某些方面，本文公开的Li和Om序列及此类序列的互补体还可通过使用本领域内已知的方法表达反义RNA或过表达正义RNA来用于抑制Li或Om核酸的表达。所述已知方法，參见例如 Frizzi 等，Plant Biotech J, (2010) 8:655-677 ;Brodersen 等，Trends inGenetics, (2008)22:268-280 ;和美国专利5，759，829号。使用本文所述的表达元件、载体和方法，针对Li和Om靶基因的反义RNA或正义RNA在桉树植物中表达。在被Om或Li害虫摄食后，反义或正义RNA抑制靶基因的表达，从而防治害虫侵扰。 [0096]用于设计dsRNA构建体的靶核苷酸序列优选至少17个，优选至少18、19、20或21个，更优选至少22、23或24个核苷酸长。优选的靶核苷酸序列的非限制性实例示于实施例中。
[0097]靶序列可包括与本文所述序列同源的序列。靶基因的同源物可使用本领域普通技术人员公知的方法来发现。优选的同源物为包括与本文所公开的序列的同一性为至少约85%或87.5%、仍更优选至少约90%、仍更优选至少约95%和最优选至少约99%或99.9%的序列的基因，或其互补体。用于确定序列同一性的方法在本领域是常规的，并包括使用 Blast 软件和 EMBOSS 软件(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite(2000), Rice, P.Longden,1.和 Bleasby, A.Trends in Geneticsl6, (6)pp276_277)。本文所使用的术语“同一性”是指核苷酸水平上序列之间的关系。“％同一性”的表述通过在比较窗口上比较例如两个或更多个最佳比对序列来确定，其中比较窗口中的序列部分可包括与序列最佳比对用參考序列相比的插入或缺失。參考序列不包括插入或缺失。參考窗ロ选自至少10个邻接核苷酸至约50、约100或至约150个核苷酸之间，优选选自约50和150个核苷酸之间。然后通过确定窗口中序列之间相同的核苷酸数，将相同的核苷酸数除以窗ロ中的核苷酸数，再乘以100来计算“百分率同一性”。
[0098]术语“选择性杂交”包括涉及在严格杂交条件下的核酸序列与特定核酸靶序列的杂交使得可检测程度大于其与非靶核苷酸序列的杂交(例如相对于背景至少2倍)，并基本上排除非靶核酸。选择性杂交序列典型地彼此具有约至少40%的序列同一性，优选60-90%的序列同一‘丨生，和最优选100%的序列同一‘注(即，互补)。
[0099]术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括涉及在该条件下探针将与其靶序列杂交使得可检测程度大于其他序列(例如，相对于背景至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖的并且由不同环境而不同。通过控制杂交的严格性和/或洗涤条件，可识别可与探针达100%互补的靶序列(同源探測)。可选地，可调整严格条件来允许序列中的某些错配从而检测较低程度的相似性(异源探測)。最佳地，探针长度为约500个核苷酸，但长度可从小于500个核苷酸至等于靶序列全长大幅变化。
[0100]典型地，严格条件将是其中在pH7.0至8.3和温度为至少约30 (短探针，例如10至50个核苷酸)和至少约60°C (长探针，例如大于50个核苷酸)下盐浓度小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)的那些。严格条件还可添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’ s来实现。示例性低严格条件包括用在37°C下的30至35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交并在50至55°C下的IX至2X SSC (20XSSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性温和严格条件包括在37°C下的40至45%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS中杂交并在55至60°C下的0.5X至IX SSC中洗涤。示例性高严格条件包括在37°C下的50%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS中杂交并在60至65°C的0.1X SSC中洗涤。
[0101]特异性典型地起到后杂交洗涤的作用，关键因素为最终洗涤液的离子强度和温度。对于 DNA-DNA 杂交，！?可从 Meinkoth 和 Wahl, (1984)Anal.Biochem., 138:267-84 等式估算:Tm=81.5°C +16.6 (log M) +0.41 (%GC) -0.61 (%form)-500/L ;其中 M 为单价阳离子的摩尔浓度，%GC为鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，%form为甲酰胺在杂交液中的百分比，和L为碱基对中杂交体的长度。、为(在确定的离子强度和pH下)其中50%的互补靶序列与优选匹配的探针杂交的温度。Tm相对于每1%的错配降低约1°C;因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件来与期望同一性的序列杂交。例如，如果搜寻到>90%同一性的序列，Tm可降低10°C。通常，严格条件选择在确定的离子强度和pH下比特异序列及其互补体的热熔点(Tm)低约5°C。然而，非常严格条件可在比热熔点(Tm)低1、2、3或4°C下用于杂交和/或洗涤；温和严格条件可在比热熔点(Tm)低6、7、8、9或10°C下用于杂交和/或洗涤；低严格条件可在比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下用于杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组成以及期望的！，普通技术人员将理解杂交和/或洗涤液的严格性的变化是固有描述。如果期望的错配程度产生低于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，则优选增加SSC浓度以便可 使用更高的温度。
[0102]对核酸杂交的广义指导见Ti jssen, Laboratory Techniques in Bihemistry andMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2 章，“Overview of principles oi hybridization and tne strategy of nucleic acid probeassays”，Elsevier, N.Y.(1993);和 Current Protols in Molecular Biology,第 2 章，Ausubel 等，eds, Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)。除非另有说明，在本申请中，高严格性定义为在65°C下的4X SSC、5X Denhardt’ s (500ml水中5g聚蔗糖、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.lmg/ml煮沸的鲑鱼精子DNA和25mM磷酸盐钠中杂交和在65°C下的0.1X SSC、0.1%SDS中洗涤。
[0103]dsRNA可通过宿主细胞或宿主有机体表达(例如在其中转录)。宿主细胞或有机体可以是或可以不是对昆虫侵扰敏感或易受其侵害的宿主细胞或有机体。如果宿主细胞或有机体为对昆虫侵扰敏感或易受其侵害的宿主细胞或有机体，作为控制昆虫在宿主有机体内或上生长和/或防止或减少宿主有机体的昆虫侵扰的机理，可使用RNAi介导的ー种或多种靶基因在昆虫中的基因沉默。因此，dsRNA在宿主有机体的细胞内的表达可因此赋予对特定昆虫或对ー类昆虫的抗性。假如dsRNA命中超过ー个昆虫靶基因，dsRNA在宿主有机体的细胞中的表达可赋予对超过ー个昆虫或超过ー类昆虫的抗性。[0104]在优选的实施方案中，宿主有机体为植物，昆虫为植物病原昆虫。在该实施方案中，通过在受植物昆虫侵扰或对昆虫侵扰敏感或被植物昆虫摄食的植物、植物组织或植物细胞中表达dsRNA而使昆虫与dsRNA相接触。优选的植物宿主有机体为桉树。桉树的实例包括，但不限于以下物种:葡萄桉(E.botryoides)、苹果桉(E.bridge si ana)、赤按(E.camaldulensis)、灰按(E.cinerea)、蓝按(E.globule)、巨按(E.grandis)、西达按(E.gunii)、尼克尔按(E.nicholii)、圆叶按(E.pulverulenta)、大叶按(E.robusta)、野按(E.rudis)、柳叶按(E.saligna)、细叶按(E.Tereticornis)、尾叶按(E.Urophilla)、多枝桉(E.viminalis)和前述物种的任一种特别是巨桉和尾叶桉的杂交种。优选的植物病原昆虫为瘿蜂，例如Li或Om。
[0105]术语“植物”包括期望处理以防止或減少昆虫生长和/或昆虫侵扰的任何植物材料。其包括尤其是全植物、秧苗、繁殖或生殖材料如种子、插条、接枝、外植体等，以及植物细胞和组织培养物。植物材料应当表达对应于昆虫的ー种或多种靶基因的dsRNA或具备表达对应于昆虫的一种或多种祀基因的dsRNA的能力。
[0106]在某些方面，本发明提供表达或能够表达至少ー种dsRNA的植物，优选转基因植物、或(转基因)植物用繁殖或生殖材料、或植物细胞培养物，其中dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与昆虫的靶基因的至少部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，以便使dsRNA在植物-昆虫相互作用时被昆虫吸收，所述双链RNA能够通过RNA干扰抑制靶基因或下调靶基因的表达。靶基因可为本文所述靶基因的任ー种，例如昆虫活力、生长、发育或生殖所必须的靶基因。
[0107]植物可以以在一种或多种细胞、细胞类型或组织中活跃表达(转录)dsRNA的形式提供。可选地，植物可为“能够表达”的，意指其利用编码期望的dsRNA的转基因转化，但当提供该植物吋(并且以其 中提供植物的形式)转基因在该植物中不活跃。包括编码dsRNA或dsRNA构建体的核苷酸序列的重组DNA构建体可因而可操作地连接至至少ー个调控序列。优选地，调控序列选自包括如下所述的组成型启动子或组织特异性启动子的组。
[0108]靶基因可为本文所述的任ー种靶基因。优选地，调控元件为在植物细胞中活跃的调控元件。更优选地，调控元件源自植物。术语“调控序列”将在广义上理解，井指能够影响可操作地连接的序列表达的调控核酸。
[0109]前述术语包括启动子和激活或增强核酸的转录的所谓的激活子或增强子的核酸或合成融合分子或其衍生物。本文所使用的术语“可操作地连接”是指启动子序列与目标基因之间的功能性连接，以使启动子序列能够起始目标基因的转录。
[0110]举例来说，编码dsRNA的转基因核苷酸序列可位于诱导性或者生长或发育阶段-持异性启动子控制下，通过添加诱导型启动子的诱导物或当达到生长或发育特定阶段时所述启动子允许dsRNA转录的开启。
[0111]可选地，编码dsRNA的转基因位于强组成型启动子如选自包括CaMV35S启动子、CaMV35S双启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸羧化酶(rubisco)启动子、G0S2启动子、玄參花叶病毒(Figwort mosaic virus, FMV) 34S启动子、木薯叶脉(cassayavein)花叶病毒(CsVMV)启动子的组的任一种的调控下(Verdaguer B.等，Plant Mol.Biol.199837(6):1055-67)。
[0112]可选地，编码dsRNA的转基因位于组织特异性启动子如选自包括编码PsMTA类型III几丁质酶基因的根特异性启动子，光合组织特异性启动子如cabl和cab2、rbcS、gapA、gapB和ST-LSl蛋白的启动子，JAS启动子，查耳酮合成酶启动子和来自草莓的RJ39的启动子的组的任ー种的调控下。
[0113]编码dsRNA的转基因还可位于昆虫诱导型启动子，例如马铃薯蛋白酶抑制剂II (PinII)启动子(Duan X 等，Nat.Biotechnol.1996，14 (4): 494-8));或伤害诱导型启动子，例如茉莉酸(jasmonate)和乙烯诱导型启动子、F1DFl.2启动子(Manners J M等，Plant Mol.Biol.1998, 38 (6): 1071-80)的调控下；或者防御相关的启动子，例如水杨酸诱导型启动子和植物病原相关蛋白(PR蛋白)启动子(PRl启动子(Cornelissen B J等，Nucleic Acids Res.1987，15(17):6799-811 ；C0MT 启动子(Toquin V 等，Plant Mol.Biol.2003，52(3):495-509)下。
[0114]当使用本文所述的方法用于开发抗昆虫的转基因植物吋，将编码dsRNA的核酸位于组织特异性启动子控制下可以是有益的。为了改善dsRNA从植物细胞向昆虫的转移，植物可优选在首先被植物害虫接近或破坏的植物部分表达。在植物病原性昆虫的情况下，优选的表达dsRNA的组织为叶、茎、根和种子。因此，在本文所公开的方法中，可使用植物组织-优选的启动子，例如叶特异性启动子、茎特异性启动子、韧皮部特异性启动子、木质部特异性启动子、根特异性启动子或种子特异性启动子(蔗糖转运蛋白基因(sucrosetransporter gene) AtSUC 启动子(Baud S 等，Plant J.2005，43 (6):824-36)、小麦高分子量麦谷蛋白基因启动子(Robert L S 等，Plant Cell.1989，I (6):569-78.))。
[0115]根特异性启动子的适合的实例为PsMTA(Fordam-Skelton，A.P.，等，1997PlantMolecular Biology34:659_668.)和类型III几丁质酶启动子。同样被光活化的叶和茎特异性或光合组织特异性启动子的实例为来自甜菜的两种叶绿素结合蛋白(cabl和cab2)的启动子(Stahl D.J.,等，2004BMC Biotechnology20044:31)、由;rbcS 编码的核酮糖-二憐酸羧化酶(Rubisco) (Nomura M.等,2000Plant Mol.Biol.44:99-106)、叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(gapA)和B(gapB)亚单位(Conley T.R.等? 1994Mol.Cell.Biol.19:2525-33 ；Kwon H.B.等.1994Plant Physiol.105:357-67)、编码叶和茎特异性蛋白的马铃薯(Solanum tuberosum)基因的启动子(Zaidi M.A.等，2005TransgenicRes.14:289-98)、茎调控的防御诱导性基因，如JAS启动子(专利公布号20050034192/US-A1)。花特异性启动子的实例为例如，查耳酮合成酶启动子(Faktor 0.等.1996PlantMol.Biol.32:849)，果实特异性启动子的实例为例如来自草莓的RJ39 (W0 9831812)。
[0116]使用用于表达dsRNA的其他启动子，其包括但不限于来自RNA Poll.RNA PoIURNAPolII1、I7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子。这些启动子典型地用于体外生产dsRNA，之后将dsRNA诱导入抗杀虫剂，例如诱导入抗杀虫液、喷雾剂或粉剂中。
[0117]本文所描述的dsRNA或RNA构建体可通过以下步骤产生:(i)使分离的核酸或重组DNA构建体与无细胞组分接触；或(ii)在允许核酸或重组DNA构建体转录的条件下将分离的核酸或重组DNA构建体导入(例如，通过转化、转染或注射)细胞中，从而产生dsRNA或RNA构建体。
[0118]任选地，还可将一种或多种转录終止序列引入重组构建体中。术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其传导初级转录本的3’加工和多聚腺苷酰化以及转录終止的信号。可将额外的调控元件，例如转录或翻译增强子引入表达构建体中。[0119]重组构建体可进一步包括特定的细胞类型中保持和/或复制所需的复制起点。一个实例为当需要表达构建体作为细胞中的附加型遗传元件(例如，质粒或柯斯质粒分子) 保持于细菌细胞中时，优选的复制起点包括，但不限于fl-ori和colElori。
[0120]重组构建体可任选地包括选择标记基因。如本文所述，术语“选择标记基因”包括任一种基因，其在细胞上赋予表型，其中该基因的表达促进转染或转化有本发明的表达构建体的细胞的识别和/或选择。适合的选择标记的实例包括抗氨苄青霉素(Amp1O、四环素 (Tc1)、卡那霉素(Kan1)、膦丝菌素(phosphinothricin)和氯霉素(CAT)基因的抗性基因。 其它适合的标记基因提供代谢特性，例如manA。还可使用可视化标记基因，并且包括例如
3-葡糖醛酸酶(GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
[0121]已稳定转化有编码dsRNA的转基因的植物可提供为不活跃表达dsRNA但具有活跃表达dsRNA的能力的种子、生殖材料、繁殖材料或细胞培养材料。植物可以以其中在一种或多种细胞、细胞类型或组织中活跃表达(转录)RNA分子的形式提供。可选地，植物可为“能够表达”的，意指利用编码期望的RNA分子的转基因转化，但当提供该植物时(并且以其中提供植物的形式)转基因在该植物中不活跃。许多载体可用于该目的，并且适合的载体的选择将主要取决于插入载体的核酸大小和要转化有载体的特定宿主细胞。
[0122]出于RNAi的目的在植物中表达外源dsRNA的通用技术是本领域已知的(参见 Baulcombe D, 2004, Nature.431 (7006):356-63.RNA silencing in plants,将其内容共引入于此以作参考)。更特别地，出于下调植物害虫如线虫或昆虫中的基因表达的目的而在植物中表达dsRNA的方法也是本领域已知的。类似的方法可以以类似的方式应用，从而在植物中表达dsRNA用于下调植物病原昆虫中靶基因的表达。为了实现该效果，对于植物来说， 必须仅在要与昆虫接触的植物的部分表达(转录)dsRNA，由此dsRNA可被昆虫吸收。取决于昆虫的性质及其与宿主植物的关系，dsRNA的表达可发生在昆虫在其生命周期期间存在的植物细胞或组织内，或者RNA可分泌至细胞之间，例如在昆虫的生命周期期间被昆虫占据的质外体。此外，dsRNA可位于植物细胞如细胞溶胶中，或者位于植物细胞细胞器如叶绿体、线粒体、液泡或内质网中。
[0123]发育期间，瘿蜂幼虫由于摄食(例如摄食质外体)或细胞溶解而暴露于细胞外环境以及细胞内的内容物。因此，瘿蜂幼虫可暴露于存在于瘿瘤细胞中的dsRNA或由瘿瘤内部或周围的细胞分泌的dsRNA。
[0124]可选地，dsR NA可由植物细胞分泌,并由植物分泌至植物外部。由此,dsRNA可在植物表面上形成保护层。
[0125]在另一方面，本发明还提供用于预防或保护植物免受害虫侵扰的方法和组合物的组合。例如，一种手段提供使用植物转基因方法与使用dsRNA分子表达的方法和使用此类 Bt杀虫蛋白表达的方法相结合。
[0126]在进一步的实施方案中，本发明涉及用于控制昆虫生长和/或防止或减少昆虫侵扰的组合物，其至少包括包含至少一种dsRNA的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其中所述dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与昆虫靶基因的至少部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。任选地，组合物进一步包括至少一种适合的载体、赋形剂或稀释剂。靶基因可为本文所述的任何靶基因。优选地，昆虫靶基因对于昆虫的活力、生长、发育或生殖是必须的。[0127]其中术语“一种”在“一种靶基因”的语境中使用，这是指“至少一种”靶基因。对于“一种”靶有机体是指“至少一种”靶有机体，和“一种” RNA分子或宿主细胞是指“至少一种” RNA分子或宿主细胞同样适用。
[0128]根据一个实施方案，本发明的方法依赖于存在于昆虫外部的dsRNA被昆虫吸收 (如，进食)，并且不需要在昆虫细胞内表达dsRNA。此外，本发明还包括如上所述的其中昆虫与包括dsRNA的组合物接触的方法。瘿蜂幼虫典型地不在瘿瘤外部进食，因而优选经转基因植物材料将瘿蜂幼虫暴露于dsRNA。
[0129]本发明进一步提供用于下调靶有机体(其能够摄食植物、植物部分、植物细胞或种子)中至少一种靶基因表达的方法，所述方法包括向靶有机体喂养植物、植物部分、植物细胞或种子，所述植物、植物部分、植物细胞或种子表达dsRNA。
[0130]在更优选的方面，本发明提供用于下调靶有机体(其能够摄取宿主细胞或其提取物)中至少一种靶基因的方法，所述方法包括向靶有机体喂养宿主植物、植物部分、植物细胞或种子，所述宿主植物、植物部分、植物细胞或种子表达dsRNA，所述dsRNA包括与至少一种靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物互补或表示至少一种靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物的核苷酸序列，从而宿主植物、植物部分、植物细胞或种子被靶有机体的摄食引起和/或导致至少一种靶基因的表达下调。
[0131]本发明提供如本文所定义的植物、植物部分、植物细胞或种子用于下调昆虫靶基因表达的用途。在更详细的方面，本发明提供如本文所定义的宿主细胞和/或包括核苷酸序列的RNA分子用于下调靶基因表达的用途，所述核苷酸序列包括来自靶有机体的靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物的RNA互补体或表示来自靶有机体的靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物，所述包括核苷酸序列的RNA分子通过，例如在商品制造时，在植物、植物部分、植物细胞或种子中转录核酸分子来生产。
[0132]根据一个实施方案，本发明的方法依赖于遗传改良生物(GMO)法，其中dsRNA通过受昆虫侵扰或对昆虫侵扰敏感的细胞或有机体表达。优选地，所述细胞为植物细胞或所述有机体为植物。
[0133]对于siRNA介导的昆虫基因的下调，dsRNA直接或间接地引入和/或表达于昆虫细胞中。dsRNA可人工添加至昆虫食物或通过转基因食物来源如细菌和植物来生产[2，8]。 包含昆虫基因特异性序列的反向重复RNA被转基因植物转录，可将其加工成dsRNA并稍后加工成siRNA(为沉`默通路中的第一产物的小干扰RNA)。消化此类转基因植物的昆虫受植物合成的dsRNA和siRNA的影响[5]。该昆虫防治法可用于保护植物有效对抗特定的害虫 [2，8]。然而，不需要在植物材料中将dsRNA加工成siRNA。dsRNA可被有害昆虫摄食并在昆虫细胞内首次加工成siRNA。
[0134]用于向植物引入外源基因的许多方法是已知的，并可用于将NT多核苷酸插入植物宿主中，包括生物学和物理植物转化法。例如，参见Miki等,“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants, ”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds.，CRC Press,Inc.，Boca Raton, pp.67-88 (1993)。所选方法根据宿主植物而变化，并包括化学转染法如磷酸钙、微生物介导的基因转移如农杆菌属(Horsch等，Science 227:1229-31 (1985))、电穿孔、显微注射和生物射弹轰击(biolistic bombardment)。[0135]用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知且可获得的。参见例如 Gruber 等，“Vectors for Plant Transformation，”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，supra，pp.89—119。
[0136]分离的多核苷酸或多肽可通过一种或多种典型用于直接递送进入细胞的技术引入植物中。此类方法可取决于基因修饰所靶向的有机体、细胞、植物或植物细胞的类型，即单子叶植物或双子叶植物而变化。适合的转化植物细胞的方法包括显微注射(Crossway， 等，(1986)Biotechniques4:320-334 ；和 U.S.Pat.N0.6，300，543)、电穿孔 (Riggs,等， (1986) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606、直接基因转移(Paszkowski 等，(1984) EMBO J.3:2717-2722)和弹道粒子加速(参见，例如Sanford，等，美国专利号4，945，050 ; WO 91/10725 ；和 McCabe,等，(1988)Biotechnology6:923-926)。还参见，Tomes 等， “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment，，.第 197-213 页，Plant Cell,Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, eds.0.L Gamborg&G.C.Phillips.Springer-Verlag Berlin Heidelberg N.Y.，1995 ;美国专利号 5，736，369 (分生组织)；Weissinger,等，(1988) Ann.Rev.Genet.22:421-477 ；Sanford, 等，(1987) Particulate Science and Technology5:27-37 (洋葱)；Christou,等，(1988) Plant Physiol.87:671-674(大豆)；Datta，等，(1990) Biotechnology8:736-740 (水稻);Klein，等，(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309 (玉米)；Klein，等， (1988)Biotechnology6:559-563(玉米)；W091/10725(玉米)；Klein，等，(1988) Plant Physiol.91:440-444 (玉米)；Fromm，等，(1990)Biotechnology8:833_839 ; 和 Gordon-Kamm，等，(1990)Plant Cel12:603-618 (玉米)；Hooydaas_Van Slogteren&Hooykaas (1984)Nature (英国)311:763-764 ;Bytebierm，等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349 (Liliaceae) ；De Wet,等，(1985) In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.G.P.Chapman,等，pp.197-209.Longman，N.Y.(花粉)；Kaeppler，等，(1990)Plant Cell Reports9:415-418 ；和 Kaeppler，等，(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；美国专利号5，693，512 (声处理)； Dj Halluinj 等，(1992)Plant Cell4:1495-1505 (电穿孔)；Li,等，(1993)Plant Cell Reportsl2:250-255 ；和 Christou and Ford, (1995)Annals of Botany75:407-413 (水稻)；0sjoda，等，(1996)Nature Biotech.14:745-750 ;农杆菌介导的玉米转化(美国专利号 5，981，840);碳化硅晶须法(Frame,等，(1994)Plant J.6:941-948);激光法(Guoj 等，(1995)Physiologia Plantarum93:19-24);声处理法(Baoj 等，(1997) Ultrasound in Medicine&Biology23:953-959 ；Finer and Finer, (2000)Lett Appl Microbiol.30:406-10 ；Amoah,等，(2001) J Exp Bot52:1135-42);聚乙二醇法(Krens,等， (1982)Nature296:72-77);单子叶和双子叶植物细胞的原生质可使用电穿孔(Fromm，等， (1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:5824-5828)和显微注射(Crossway,等，(1986)Mol.Gen.Genet.202:179-185)转化；将其所有引入于此以作参考。
[0137]用于将表达载体引入植物的最广泛利用的方法是基于农杆菌的自然转化系统。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆 菌(A.rhizogenes)为植物病原土壤细菌，其在遗传学上转化植物细胞。根癌农杆菌和毛根农杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。参见，例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sc1.10:1。农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移的方法的描述提供于Gruber,等,上述；Miki,等,上述JPMoloney,等，(1989) Plant Cell Reports8:238。
[0138]类似地，基因可插入分别来源于根癌农杆菌或毛根农杆菌的Ti或Ri质粒的T-DNA 区。因此，表达盒可使用这些质粒如上构建。已知许多调控序列当其与异源编码序列结合并转化至宿主有机体中时相对于原始编码序列的组织/器官特异性在基因表达中显示保真性。参见例如Benfey和Chua, (1989) Science244:174-81。特别适合的用于这些质粒的调控序列为在各种靶植物中的基因的组成型叶特异性表达的启动子。其它有用的调控序列包括来自胭脂碱合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒 pARC2,可由美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得并指定为ATCC67238。如果使用此类系统，则来自Ti或Ri质粒的毒性(vir)基因也必须与T-DNA 部分或者经其中vir基因存在于单独载体的二元体系而存在。在其中使用的此类系统、载体和转化植物细胞的方法记载于美国专利4，658，082号；1986年10月I日提交的美国专利申请系列号913，914，参考1993年11月6日公布的美国专利5，262，306号;和Simpson, 等，(1986)Plant Mol.Biol.6:403_15m，将其全部内容引入于此以作参考。
[0139]一旦构建，这些质粒可置于毛根农杆菌或根癌农杆菌中以及用于转化通常对镰刀菌属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染敏感的植物物种的细胞的这些载体中。根癌农杆菌或毛根农杆菌的选择将取决于由此转化的植物。通常根癌农杆菌是优选的转化用有机体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(如百合目(Liliales) 和天南星目(Arales)的某些成员)对根癌农杆菌感染敏感。毛根农杆菌还具有广泛的宿主范围，包含大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科 (Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。如今可转化单子叶植物已取得了一些成功。欧洲专利申请604 662 Al号公开了使用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请672 752 Al号公开了使用未成熟胚胎的盾片(scutellum)利用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等讨论了通过将未成熟胚胎暴露于根癌农杆菌来转化玉米的方法(Nature Biotechnologyl4:745-50(1996))。
[0140]一旦转化，这些细胞可用于再生转基因植物。例如，可通过造成植物创伤然后将载体引入伤口部位，用这些载体感染整个植物。植物的任何部分可造成创伤，包括叶、茎和根。可选地，外植体形式的植物组织，例如子叶组织或叶盘可接种这些载体，并在促进植物再生的条件下培养。通过用包含编码伏马菌素(fumonisin)降解酶基因的毛根农杆菌或根癌农杆菌接种植物组织而转化的根或嫩枝可用作植物组织来源，从而经体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马菌素-抗性转基因植物。此类用于再生植物组织的方法的实例公开于 Shahin, (1985) Theor.Appl.Genet.69:235-40 ;美国专利号 4，658，082 ；Simpson,等，上述； 和美国专利申请913，913和913，914号，二者均于1986年10月I日提交，参考1993年11 月16日公布的美国专利5，262，306号，将其中全部公开内容引入于此以作参考。
[0141]作为农杆菌-介导的转化的替代方法已开发了几种植物转化方法(统称为直接基因转移)。
[0142]植物转化的普遍适用的方法为微粒-介导的转化，其中地尺寸为约I至4iim的微粒表面上携带DNA。利用将微粒加速至300至600m/s速度，足以穿透植物细胞壁和膜的生物射弹装置(biolistic device)将表达载体引入的植物组织(Sanford,等，(1987)Part.Sc1.Technol.5:27 ；Sanford, (1988)Trends Biotech6:299 ；Sanford, (1990)Physiol.Plant79:206 ;和 Klein,等，(1992)BiotechnologylO:268)。
[0143]物理递送DNA至植物的另一方法为如Zang等描述的靶细胞的声处理((1991) BioTechnology9:996)。可选地,脂质体或原生质体融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如 Deshayes 等，(1985) EMBO J.4:2731 ;和 Christou,等，(1987) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:3962。也已报道了使用CaC12沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接吸收进入原生质体中。参见例如 Hain 等，(1985)Mol.Gen.Genet.199:161 ;和 Draper 等，(1982) Plant Cell Physiol.23:451。
[0144]还已记载了原生质体和整个细胞和组织的电穿孔。参见例如Donn等，(1990) Abstracts of the VIIth Int' 1.Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，p.53 ;D，Halluin 等，(1992)Plant Cell4:1495-505 ;和 Spencer 等，(1994) Plant Mol.Biol.24:51-61。
[0145]稳定转化后，进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生具有由于因种子根据孟德尔法则支配的遗传变化由植物产生，所以使作物中缺少均匀性的杂合性引起的缺陷。基本上，每个种子在遗传学上是不同的，且每个将以其自身特有的特征生长。因此，优选转化植物以使再生植物具有亲本转基因植物同一的特征和特性这样的方式产生。
[0146]转化植物可通过微体繁殖(micropropagation)来再生,所述微体繁殖提供转化植物的迅速、一致的生殖。微体繁殖为由从选择的亲本植物或培养植物中切离的单块组织长成新一代植物的方法。该方法允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物的规模化繁殖。 所产生的新一代植物在遗传学上与原始植物同一，并具有原始植物所有的特性。微体繁殖使得优质植物材料在短时间内规模化生产，并使所选栽培植物快速增殖，保留原始转基因或转化植物的特性。克隆植物的优势为植物增殖速度和所产生植物的品质和一致性。
[0147]微体繁殖为多阶段步骤，需要在阶段之间改变培养基或生长条件。因此，微体繁殖方法涉及四个基本阶段:阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培养增殖；阶段三，分化和植物形成；和阶段四，温室培养和强化(hardening)。在阶段一初始组织培养期间，建立组织培养并证实无污染物。在阶段二期间，繁殖初始组织培养物，直至产生足以满足生产目标数量的组织样品。在阶段三期间，将在阶段二中生长的组织样品分离并生长为单独的小植株。 在阶段四中，将转化的小植株转移至温室来强化，其中植物对光的耐受性逐渐增加，从而可在自然环境中生长。
[0148]在某些方面，本 发明提供抗植物病原害虫的植物的生产方法，所述方法为用重组 DNA构建体或表达dsRNA的构建体的组合转化植物细胞；由转化的植物细胞再生植物；和在适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化植物细胞生长。
[0149]本发明的方法适用于瘿蜂物种，例如对由RNA干扰产生的基因沉默敏感且能够从其周围环境内在化dsRNA的桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂(Om)。本发明适用于处于任何发育阶段的昆虫。由于昆虫具有非生命的外骨骼，它们不能以均一的速度生长，而是在通过周期性脱落其外骨骼的各阶段中生长。该过程称为蜕皮或换羽。蜕皮之间的阶段称为“龄”，且根据本发明可靶向这些阶段。另外，根据本发明还可靶向昆虫的卵或幼虫。根据本本发明可靶向包括有翅昆虫的变形在内的发育周期中的所有阶段。因此，个体阶段如幼虫、蛹、稚虫等发育阶段都可靶向。
[0150]Li和Om为桉树的害虫。因此，本文所述的核酸、dsRNA和方法对于处理或抑制Li 和Om感染和侵染桉树是有用的。
[0151]在优选的方面，本发明提供RNAi介导的害虫防治以产生抗瘿蜂的转基因桉树。两种桉树瘿蜂入侵物种桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂(Om)目前已蔓延出澳大利亚分布至全世界的种植园中[6，9]。雌性可有性或孤雌生殖，且全部生命周期经历约130天。这些害虫在树的叶脉和叶表面下产下卵，诱导靶组织中瘿瘤形成来充当发育中的幼虫的宿主掩蔽所和食物储存。诱导瘿瘤形成的确切化合物或信号还未阐明。因此，化合物从卵和幼虫中而不是从母体中的分泌与瘿蜂形成相关。幼叶中的分生组织或全能细胞(omnipotent cell)受引发其增殖的化学、机械、病毒或DNA操作的诱导。瘿瘤发展与幼虫发育相对应，因此瘿瘤的大小和年龄可与幼虫发育阶段相关。Stone等,2002，“The population biology of oak gall wasps (Hymenoptera: Cynipidae)，，? Annu.Rev.Entomol.47:633-68。幼虫成熟诱导瘿瘤的进一步发展直至蛹期。当成年瘿蜂出现时，它们能够飞走并产下数百只卵，在它们死亡前的3-6天期间感染同一棵树以及附近和远处的树木。大量瘿蜂攻击引起生长停滞、叶子脱落和死亡，结果可能导致大量森林产量损失。无柄发育的幼虫，在产生对活力基因有活性的RNAi的转基因植物上进食，受到持续且相对长期地吸收为沉默特定活力瘿蜂基因而定制设计的si/dsRNA分子的影响。最后沉默作用导致早期生长阶段中的幼虫死亡， 由此保护宿主并使瘿蜂种群大小最小化，保护宿主植物免受损害。
[0152]瘿蜂在非转基因树中的幼虫阶段可长达130天，因此dsRNA的致死效果可在整个潜在的幼虫生长期累积。一旦幼虫死亡，瘿瘤的发展被遏止，并减少成虫数量，随后防止对该树木、邻近或远处的树木的感染。
[0153]转基因抗性树的特征在于对“瘿蜂发育规模”的如下结果中的一个或多个:
[0154]1.无瘿瘤发展。
[0155]2.与WT相比，发展小型瘿瘤(低幼虫质量测量的指标)[测量最大长度、直径、面积和/或体积]。
[0156]3.与WT相比的低幼虫质量测量:与WT相比，总幼虫重量降低。
[0157]4.与WT相比，更多的瘿瘤聚`集死亡的幼虫。
[0158]5.与WT相比，更多的瘿瘤聚集死亡的蛹。
[0159]6.与WT相比，未从瘿瘤中出现成虫。
[0160]7.与WT相比，发育上受损的成虫，与在野生型树上生长的成虫相比缺乏繁殖或传播的能力。
[0161]实施例
[0162]实施例1
[0163]瘿蝰转录纟目测序
[0164]从来自以色列埃梅克(Emek)的感染的赤桉中收集瘿蜂感染的叶。通过在双目显微镜下用尖刀切割并打开瘿瘤来从在树叶和/或叶柄中发现的瘿瘤中除去瘿蜂幼虫。使用来自各种幼虫发育阶段的幼虫混合物。将各批100只幼虫置于冰上的微管中。然后将管密封并立即冷冻于液氮中并保存在-80°C直至进一步处理。使用MasterPure RNA纯化试剂盒和操作手册(MRC85102_Epicentere Biotechnologies)分离总 RNA。总 RNA 体积为 50 U I。然后用DNAse处理总RNA以除去任何剩余的残留DNA，接着分离poly A mRNA (MicroPoly (A) Purist,小规模mRNA纯化试剂盒，AM1919Ambion)。mRNA终体积为20 U I。纯化的mRNA保存在-80°C直至进行454测序。根据标准操作手册进行454测序，从而提供靶害虫的转录组。
[0165]实施例2
[0166]Li矛口 Om革F1基因矛口序歹Il的盤定
[0167]选择对特定组织或整个有机体的细胞进程或适当的发育进程至关重要的唯一的活力Li和Om基因作为基因沉默的靶标。首先，将使用基于已知同源膜翅目序列的简并引物的标准步骤来鉴定靶基因的片段。其后，将Li和Om瘿蜂幼虫的各转录组使用454测序仪深度测序平台测序(454Life Sciences ；Branford, CT, USA ；now Roche, Basel)。使用 Roche 软件包并使用Blast2Go程序注释(可于http://www.blast2g0.0rg/获得)，基于与已知公开的膜翅目昆虫转录组的序列比对来组装序列并对结果进行注释。
[0168]表1给出SEQ ID NO:来自Li和Om的所鉴定的基因1_9的完整或部分基因序列。
[0169]表1.Li和Om某因
[0170]
【权利要求】
1.一种分离的核酸，其包括在高严格杂交条件下与选自由SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:45-123、SEQ ID NO: 127-132,SEQ ID NO:234-244组成的组的序列及其互补序列选择性杂交的序列。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核酸与所述选自由SEQID NO: 15,SEQID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:45-123,SEQID NO: 127-132,SEQ ID NO: 234-244组成的组的序列及其互补序列的同一性为90-99.99%。
3.根据权利要求1或2所述的分离的核酸，其中所述核酸包括选自由SEQID NO: 15、SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ IDNO:45-123、SEQ ID NO: 127-132,SEQ ID NO:234-244组成的组的序列及其互补序列的至少17个邻接核苷酸。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸，其中所述核酸包括选自由SEQID NO: 1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 150-222、SEQ IDNO:234-244组成的组的序列及其互补序列的至少25个邻接核苷酸。
5.根据权利要求1-4任一项所述的分离的核酸，其中所述核酸与所述核酸的蜜蜂直向同源物的同一性小于约80%。
6.ー种载体，其包括可操作地连接至表达调控序列的根据权利要求1-5任一项所述的分离的核酸。
7.—种宿主细胞，其包括根据权利要求6所述的载体。
8.ー种植物组织，其包括根据权利要求6所述的载体。
9.根据权利要求8所述的植物组织，其中所述组织选自由叶组织、叶脉、叶柄、小枝、枝、花、干、果实和种子组成的组。
10.一种分离的小抑制性核糖核酸分子(SiRNA)，其抑制编码外被体亚单位a ( a COP)、染色质域解旋酶DNA结合蛋白、毒羧酸酯酶6同エ型1、几丁质合成酶、铁蛋白或保幼激素环氧化物水解酶的桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂核酸分子的表达。
11.一种分离的双链核糖核酸分子(dsRNA)，其包括与SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID N0:25 或 SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:45-123、SEQ IDNO: 127-132,SEQ ID NO:234-244中所示的至少17个邻接核苷酸基本上同一的第一链核苷酸和与所述第一链核苷酸基本上互补的第二链核苷酸的単元。
12.根据权利要求11所述的分离的dsRNA，其中所述第一链核苷酸与SEQID NO: USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130,SEQ ID N0:131、SEQ ID NO:132或SEQ IDNO: 150-222中所示的至少17个邻接核苷酸基本上同一。
13.根据权利要求11或12所述的dsRNA，其中所述第一链和第二链核苷酸为至少约.25、35、50、70或100个核苷酸长度。
14.根据权利要求11-13任一项所述的dsRNA,其中所述第一链和第二链核苷酸在它们各自的长度上与 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:25,SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:45-123,SEQ ID NO:127-132 或 SEQ ID NO:234-244 的同一性为70-100%。
15.根据权利要求11-14任一项所述的dsRNA，其中所述第一链和第二链核苷酸的序列与所述第一链和第二链核苷酸的蜜蜂直向同源物的序列的同一性小于约80%。
16.根据权利要求11-15任一项所述的dsRNA，其包括至少两(2)个所述单元。
17.根据权利要求16所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自选自由SEQID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, SEQID NO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 15、SEQID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:45_123、SEQ ID NO: 127-132、SEQ ID NO: 150-222 和 SEQ ID NO:234-244 组成的组的不同序列。
18.根据权利要求11-17任一项所述的dsRNA，其进ー步包括分隔所述第一链和所述第二链核苷酸的环区。
19.ー种载体，其包括可操作地连接至为根据权利要求11-18任一项所述的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列。
20.ー种宿主细胞，其包括根据权利要求19所述的表达载体。
21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主为细菌细胞或酵母细胞。
22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主为农杆菌。
23.ー种植物组织，其被根据权利要求22所述的宿主细胞转化。
24.ー种植物组织，其包括根据权利要求11-22任一项所述的dsRNA。
25.一种分离的小抑制性核糖核酸分子(dsRNA)，其抑制桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂的必需基因的表达。
26.根据权利要求25所述的dsRNA，其包括与来自所述必需基因的至少17个邻接核苷酸基本上同一的第一链核苷酸和与所述第一链核苷酸基本上互补的第二链核苷酸的単元。
27.根据权利要求26所述的dsRNA，其中所述第一链和第二链核苷酸为至少约25、35、.50、70或100个核苷酸长度。
28.根据权利要求25-27任一项所述的dsRNA,其中所述第一链和第二链核苷酸在它们各自的长度上与所述必需基因的同一性为70-100%。
29.根据权利要求26-28任一项所述的dsRNA，其包括至少两(2)个所述单元。
30.根据权利要求29所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自不同的必需基因。
31.根据权利要求30所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自单一物种。
32.根据权利要求30所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自不同物种。
33.根据权利要求26-32任一项所述的dsRNA，其进ー步包括分隔所述第一链和所述第二链核苷酸的环区。
34.ー种载体，其包括可操作地连接至为根据权利要求26-33任一项所述的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列。
35.ー种宿主细胞，其包括根据权利要求34所述的表达载体。
36.ー种植物组织，其包括根据权利要求25-33任一项所述的dsRNA。
37.ー种植物组织，其包括根据权利要求34所述的载体。
38.ー种植物组织，其包括根据权利要求35所述的宿主细胞。
39.ー种抗害虫植物的生产方法，其包括在所述植物中表达根据权利要求11-18或权利要求25-33任一项所述的dsRNA，或者在所述植物的生殖材料中繁殖根据权利要求11_18或权利要求25-33任一项所述的dsRNA。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述植物为桉树。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述害虫为瘿蜂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述害虫为桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂。
43.—种害虫侵扰的抑制方法,其包括培养包含根据权利要求11-18或权利要求25-33任一项所述的dsRNA的植物，从而抑制所述侵扰。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述植物为桉树。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述害虫为桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂。
46.ー种抗植物病原害虫的植物的生产方法，其包括: (a)用表达根据权利要求11-18或权利要求25-33任一项所述的dsRNA的重组DNA构建体或构建体的组合来转化植物细胞； (b)由转化的所述植物细胞来再生植物；和 (c)在适于所述重组DNA构建体转录的条件下使转化的所述植物细胞生长， 由此所述长成的转化植物与未转化植物相比抗所述害虫。
47.根据权利要求46所述的方法，其进ー步包括用表达与所述dsRNA的一条链或其片段互补的单链RNA的重组DNA构建体转化所述植物细胞。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述植物为桉树。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述害虫为桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂。
【文档编号】A61K31/713GK103596575SQ201280027060
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年3月30日
【发明者】D·阿维萨尔, H·斯坦因, Z·萨尼, D·西格尔 申请人:富优基尼以色列股份有限公司