专利名称：Cyr61在银屑病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及Cyr61在银屑病药物中的应用，属生物医药领域。
背景技术：
银屑病(Psoriasis)是一种发病率高达2-3%的由免疫介导的鳞屑性皮损为主要特征的慢性炎症性皮肤疾病。病理特征为皮肤角质细胞过度增生并角化不全、炎症细胞浸润而导致的皮肤损伤和瘙痒。银屑病的临床特点表现为:皮肤出现不规则红斑和丘疹，轻刮皮屑后红斑处有明显出血点，上面覆盖 薄膜；皮肤红斑和丘疹处皮损表皮过度增生，表现如厚厚牛皮，轻抓表皮呈鳞状脱屑，严重者如套状或者鞋袜状皮屑脱落。本病呈反复发作、秋冬季加重、皮肤瘙痒难耐，严重影响患者的生活和工作。其中疱疹型或者红皮病型，有时也会引起患者全身性症状，严重甚至可危及患者生命，因此不仅患者十分痛苦，而且也给家庭和社会带来沉重负担。近年来银屑病在我国发病率呈增加趋势，目前全国至少有300万患者，是皮肤科的重要疾病。银屑病发病机理复杂，至今不明。目前公认此病相关因素较多，如遗传、感染、精神因素、内分泌因素、代谢障碍、免疫功能紊乱等。其中，免疫异常已经得到公认是银屑病的重要因素:采用免疫抑制剂、或者抑制炎症因子(如TNFa)的生物制剂能快速有效缓解银屑病的临床症状，证实了免疫和炎症在银屑病发生发展中的重要性。典型的银屑病患者的皮肤病理切片中可见，角质细胞过度增生，向下(即向基底细胞层)生长而形成“杵状”突出；向上在表皮部位形成多层重叠的角质细胞，由于角化不全，这些表皮细胞中含有细胞核，在角质细胞之间有明显的、散在的中性粒细胞浸润，形成“微脓疡”。因此，银屑病的病理中至少有下列两个因素:炎症/免疫细胞；角质细胞过度增生并角化不全。目前在银屑病皮损部位发现的炎症/免疫细胞有单核巨噬细胞、郎格汉斯细胞、树突状细胞、ThU Thl7/Th22细胞等T细胞亚群以及中性粒细胞等。与此相关的炎症因子介导了银屑病皮损的发生。目前发现相关的重要炎症因子有TNFa、IL-17、IL-22/IL-23等等。其中，TNFa可由多种炎症细胞产生，如皮肤的单核巨噬细胞、郎格汗式细胞、树突状细胞、Thl细胞等都能够产生，临床上采用抗TNFa的生物制剂能够获得临床症状缓解，表明这是一种主要的炎症因子。除了炎症细胞和炎症因子外，在银屑病发生中起关键作用的另外一种细胞即是皮肤角质形成细胞(keratinocyte, KC)。角质形成细胞位于皮肤的最表面,在正常情况下，表皮的角质形成细胞通过分化与活化这两条相互调节和转换的方式以维持正常功能和损伤修复。正常情况下，角质形成细胞来源于皮肤的基地层，经过分化发育为棘层、颗粒层，最后到达并形成角质层。但是在银屑病时，这样的分化发育过程受到干扰，使角质形成细胞过度增生但是分化不全，从而导致银屑病皮损病变。现在已知，来源于不同细胞的角质素们调控着角质形成细胞正常分化发育，而当异常情况下，如接受炎症因子刺激时，角质素表达异常，从而使正常的表皮形成调控失常，导致疾病。现在已经发现，炎症因子如IL-b，TNFa是维持KC处于活化状态的主要细胞因子，其他如IL-17、IL-22/IL-23等均通过不同途径参与上述途径，加重皮损。Cyr61 (Cysteine-rich 61)是一种分子量约42 kDa的分泌型基质蛋白，不仅是胚胎发育、组织损伤修复中的重要蛋白，还与炎症环境下组织细胞的过度增生有关，更重要的是Cyr61还能反向促进炎症部位的Thl7细胞分化，由此加重炎症部位的组织损伤{Journal of Immunol, 2012，188:5776-5784)。之前的研究均集中在Cyr61分子在胚胎发育、组织损伤修复和肿瘤发生中的作用。2009年底申请人率先报道了 Cyr61受到IL-17上调并介导类风关滑膜细胞过度增生(心^ Rheumatism，2009，60:3602 — 3612、饱关键作用，继之Cyr61能够通过促进滑膜细胞分泌IL-6而反向促进Thl7分化增殖，由此导致 RA 病变部位 Thl7 增多、加重炎症(Journal of Immunol, 2012,188:5776-5784)。这些研究表明Cyr61在类风关这样的自身免疫病中起到前炎症因子的作用，因此是潜在的治疗靶点。这些研究还表明Cyr61在免疫应答与自身免疫病中担任着关键的中介作用，它像IL-lb, IL-6、IL-8等重要的前炎症因子一样，介导免疫系统与组织结构细胞之间的相互作用，是机体免疫系统和组织细胞间的重要桥梁，起到加重局部炎症和组织损伤病理作用。申请人:最新的研究表明Cyr61分子还参与银屑病的发生，因此认为是潜在的治疗靶点。主要参考文献:
1.Jinpiao Linj Zhou Zhou, Rongfen Huoj Lianbo Xiao, Guilin Ouyang,Li Wang, Yue Sun, Baihua S henj Dangsheng Li， Ningli L1.Cyr61 PromotesThl7 Differentiation through Inducing IL-6 Production by Fibroblast-LikeSynoviocytes in Rheumatoid Arthritis.Journal of Immunology.2012， 188 (11):5776-84 ；
2.Jinpiao Linj Rongfen Huoj Li Wang, Zhou Zhou, Yue Sun, Baihua ShenjRongfang Wang, Ningli L1.A novel anti_Cyr61 antibody inhibits breast cancergrowth and metastasis in viv0.Cancer Immunology Immunotherapy, 2012，61:677-687 ；
3.Qiuyu Zhang, Juanjuan Wuj Qi Caoj Lianbo Xiao, Li Wang, Dongyi He，Guilin Ouyangj Jinpiao Linj Baihua Shenj Yuan Shij Yan Zhang, Dangsheng Li，Ningli L1.A Critical Role of Cyr61 in IL-17-dependent Proliferation ofFibroblast-like Synoviocytes in Rheumatoid Arthritis.Arthritis & Rheumatism,2009， 60:3602-3612 ；
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6.Wolk Kj Kunz S，Witte E，Friedrich M，Asadullah K，Sabat R.1L-22Increases the Innate Immunity of Tissues.1mmunity, 2004，21:241 - 254 ；7.Eyerich S， Eyerich K， Pennino D， Carbone T， Nasorri F， PallottaSj Cianfarani F， Odorisio T， Traidl-Hoffmann C， Behrendt H， Durham SR，Schmidt-Weber KBj Cavani A.Th22 cells represent a distinct human T cellsubset involved in epidermal immunity and remodeling.TheJournal ofClinical Investigation, 2009， 119: 3573-3585 ；
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发明内容
本发明目的在于:提供一种Cyr61新应用。为实现发明目的，本发明提供下述技术方案:一种Cyr61在制备银屑病药物中的应用。本发明还提供Cyr61抑制剂在制备银屑病药物中的用途。在上述方案基础上，所述的Cyr61抑制剂选自Cyr61特异性中和抗体093G9、Cyr61基因干扰RNA、抗Cyr61蛋白。根据上述技术方案本发明运用实时定量PCR方法分析了 Cyr61在银屑病患者皮损部位中的表达，首先采用实时定量PCR分析了 10例银屑病患者皮损和皮损周围正常皮肤组织中Cyr61的mRNA的表达水平；采用特异性Cyr61 siRNA序列干扰实验,所述的Cyr61基因干扰RNA选自siRNA中的一种或其变异体。证实Cyr61分子参与银屑病的发生:在银屑病患者皮损部位的炎症因子可通过上调角质细胞分泌产生Cyr61分子而上调角质素(K6)表达，结局是促进角质细胞过度增生并分化不全，由此导致银屑病皮损。用抗Cyr61特异性中和抗体阻断Cyr61作用后，可以降低K6表达而缓解银屑病皮损和病变。因此，Cyr61的确参与银屑病发生，也是重要的治疗靶点。
图1中，图1 A在银屑病患者皮损部位中Cyr61基因的相对表达量比正常皮肤高(图1);图1 B蛋白印迹实验证实了基因表达水平的结果，实时定量PCR检测表明皮损部位的Cyr61表达远远高于正常皮肤；图1 C采用免疫组化方法对于Cyr61在银屑病患者皮损组织中的分布，表明皮损部位角质细胞呈“杵状生长”，向基底细胞层生长，而Cyr61在这些部位表达十分明显；
图2，为银屑病小鼠模型中病变皮损Cyr61表达上调，其中:
图2 Al咪喹莫特造模小鼠10天皮肤增厚、有出血点、皮肤鳞屑图，至16天的图2 A2皮肤鳞屑更加明显；
图2B皮肤病理显示随着造模时间延长角质细胞增生明显，10天的图2B1到16天的图2B2 “杵状生长”显著；
图2C在小鼠的鳞屑状 皮损中Cyr61的相对表达量，在小鼠的鳞屑状皮损中Cyr61表达明显增加；
图3在银屑病小鼠皮损出现明显时(第七天)时给予抗Cyr61的中和抗体093G9，与对照组Con-1gGl比较，其中:
图3A，银屑病小鼠皮损明显减轻、出血点消失、皮肤鳞屑减少；
图3B，皮损部厚度，皮肤厚度明显降低；
图3C，093G9治疗小鼠皮肤角质细胞增生明显降低，“杵状生长”不显著；
图3D，Cyr61的相对表达量，明显降低；
图4，角质素(Keratin，或K)在银屑病皮损和正常皮肤中相对表达量，其中:
图4A，银屑病患者皮损中K6的mRNA相对表达量远远高于正常皮肤，K6的mRNA的相对表达量远远低于正常皮肤；
图4B，蛋白印迹实验中，银屑病患者皮损的K6的mRNA相对表达量也证实相同；
图5，炎症因子/Cyr61/K6表达格局与相关性，其中，
图5A，炎症因子TNFa、IL-17, IL-21/IL-22/IL-23上调角质细胞表达Cyr61 ;5B，炎症因子TNFa、IL-17、IL-21/IL-22/IL-23上调人角质细胞株HaCat细胞相对表达K6 ；
图5C，采用Cyr61特异性siRNA将HaCat细胞中Cyr61敲除，再用上述炎症因子刺激，K6相对表达量明显降低；
图5D，蛋白印迹实验中，除Cyr61后炎症因子促进K6蛋白A表达降低；
图6，为Cyr61介导角质细胞表达K6，其中:· 图6A，外源性Cyr61在一定浓度范围内上调K6相对表达量；
图6B，Cyr61促进K6表达在48小时时最为明显；
图6C,敲除Cyr61后,角质细胞中K6表达下调,而补充外源性Cyr61后K6表达恢复。
具体实施例方式实验材料与方法:
O银屑病患者皮损样本:
选择皮肤科门诊患者、临床表现典型的银屑病患者(10例)，常规方法取皮损部位和皮损边缘正常皮肤样本置于生理盐水中，样本当天处理。抽提RNA、蛋白质或者制备病理切片(方法见下)备用。2)银屑病小鼠模型建立:
采用国际通用的银屑病小鼠模型:给8周龄的Balb/c小鼠，以5%咪喹莫特(Imiquimod,终用量为每只小鼠3.125 mg)涂抹背部，每日2次，连续7天。小鼠背部出现银屑病样改变:皮肤增厚变硬，表现如厚厚牛皮，出现不规则红斑和丘疹，上面覆盖薄膜样鳞屑。病理切片检查也与人类银屑病相似:角质细胞过度增生，向基底细胞层生长而形成“杵状”突出；向上在表皮部位形成多层重叠的角质细胞。皮肤表皮细胞中含有细胞核，即为角化不全。3)银屑病小鼠用特异性抗Cyr61抗体治疗:
在上述造模小鼠的第7天,皮损出现明显时给予小鼠抗Cyr61特异性中和抗体093G9进行治疗:方法:无菌注射用水溶解，给小鼠腹腔注射，每周2次，每次用量为200ug。治疗至20天时结束。对照小鼠给予相同剂量的抗小鼠IgGl抗体。所有处理与观察相同。4) RNA抽提与实时定量PCR:
抽提细胞总RNA:采用Tritzol (Invitrogen)方法。简述之:将Iml Trizol加入组织或者细胞中，多次吹打使充分裂解，然后加入200 μ I氯仿,涡旋振荡15 sec，室温静置10分钟；12000rpm，4°C离心15min后小心吸取上清(水相)约200 — 300 μ I置于另一个EP管中，再加入等体积的异丙醇(4°C预冷)，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟；12000rpm，4°C离心IOmin后弃上清，加入I ml 75%乙醇洗涤I次；空气干燥后加10 — 20 μ I DEPC处理的水，260nm测浓度待用。5)实时定量PCR检测Cyr61基因表达格局:
应用逆转录试剂盒(Sensiscript RT Kit, QIAGEN)合成各样本的cDNA。常规方法扩增基因片段。扩增引物见表1:
表1.实时定量PCR分析所用特异性扩增引物(已知的)
权利要求
1.一种Cyr61在制备银屑病药物中的应用。
2.Cyr61抑制剂在制备银屑病药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的Cyr61抑制剂选自Cyr61特异性中和抗体093G9、Cyr61基因干扰RNA。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的Cyr61基因干扰RNA选自siRNA中的一种或其变异体，正义链SEQ ID NO. 5，反义链SEQ ID NO. 6。
全文摘要
本发明涉及Cyr61在银屑病药物中的应用，属生物医药领域。本发明还涉及Cyr61抑制剂在制备银屑病药物中的用途。本发明运用实时定量PCR方法分析了Cyr61在银屑病患者皮损部位中的表达，并采用特异性Cyr61siRNA序列干扰实验。证实Cyr61分子参与银屑病的发生在银屑病患者皮损部位的炎症因子可通过上调角质细胞分泌产生Cyr61分子而上调角质素(K6)表达，结局是促进角质细胞过度增生并分化不全，由此导致银屑病皮损。用抗Cyr61特异性中和抗体阻断Cyr61作用后，可以降低K6表达而缓解银屑病皮损和病变。因此，Cyr61的确参与银屑病发生，也是重要的治疗靶点。
文档编号A61P17/06GK103251931SQ201310072830
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者陈向东, 李宁丽, 沈佰华, 火蓉芬, 汪蓓青, 吴品茹, 沈征宇, 徐慧 申请人:上海交通大学医学院