专利名称：裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌与鼻咽癌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药及基因工程领域，涉及裂果薯及其总皂苷提取物的应用。
背景技术：
裂果薯，百合纲，百合亚纲，百合目，筠篛薯科，裂果薯属植物，拉丁学名:Schizocapsa plantaginea Hance,别名:屈头鸡、水狗仔、长须果、冬叶七、黑冬叶、箭根薯、客妈连、客妈七、马老头、米荷瓦、曲头鸡、水槟榔、水鸡仔、水萝卜、水三七、水田七、水虾公、田螺七、土贝母、土三七、小田螺七。多生于水沟边、田埂草地上。分布于江西、湖南、广东、广西及贵州等省区。以块茎入药，主治咽喉肿痛，急性肠胃炎，泌尿道感染，牙痛，慢性胃炎，胃、十二指肠溃疡，风湿性关节炎，月经不调，疟疾，跌打损伤；外用治疮疡肿毒，外伤出血。目前裂果薯的化学成分已经有初步的分离研究，已经从中分离出超过40种单体物质,其化学成分包括:根莖含氨基酸、阜苷元如约茂阜苷元(yamogenin),甾族阜苷类(A-D)包括和裂果薯阜苷(Iieguonin或taccaoside),多种留族苦味成分箭根薯酮内酯(taccal0n0lide)A-M (高度氧化的留体)，黄酮和生物碱。并对其化学成分活性进行了初步的实验。从裂果薯中提取到的箭根酮内酯AUaccalonolide A)对P388肿瘤细胞有细胞毒作用，并且对鼠疟原虫有杀灭作用，最近的研究还表明箭根酮内酯A和E(taccalonolideAand E)是首个对微管具有类似于taxol作用的天然留体,并已对其进行了一定的结构改造。C27留体阜昔taccaoside C和taccaoside D对人白血病CCRF-CEM肿瘤细胞株有抑制作用，Eca 一 109 (人类食管癌细胞)，SPC-A-1 (人类肺腺癌细胞)，BGC —823 (人类低分化胃腺癌细胞，AGS(人类胃腺癌细胞)，K562(人类慢性髓原白血病细胞)等六个肿瘤细胞均有抑制作用(IC50=1.90 ；6.6 ；6.5 ；5.1 ；8.9 ；7.9 / ml)。可见目前抗肿瘤研究主要集中在非阜苷类的多种留族苦味成分箭根薯酮内酯taccalonolides,阜苷类仅见taccaoside C,约茂阜苷元(yamogenin)和裂果薯阜苷)，裂果薯阜苷甲、乙((Iieguonin或tac caoside A-B)未见文献提及。这些研究仍主要停留在体外初步观察裂果薯活性成分的非特异性抗肿瘤作用，以特异性的、靶向性的针对肿瘤肝癌和鼻咽癌研究仍未见报道。
发明内容
本发明的目的是利用从广西特色植物裂果薯的块茎中提取出的总皂苷对肿瘤进行治疗。本发明提供了一种新的抑制肿瘤细胞的提取物，该提取物为裂果薯拉丁学名:Schizocapsa plantaginea Hance中提取的总阜苷成分和包含的各阜苷单体化合物成分。裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌、抗鼻咽癌中的应用。本发明中，肿瘤可以是人肝癌，鼻咽癌。本发明首次利用裂果薯皂苷作为治疗肝癌，鼻咽癌的药物，在肿瘤细胞中加入所述的裂果薯总皂苷提取物(应包括:茂皂苷元(yamogenin)，留族皂苷类(A-D))，该皂苷可以明显抑制肝癌细胞或鼻咽癌细胞的增殖，并对正常细胞抑制力较低。裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌、抗鼻咽癌中的应用，是在肿瘤细胞中加入和在人肿瘤鼠移植模型中给予所述的裂果薯总皂苷提取物。本发明中，将裂果薯总皂苷用于肿瘤细胞(例如肝癌细胞株SMMC-7721，BEL-7404和鼻咽癌细胞株CNE-1)，结果显示裂果薯总皂苷在体外实验中对肿瘤细胞有明显抑制作用。经过将裂果薯总皂苷用于正常肝细胞HL-7702，对比证明裂果薯总皂苷对癌肿组织有明显的选择性。预示着裂果薯总皂苷在抗肿瘤方面有广阔的研究前景。本发明中，将裂果薯总皂苷用于血清学实验。每日将裂果薯皂苷制成大鼠耐受剂量浓度的药液灌胃大鼠，连续七日后腹主动脉插管取血，离心取得血清。利用含药血清培养肿瘤细胞(例如肝癌细胞株SMMC-7721，BEL-7404和鼻咽癌细胞株CNE-1 )，结果显示含药血清对肿瘤细胞有明显抑制作用，证明裂果薯总皂苷经过吸收代谢后仍有抗肿瘤作用。提示裂果薯总皂苷可以口服给药。肿瘤形成的过程中微小血管的形成对肿瘤组织的生长与扩散有很重要的促进作用。肿瘤细胞会促进组织内血管内皮生长因子(VEGF)的表达，使血管生长加速，微小血管增多，进一步促进瘤体的生长。本发明中，将一定浓度的裂果薯总皂苷滴加到置于鸡胚绒毛尿囊膜上的无菌醋酸纤维滤纸上，继续孵育三天后取鸡胚绒毛尿囊膜置于显微镜下观察，发现鸡胚鸡胚绒毛尿囊膜上微血管生成明显减弱，且呈浓度依赖关系，提示裂果薯皂苷能减少微小血管的生成，对减少癌肿组织中的微小血管灌流有一定作用。ELISA测定酪氨酸蛋白激(TPK)含量，裂果薯皂苷对酪氨酸激酶含量亦有抑制作用，但弱于索拉菲尼，说明裂 果薯皂苷可通过抑制调控肿瘤细胞和血管生长的酪氨酸激酶发挥上述作用，达到靶向抗肿瘤作用。本发明中，将裂果薯总皂苷用于裸鼠抑制瘤模型，结果显示裸鼠肿瘤的大小、重量随着给药剂量的增加而减小。HE染色结果发现裂果薯皂苷可致肿瘤细胞小片坏死，灶性坏死及小灶性坏死与不同程度的血管塌缩。免疫组化结果显示，裂果薯总皂苷可使肿瘤内微小血管减少。VEGF的表达染色显示，裂果薯总皂苷可使肿瘤组织VEGF表达量降低。总的来说，裂果薯总皂苷除可直接抑制人肝癌和鼻咽癌细胞生长外，还可减少肿瘤组织中的血管生成，降低肿瘤组织的血液灌流,起到抑制肿瘤细胞和血管生长的作用，并可减少肿瘤细胞的血路转移。本发明提供了一种新的治疗肝癌与鼻咽癌的药物，该药物为裂果薯的总皂苷成分。该药物原本应用于咽喉肿痛，胃肠炎，跌打损伤，本发明中首次对其在肝癌与鼻咽癌治疗的机理与应用进行研究，为癌症治疗提供了新的药物储备。该药物有对肿瘤组织有一定的选择性，并能抑制肿瘤微小血管的生成，是一种作用强大的抗肿瘤药物。该提取物抗肿瘤活性强并具有一定的靶向性，经过血清药理学验证，该提取物经过吸收代谢后仍有很强的药物活性，并且该皂苷提取物可抑制肿瘤细胞VEGF、CD34的表达和TPK含量进而抑制肿瘤组织的微血管生成，抑制肿瘤生长。该提取物的植物来源为广西本地特有的植物品种，有较大的开发利用价值，现已有一定种植规模，廉价易得。本发明提供了一种有广阔前景的抗肿瘤提取物，为肿瘤的治疗增添了新的药物。
图1为测定含药血清体外抗肿瘤作用的细胞形态图(100X)。图1-1是30%空白血清细胞图，从图中可以看出，细胞呈正常贴壁生长状态，有重叠生长现象，考虑为血清对细胞的促进生长作用所致，死细胞(漂浮细胞)较少，细胞轮廓清晰，透亮，胞衆中无颗粒；图
1-2、图1-3、分别为30%索拉菲尼含药血清组、30%裂果薯皂苷含药血清组细胞图。与图1-1相比，图1-2、图1-3贴壁细胞变少，细胞生长缓慢，死细胞增多，细胞破碎，有明显碎片悬浮于培养基当中，说明含裂果薯皂苷代谢物血清对肿瘤细胞有抑制作用。图2为药物对裸鼠移植瘤重量的影响，* p<0.01 (与阴性对照组相比)。图3为药物对裸鼠移植瘤体积的影响，* p<0.01 (与阴性对照组相比)。图4是药物作用后经HE染色的细胞显微照片。HE染色后细胞核呈蓝色，类圆形，颜色较浅，坏死区域可见细胞核明显皱缩，变小，颜色较深。三五个肿瘤坏死细胞聚集称为小灶性坏死，小块肿瘤坏死细胞聚集称为灶性坏死，根据坏死区域的大小程度可划分小片状坏死，大片状坏死，大片状坏死区域内仅有散个肿瘤细胞。HE染色结果发现阴性对照组肿瘤细胞基本无细胞坏死现象，血管丰富，数量较多。(见图4-1)。索拉菲尼组可见有大片状坏死，小片状坏死及不同程度的灶性坏死，血管明显塌陷，萎缩，数目变少(见图4-2);裂果薯皂苷高剂量组可见小片坏死，灶性坏死及小灶性坏死(见图4-3);裂果薯皂苷中剂量组可见灶性坏死及小灶性坏死(见图4-4);裂果薯皂苷低剂量组坏死部分较少，可见不同程度小灶性坏死(见图4-5)。裂果薯皂苷高中低剂量组均有不同程度的血管塌缩现象。图4-6为索拉菲尼组大片状坏死图(40X )。图5为不同药物治疗组对人肝癌SMMC-7721移植瘤中MVD的影响，* p〈0.01 (与阴性对照组相比)，* * p< 0.05 (与阴性对照组相比)。图6是不同药物对人肝癌SMMC-7721移植瘤裸鼠⑶34的表达情况影响。1:阴性对照组；2:索拉菲尼组；3:裂果薯皂苷高剂量组；4:裂果薯皂苷中剂量组；5:裂果薯皂苷低剂量组。图7是不同药物治疗组VEGF表达情况。图8是肿瘤组织内VEGF的表达(100 X )，1:阴性对照组；2:索拉菲尼组；3:裂果薯皂苷高剂量组；4:裂果薯皂苷中剂量组；5:裂果薯皂苷低剂量组。VEGF的阳性表达染色呈棕黄色，主要弥漫于肿瘤细胞的胞膜和胞浆，细胞核呈蓝色，无阳性染色。阴性对照组中VEGF呈高表达状态( + + + )，由图(8-1)可看到大区域棕黄色染色。索拉菲尼组、裂果薯皂苷高剂量VEGF低表达(十)，肿瘤区域内有个别细胞呈阳性染色，与阴性对照组相比差异显著。图9为显微镜下(40X )各不同药物组鸡胚血管直观图。1:阴性对照组；2:索拉菲尼组；3:裂果薯皂苷低剂量组；4:裂果薯皂苷中剂量组；5:裂果薯皂苷高剂量组。
具体实施例方式裂果薯总皂苷成分的分离
1.1醇提
将药材粉碎后泡在约3倍体积75%的乙醇溶液中，回流提取2h。抽滤得到滤液。将药渣放回圆底烧瓶中加同样浓度、体积乙醇重复一次。合并两次药液，过滤，浓缩至浸膏，移入干净的瓶中备用。每IOOg干燥药材能提取浸膏约10g，产率为10%。1.2极性段萃取
将上述所得浸膏与适量硅胶混合研磨至成干粉状，置于砂芯漏斗中，安装于抽滤瓶上，加入石油醚抽滤至抽出液无色，收集抽滤所得石油醚溶液旋转蒸发得到石油醚萃取组分，置于60°C烘箱中烘干备用。之后依次加入乙酸乙酯、正丁醇重复以上步骤。共得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三个组分。三组分产率为:石油醚组段20% ;乙酸乙酯组段15% ;正丁醇组段 50%ο1.3大孔吸附树脂处理
将3 6g正丁醇组分溶于50倍体积的50%乙醇，缓慢通过(约I 2秒一滴)150ml的DlOl大孔吸附树脂柱，待液面接近树脂柱顶端时以150倍体积的50%、60%、100%乙醇依次冲洗。收集冲洗液，按不同浓度分别旋转蒸发浓缩，置于60°C烘箱中烘干备用。各洗脱物产率为:50%乙醇洗脱物73% ；60%乙醇洗脱物19% ；100%乙醇洗脱物7%。1.4大孔吸附树脂分离物药效测定
权利要求
1.裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌、抗鼻咽癌中的应用。
2.如权利要求1所述的裂果薯总皂苷提取物，为裂果薯拉丁学名:SChiZ0Capsaplantaginea Hance中提取的总阜苷成分和包含的各阜苷单体化合物成分。
3.如权利要求 1所述的裂果薯总皂苷提取物在抗肝癌、抗鼻咽癌中的应用，其特征在于:在肿瘤细胞中加入和在人肿瘤鼠移植模型中给予所述的裂果薯总皂苷提取物。
全文摘要
本发明属于医药领域，提供了一种天然植物裂果薯及其总皂苷提取物的应用。该天然植物提取物为裂果薯(拉丁学名SchizocapsaplantagineaHance)的总皂苷。本发明提供了裂果薯总皂苷提取物的提取技术和在抗肝癌、抗鼻咽癌治疗方面的应用。该提取物抗肿瘤活性强并具有一定的靶向性，经过血清药理学验证，该提取物经过吸收代谢后仍有很强的药物活性，并且该皂苷提取物可抑制肿瘤细胞VEGF、CD34的表达进而抑制肿瘤组织的微血管生成，抑制肿瘤生长。该提取物的植物来源为广西本地特有的植物品种，有较大的开发利用价值，有一定种植规模，廉价易得。本发明提供了一种有广阔前景的抗肿瘤提取物，为肿瘤的治疗增添了新的药物。
文档编号A61P11/02GK103142774SQ20131007295
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者梁钢, 孙悦文, 唐安洲 申请人:广西医科大学