一种乌贼墨抗前列腺癌多肽及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种乌贼墨抗前列腺癌多肽及其制备方法，所述乌贼墨抗前列腺癌多肽的氨基酸序列为序列表中的SEQIDNo.1。本发明安全性好，反应条件温和，过程控制容易，所得乌贼墨抗前列腺癌多肽纯度高，对前列腺癌PC-3细胞有明显的增殖抑制作用，且随着作用的时间和用药浓度的增加，抗前列腺癌细胞增殖的抑制率也明显增加，具有较好的医学应用价值。
【专利说明】一种乌贼墨抗前列腺癌多肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程【技术领域】，特别涉及一种乌贼墨抗前列腺癌多肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]乌贼属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科。像其他的头足类一样，通过喷射黑色的墨汁防御外敌，乌贼的营养丰富，除可食用外，还具有很好的药用价值。尤其是乌贼的墨汁，早在《本草拾遗》中就有“腹中墨，主治血刺心痛”的记载。乌贼墨囊一般是作为废弃物。上世纪90年代，日本学者(Sasaki J, Ishita K, Takaya Y, et al.Ant1-tumor activity ofsquid ink[J].Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 1997，43 (4):455)从乌贼墨中分离出一种具有很好抗肿瘤作用的提取物。然后，乌贼墨逐渐成为研究者的关注热点，近年来，乌贼墨中的提取物所具有的功能活性被研究者们广泛开发，研究。比如，抗氧化、降血压、抗菌性、抗溃疡等等。科学家们对其抗肿瘤活性进行研究，发现其具有多种抗肿廇机制，比如乌贼墨有提高免疫功能，诱生细胞因子，诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞生长的作用等等。在国内研究乌贼墨抗肿瘤作用的学者有很多，我们可以参考《中国药师》2003年第6卷第10期，李孝东和袁建华所著的“乌贼墨抗肿瘤机制研究进展”，《中国海洋药物杂志》2012年第31卷第5期，张倩和张建民所著的“乌贼墨抗肿瘤活性研究进展”。这些充分显示了乌贼墨在抗肿瘤药物开发具有十分显著的潜在价值，因此挖掘其潜在的药用价值对充分利用海洋资源、扩大药源也有深远意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的之一在于提供一种乌贼墨抗前列腺癌多肽，对前列腺癌PC-3细胞有明显的增殖抑制作用，具有较好的医学应用价值。
[0004]本发明的目的之二在于提供一种乌贼墨抗前列腺癌多肽的制备方法，安全性好，反应条件温和，过程控制容易，所得乌贼墨抗前列腺癌多肽纯度高，对前列腺癌PC-3细胞有明显的增殖抑制作用，具有较好的医学应用价值。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种乌贼墨抗前列腺癌多肽，所述乌贼墨抗前列腺癌多肽的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID N0.1。
[0006]SEQ ID N0.1:LKYYDDESTQHGAKRMVPYKIFLNRAATRG。
[0007]一种乌贼墨抗前列腺癌多肽的制备方法，所述的制备方法步骤如下:
(1)将鲜乌贼墨原料匀浆得乌贼墨浆料；
(2)按照每克乌贼墨浆料加0-3ml超纯水的配比，将乌贼墨浆料与超纯水混匀，调节pH2.0-3.5，按照每克乌贼墨浆料加300-1200U的加酶量加入胃蛋白酶，30_45°C酶解2_8小时得酶解液；
(3)酶解液灭活，离心，取上清液，经超滤获得分子量大于3kd小于等于5kd的活性组分；
(4)将分子量大于3kd小于等于5kd的活性组分经SephadexG-25层析分离，于280nm波长下检测，收集所得吸收峰，冷冻干燥；
(5)对得到的吸收峰进行体外抗肿瘤实验筛选，获得抗前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制率最高的吸收峰即为乌贼墨抗前列腺癌多肽。
[0008]步骤(4)、(5)具体操作为:将分子量大于3kd小于等于5kd的活性组分用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.22μπι微孔滤膜，取滤液过Sephadex G_25柱，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱，于280nm波长下检测，得到三个峰，收集所得吸收峰，冷冻干燥，经体外抗肿瘤实验筛选，得到抗前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制率最高的第二吸收峰，收集第二吸收峰。
[0009]作为优选，步骤(2)中按照每克乌贼墨浆料加l_3ml超纯水的配比。
[0010]作为优选，步骤(2)中40_45°C酶解4-8小时得酶解液。
[0011]本发明的有益效果是:安全性好，反应条件温和，过程控制容易，所得乌贼墨抗前列腺癌多肽纯度高，对前列腺癌PC-3细胞有明显的增殖抑制作用，且随着作用的时间和用药浓度的增加，抗前列腺癌细胞增殖的抑制率也明显增加，具有较好的医学应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是分子量大于3kd小于等于5kd的活性组分的G-25凝胶层析色谱图；
图2是本发明乌贼墨抗前列腺癌多肽的高效液相图。
【具体实施方式】
[0013]下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0014]本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0015]1、材料
1.1材料:乌贼购于舟山南珍菜市场。
[0016]1.2细胞株:人前列腺癌细胞株PC-3株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。
[0017]1.3主要试剂:HamF12培养基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；CCK-8，(WST)日本同仁化学研究所；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，胰蛋白酶，北京亚太恒信科技公司；福林酚，上海如吉生物发展有限公司。
[0018]1.4主要仪器:
SSW-420-2S恒温水浴锅，上海民仪电子有限公司；
BSff-1OO-ZCD自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；
BT1-100恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；
PHS-250PH计，上海理达仪器厂；
CF16RXII日立低温离心机，日本日立公司；
DS-1组织捣碎机，上海标本模型厂；
UV-1600PC 上海美谱达有限公司；
LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；高效液相色谱仪(1260安捷伦)，agilent ；
G-25分子筛凝胶，上海如吉生物发展有限公司；
超滤杯、超滤膜，上海摩速科学器材有限公司；
超净台Forma3111,上海智城分析仪器制造有限公司；
细胞培养箱ZHJM-C12090，杭州宝城生物科技有限公司；
酶标仪(美国BIO-RAD);杭州宝城生物科技有限公司；
微量震荡器，上海精密仪器有限公司。
[0019]2、方法
2.1细胞培养:人前列腺癌PC-3细胞接种于含10% (体积分数)FBS、双抗溶液(青霉素G100IU/ml、链霉素100IU/ml)的HamF12培养基中，置于37°C、5%C02、95%饱和湿度条件下的孵箱中常规培养，细胞贴壁生长，每2-3天换液I次，当细胞生长汇合时，按1:3传代，每周传代1-2次。用0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA混合消化液消化，收集对数生长期细胞进行实验。
[0020]2.2细胞增殖抑制试 验(CCK-8法):将PC_3细胞以每孔5 X IO3个细胞数接种于96孔培养板中，每孔培养液200 μ L。贴壁生长后，每组细胞分别加入一定浓度乌贼墨提取物溶液(可以是酶解产物、超滤得到的五种组分、乌贼墨抗前列腺癌多肽)，对照组加入等体积培养液(培养液即2.1节中含10% (体积分数)FBS、双抗溶液(青霉素G100IU/ml、链霉素100IU/ml)的HamF12培养基)，每个浓度设6个复孔。置于37 °C, 5% C02条件下分别孵育24h。每孔加入CCK-8溶液IOyL,置37°C，5% C02条件下继续孵育4h终止培养。选择450nm波长，在酶标仪上测定各孔光密度值D450，重复实验3次。按下列公式计算细胞抑制率:肿瘤细胞抑制率(％)=(对照组D450-用药组D450)/对照组D450X 100%。
[0021]2.3酶活力的测定
酶活力按Folin-酚法作测酶活力，酶活力分别为:胃蛋白酶73400U/g，碱性蛋白酶169000 U /g，木瓜蛋白酶48000 U /g，胰蛋白酶69000 U /g。
[0022]2.4样品提取方法:
2.4.1酶解样品的制备:将新鲜乌贼墨原料匀浆，称取IOg乌贼墨浆料。用氢氧化钠和盐酸调节pH值，加入蛋白酶，在水浴箱中酶解，90°C灭活15min，低温离心机10000 r/min离心10min，取上清液，超滤，冷冻干燥得样品粉末。
[0023]2.4.2 4种蛋白酶水解条件的确定:酶解工艺中有许多影响因素，除底物浓度、加酶量外，反应温度、反应时间、PH等对抗前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制率具有不同程度的影响。以抗前列腺癌细胞PC-3增殖的抑制率为指标，以料液比(即乌贼墨浆料:超纯水，w/v)、pH、时间、加酶量、温度为五因素，采用L16(45)正交实验确定酶解的最佳反应条件。各酶的因素与水平如下四个表格:
表1碱性蛋白酶的因素与水平
【权利要求】
1.一种乌贼墨抗前列腺癌多肽，其特征在于:所述乌贼墨抗前列腺癌多肽的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID N0.1。
2.一种乌贼墨抗前列腺癌多肽的制备方法，其特征在于:所述的制备方法步骤如下: (1)将鲜乌贼墨原料匀浆得乌贼墨浆料； (2)按照每克乌贼墨浆料加0-3ml超纯水的配比，将乌贼墨浆料与超纯水混匀，调节pH2.0-3.5，按照每克乌贼墨浆料加300-1200U的加酶量加入胃蛋白酶，30-45°C酶解2-8小时得酶解液； (3)酶解液灭活，离心，取上清液，经超滤获得分子量大于3kd小于等于5kd的活性组分； (4)将分子量大于3kd小于等于5kd的活性组分经SephadexG-25层析分离，于280nm波长下检测，收集所得吸收峰，冷冻干燥； (5)对得到的吸收峰进行体外抗肿瘤实验筛选，获得抗前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制率最高的吸收峰即为乌贼墨抗前列腺癌多肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中按照每克乌贼墨浆料加1-3ml超纯水的配比。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中40-45°C酶解4_8小时得酶解液。
【文档编号】A61P35/00GK103897050SQ201310176983
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】丁国芳, 景奕文, 杨最素, 黄芳芳, 曾丽, 张国梅, 李连军, 滕芳芳, 郁迪 申请人:浙江海洋学院