专利名称：一种高效提取乌贼墨酸性多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种多糖的提取方法，具体涉及一种闻效提取乌贼墨酸性多糖的方法，属于功能性保健食品或生物医药领域。
背景技术：
多糖是存在于自然界中资源较为丰富的糖类，广泛存在于植物、动物和微生物等有机体中。多糖作为一种几乎无毒副作用的天然高分子提取物，在许多疾病的预防和治疗方面，特别是一些顽固病、疑难病，如肿瘤、免疫力低下、高血糖、衰老、病毒性疾病等方面，有其自身独特的功效。随着科学技术的不断进步，以及分子生物学和新药物资源的研究与发展，多糖的研究越来越受到广泛的重视，而多糖的研究报告也在逐年递增。国内外学界普遍认为，正如蛋白质、核酸时代那样，21世纪是“多糖生命科学”的时代。
由于多糖具有多种多样的生物活性功能以及在功能食品和临床上广泛使用，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点，到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离出来。然而，随着陆地中草药资源的日益匮乏，人类已将活性多糖的研究视角伸向广袤且储量丰富的海洋资源。乌贼是中国四大海产之一，近年来仅曼氏无针乌贼的年产量就达7万吨。乌贼墨囊约占其总比例10%，每年总量可达7千吨。在我国，乌贼墨囊一直作为废弃物，造成资源浪费和环境污染。我国医药对乌贼墨的认识与应用历史悠久，最早见于明代的《本草纲目》，主要用于治疗心绞痛。现代研究证实乌贼墨具有广泛的生物学作用，如止血和治疗妇科病、抗肿瘤、抗氧化、抗辐射、抗反转录病毒、抗菌、降血脂和升白等作用。近年来，我们发现乌贼墨具有较强的缓解化疗药物的毒副作用，弱化化疗药物对机体正常组织器官的毒性损伤。我们充分的前期研究结果和少量其他研究报道表明，多糖是乌贼墨中主要的活性成分，并且我们已经证实多糖具有明显的化疗保护作用。现已证明，多糖之所以具有广泛的生物学功效，与其中所含酸性多糖直接相关，酸性多糖是其发挥功能的主要成分，甚至有报道认为，多糖中所含硫酸基团的多少决定了该多糖的功能强弱。乌贼墨是一种储量丰富但被食品加工行业所废弃的海洋活性物质，尽管目前已有少量的研究涉及其活性，甚至对其中多糖成分的活性研究，但对于其主要活性成分酸性多糖的提取制备及其生物学功能尚未见报道。在全球陆地资源日益珍贵的今天，从陆生植物开发天然活性多糖由于栽培的地理要求较严、产量低、原料价格高等因素，使得各种天然活性多糖的应用受到极大的限制，相对而言，海藻资源不会占用农业用地，天然资源丰富，养殖成本较低，因此，乌贼墨资源的开发利用必将大有作为。因此，开发乌贼墨不仅可以变废为宝获得经济效益，还能改善环境取得良好的社会效益，更重要的是药源丰富，挖掘其潜在药用价值对于充分利用海洋资源，扩大药源具有深远意义与广阔的前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、稳定、简便的乌贼墨酸性多糖的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案是
一种高效提取乌贼墨酸性多糖的方法，包括如下步骤所述的乌贼墨酸性多糖是以乌贼墨为原料，解冻冻存的乌贼墨，用乙酸乙酯混匀，超声波处理；抽滤去乙酸乙酯，冷冻干燥获得黑色粉末；人工神经网络技术优化木瓜蛋白酶酶解参数，酶解物去蛋白后乙醇沉淀，冷冻干燥后即获得酸性多糖，具体步骤如下
(1)在3_5°C条件下解冻乌贼墨，与等体积的乙酸乙酯混匀，所述体积单位为毫升；
(2)将步骤(I)获得的混合物超声波处理，处理时间为4-6s，间隔8-12s，处理次数为15-25 次；
(3)将步骤(2)所得物于3-5°C条件下搅拌6-10h，用减压抽滤法去除乙酸乙酯，冷冻干燥处理得黑色乌贼墨粉末； (4)用木瓜蛋白酶酶解乌贼墨粉末，沸水浴灭活蛋白酶lOmin，离心后得上清液，上清液中加入氯仿/正丁醇混合液，磁力搅拌器搅拌20min,搅拌速度为1000 rpm,离心得上清液，上清液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀冷冻干燥，即得乌贼墨酸性多糖；所述的木瓜蛋白酶和乌贼墨粉末的质量比为木瓜蛋白酶乌贼墨粉末=5 95 ;所述的上清液中加入氯仿/正丁醇(V/V=4/l)混合液的体积为上清液总体积的1/4 ;所述的上清液中加入氯仿/正丁醇混合液中两者的比例为氯仿/正丁醇=4/1 ;所述的用木瓜蛋白酶酶解乌贼墨粉末的工艺参数采用人工神经网络技术优化，其最佳处理参数为PH 7. O、酶解时间为7h，酶解温度为52 °C，料液比为 I g/35ml ；
一种采用上述方法制备的乌贼墨酸性多糖；
所述的采用人工神经网络技术，根据Box-behnken实验设计对各项影响提取效率的因素进行优化。根据JMP软件的神经网络平台及试验数据，选择“K折叠”交叉验证的方法拟合响应目标，交叉验证组数K为5，过拟合罚项O. 001，历程数20，最大迭代数50，收敛准则
O.00001。通过模型的决定系数R2及交叉验证R2值确定隐藏节点数。通过对2-7个隐藏节点进行模型训练，每次重复5次，显示R2值随着隐藏节点数的增加而增加，并趋近于1，交叉验证R2先增加后下降，说明在隐藏节点超过3会出现拟合过度，而小于3导致拟合不足，因此选择隐藏节点数为3，采用3X3X1结构的三层神经网，即3个输入神经元，分别代表pH(Xl)、酶解时间(X2)、料液比(X3)，3个隐藏节点，I个输出神经元，代表多糖的提取率Y。
图1为乌贼墨酸性多糖的提取流程；
图2为不同隐藏节点模型的R2及交叉验证R2 ；
具体实施例方式下面结合附图和实施例以及试验数据来对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例1
人工神经网络技术优化制备工艺
(I)取冷冻的乌贼墨4°C下解冻，加入等体积乙酸乙酯，超声波处理(处理时间5s，间隔10s，次数20次)，浸泡8h;(2)采用减压抽滤去除浸泡的有机溶剂乙酸乙酯，将乌贼墨冷冻干燥处理得黑色粉
末；
(3)根据Box-behnken试验设计,如表1、2;
(4)称取Ig的乌贼墨粉末，直接加入5%的木瓜蛋白酶粉剂(相对乌贼墨粉末的重量而言)，在52°C条件下，按上述设计方案加入料液比，调节pH，控制酶解时间；
(5)酶解时间到后在沸水浴下灭酶IOmin,离心(5000rpm,IOmin) 2-3次去除沉淀；
(6)采用Sevag法去除蛋白(即加入1/4体积的氯仿/正丁醇，体积比4在磁力搅拌器上摇匀20min，5000rpm离心lOmin，取上清液得到亮黄色的多糖液；
(7)采用50ml的比色管将得到的各个不同体积的乌贼墨多糖定容到50ml，采用蒽酮-硫酸法测定溶液中乌贼墨多糖的含量，并计算得率；
(8)通过模型的决定系数R2及交叉验证R2值确定隐藏节点数如图2；R2到达了 O. 99以上，说明实际值与预测值具有很好的相关性。表I为Box-Behnken试验设计因素水平表
权利要求
1.一种高效提取乌贼墨酸性多糖的方法，其特征在于所述的乌贼墨酸性多糖是以乌贼墨为原料，解冻冻存的乌贼墨，用乙酸乙酯混匀，超声波处理；抽滤去乙酸乙酯，冷冻干燥获得黑色粉末；人工神经网络技术优化木瓜蛋白酶酶解参数，酶解物去蛋白后乙醇沉淀，冷冻干燥后即获得酸性多糖，具体步骤如下 (1)在3-5°C条件下解冻乌贼墨，与等体积的乙酸乙酯混匀； (2)将步骤(I)获得的混合物超声波处理，处理时间为4-6s，间隔8-12s，处理次数为15-25 次； (3)将步骤(2)所得物于3-5°C条件下搅拌6-10h，用减压抽滤法去除乙酸乙酯，冷冻干燥处理得黑色乌贼墨粉末； (4)用木瓜蛋白酶酶解乌贼墨粉末，沸水浴灭活蛋白酶lOmin，离心后得上清液，重复2次，上清液中加入氯仿/正丁醇混合液，磁力搅拌器搅拌20min，搅拌速度为1000 rpm,离心得上清液，上清液中加入4倍体积的无水乙醇，沉淀冷冻干燥，即得乌贼墨酸性多糖。
2.根据权利要求1所述的一种高效提取乌贼墨酸性多糖的方法，其特征在于步骤(4)所述的木瓜蛋白酶和乌贼墨粉末的质量比为木瓜蛋白酶乌贼墨粉末=5 95o
3.根据权利要求1所述的一种高效提取乌贼墨酸性多糖的方法，其特征在于步骤(4)所述的上清液中加入氯仿/正丁醇(V/V=4/l)混合液的体积为上清液总体积的1/4。
4.根据权利要求1或3所述的一种高效提取乌贼墨酸性多糖的方法，其特征在于步骤(4)所述的上清液中加入氯仿/正丁醇混合液中两者的比例为氯仿/正丁醇=4/1。
5.根据权利要求1或3所述的一种高效提取乌贼墨酸性多糖的方法，其特征在于步骤(4)所述的用木瓜蛋白酶酶解乌贼墨粉末的工艺参数采用人工神经网络技术优化，其最佳处理参数为pH 7.0、酶解时间为711，酶解温度为521，料液比为I g/35ml。
6.一种采用权利要求1所述的方法制备的乌贼墨酸性多糖。
全文摘要
本发明涉及一种高效提取乌贼墨酸性多糖的方法，该方法是将冻存的乌贼墨解冻，用乙酸乙酯混匀后超声波处理，浸泡，减压抽滤去乙酸乙酯，冷冻干燥得乌贼墨粉末；再将该粉末用木瓜蛋白酶在最佳参数条件下酶解，灭酶，去蛋白，用无水乙醇沉淀，冷冻干燥后即获得乌贼墨酸性多糖；本发明利用神经网络技术优化提取参数，结合木瓜蛋白酶酶解技术，实现了高效制备乌贼墨酸性多糖，相对提取效果达到91.4%；本方法操作简单方便，提取率高，为今后乌贼墨酸性多糖的开发研究提供理论依据，也将更好的促进乌贼墨酸性多糖在医药，功能保健食品等方面的开发，具有广泛的市场前景。
文档编号C08B37/00GK103012615SQ201310005080
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者罗萍 申请人:广东海洋大学