具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物，即具有改良的血清半衰期的药物融合体和缀合物。这些融合体和缀合物包含免疫球蛋白（抗体）单个可变结构域和促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子。本发明另外涉及包含这样的药物融合体和缀合物的应用、制剂、组合物和装置。本发明也涉及组合物，其包含超过一个作为融合体或缀合物的一部分而存在的促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子，也涉及所述组合物的应用和制剂。
【专利说明】具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物
[0001] 本申请是申请日为2010年9月23日的中国专利申请201080053892. 1"具有延长 的半衰期的药物融合体和缀合物"的分案申请。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及具有改良的血清半衰期的药物融合体和缀合物。这些融合体和缀合物 包含免疫球蛋白（抗体）单个可变结构域和促胰岛素（insulinotropic)分子和/或肠降血 糖素（incretin)和/或肠肽（gut peptide)分子。本发明另外涉及包含这样的药物融合 体和缀合物的应用、制剂、组合物和装置。本发明也涉及组合物，其包含超过一个作为融合 体或缀合物的一部分而存在的促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子，也涉及所 述组合物的应用和制剂。
【背景技术】
[0003] 许多药物具有能用于治疗和/或诊断目的的活性，但由于给药时，它们迅速地从 机体清除，因此具有有限的价值。例如，许多具有治疗用途活性的多肽通过肾脏迅速地从循 环中清除。因此，为了获得想要的治疗效果或频繁的给药方案，必须施用大剂量。需要具有 改良的药代动力学性质的改良的治疗剂和诊断剂。
[0004] 一类这样的在体内或体循环中具有短半衰期的药物是肠降血糖素激素诸如胰高 血糖素-样肽1以及艾塞那肽（exendin)(例如艾塞那肽-4)和其它肠肽诸如PYY。
[0005] 胰高血糖素-样肽（GLP) -1是一种肠降血糖素激素，具有有效的葡萄糖-依赖 性的促胰岛素作用和胰高血糖素抑制（glucagonostatic)作用、对胰腺β细胞的营养作 用和对胃肠分泌和运动的抑制作用，这些结合起来来降低血浆葡萄糖和减小血糖波动幅 度。此外，通过其提高饱腹感的能力，GLP-1会降低摄食量，因此限制体重增加，甚至可以引 起体重减轻（Drucker (2002) 122:531-544，Giorgiano 藥乂（2006) Diabetes Research and Clinical Practice 74:S152-155), Holt (2002) Diabetes/ TfesearcA 18:430-441)。总之，这些作用会赋予 GLP-1 独特的 特征，被认为用作抗糖尿病剂是相当理想的，特别是由于其抗高血糖作用的葡萄糖依赖性 会使严重低血糖的任何风险最小化。然而，它的药代动力学/药效动力学特征使得天然 GLP-1在治疗上是无用的。因此，尽管连续给药时GLP-1最有效，但是单次皮下注射具有短 期效果。GLP-1对体内酶降解是高度敏感的，二肽基肽酶IV (DPP-IV)的裂解可能是最相关 的，因为这快速发生，并产生非促胰岛素的代谢物（Metlein (1999) TfegWaioiT 85:9-244)。因此，基于对影响其代谢稳定性和药代动力学/药效动力学特征的因素的理 解，利用GLP-1的治疗潜能的策略已经成为热切研究的焦点。
[0006] 已经进行了广泛的工作，尝试以使其降解减缓同时仍然保持生物活性的方式抑制 肽酶或修饰GLP-1。W005/027978公开了具有延长作用特征的GLP-1衍生物。W002/46227 公开了异种融合蛋白，其包括与GLP-1或类似物融合的多肽(例如，白蛋白）（这些类似物的 公开内容通过引用并入本文，作为可用于本发明中的GLP-1类似物的实例）。W005/003296、 W003/060071、W003/059934公开了氨基融合蛋白，其中GLP-1已经与白蛋白融合，以尝试增 加激素的半衰期。
[0007] 肽YY是由神经内分泌细胞响应于饲喂而释放的一种短（36个氨基酸）蛋白。循 环中的PYY浓度在餐后增加，并在禁食时降低。它通过NPY受体发挥它的作用，从而抑制胃 能动性和增加结肠中的水和电解质吸收。它由回肠和结肠中的神经内分泌细胞响应于膳 食而分泌，且已经被证实会减少食欲（Ballantyne (2006) Sarge/y 16:651-658， Batterham (2003) New England Journal of Medicine 349:941-8, Boey (2007) Peptides 28:390-395, Karra (2009) Journal of Physiology 587:19-25)〇
[0008] 艾塞那肽-4是在钝尾毒蜥（Gila monster)的唾液中发现的一种激素。它是GLP-1 的激动剂，并且还具有非常有效的促胰岛素效应。与GLP-1相比，艾塞那肽-4具有远远更 长的体内半衰期。
[0009] 在葡萄糖代谢和胰岛素分泌的调节中，它表现出与人胰高血糖素-样肽-1 (GLP-1)类似的生物学性质。艾塞那肽-4会增加胰腺β-细胞的葡萄糖-依赖性 的胰岛素分泌，抑制不适当地升高的胰高血糖素分泌，并减慢胃排空（DeFr〇nZ〇#U Diabetes Care 28:5:1092-100, Edwards 4r yi (2001)American Journal of Physiology:Endocrinology and Metabolism 281 :E155_162, Kolterman 攀 yl (2003) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 88(7) :3082-9, Nielsen Regulatory Peptides \\?'.---视。
[0010] 在医学领域，存在对改良的组合物的巨大需求，所述组合物包含肠降血糖素和/ 或促胰岛素剂和/或肠肽剂(诸如GLP-1肽、PYY、艾塞那肽）或具有促胰岛素作用和/或肠 降血糖素作用和/或减食欲作用的其它药剂，且其可以用于医学中，例如用于治疗和/或预 防代谢病症诸如糖尿病和肥胖症。
[0011] 因而需要提供新的治疗性组合物，其包含含有肠降血糖素/促胰岛素分子/肠肽 的药剂(例如GLP-1、艾塞那肽-4、PYY)，以提供更有效的和更长持续时间的体内作用，同时 维持它们的低毒性和治疗益处。
【发明内容】
[0012] 本发明因而提供了 ：（a)组合物，所述组合物包含单个分子(例如单个融合体或缀 合物）（或由其组成)，所述单个分子包含选自肠降血糖素和/或促胰岛素剂和/或肠肽的 分子的组合(即2种或更多种)，它们例如作为融合体(化学的或遗传的)或作为缀合物存在； 或者，（b)组合物，所述组合物包含2种或更多种单独的分子，其中每种单独的分子包含一 种或多种肠降血糖素和/或促胰岛素剂和/或肠肽。这些组合物（a)和/或（b)也可以包 含其它蛋白或多肽，例如延长半衰期的蛋白或多肽或肽，例如其可以结合血清白蛋白（例如 人血清白蛋白），例如dAb (结构域抗体)，例如结合血清白蛋白（例如人血清白蛋白）的dAb (Albudab ?)。
[0013] 在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含单个融合体(化学 的或遗传的）或单个缀合物分子(或由其组成)，其中所述融合体或缀合物包含下述分子，或 由其组成：（a) 2种或更多种分子，所述分子选自：促胰岛素分子和/或肠降血糖素分子和 /或肠肽(例如肽YY (PYY)肽、3-36 PYY、艾塞那肽-4、GLP例如GLP-1例如GLP-1 (7-37) A8G突变体)，它们作为与（b)的单个融合体或缀合物存在，（b)结构域抗体（dAb)，其特异性 地结合血清白蛋白（例如DOM 7h-14 (Vk)结构域抗体（dAb)(DOM 7h-14的氨基酸序列显示 为图 1 (h): SEQ ID NO 8)，或例如 DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb) (DOM 7h-14-10 的氨基酸序列显示为图1 (〇): SEQ ID NO 15,或DOM 7h-ll-15 (DOM 7h-ll-15的氨基酸 序列显示为图1 (P): SEQ ID NO 16)，或例如具有R108C突变的DOM 7h-14 -10(Vk)结 构域抗体（dAb) (DOM 7h-14-10 R108C的氨基酸序列显示为图1 (r)SEQ ID NO 18)，或例 如DOM 7h-ll -15(Vk)结构域抗体（dAb)，或例如具有R108C突变的DOM 7h-ll -15(Vk) 结构域抗体（dAb) (DOM 7h-ll-15 R108C的氨基酸序列显示为图1 (t): SEQ ID NO 47)。 在一个实施方案中，所述融合体或缀合物不是2xGLP-l (7-37) A8G D0M7h-14 dAb融合体 (DAT0114,具有图1 (a) : SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列）。
[0014] 在另一个实施方案中，所述单个融合体或缀合物包含下述分子，或由其组成：PYY (例如ΡΥΥ 3-36)和艾塞那肽(例如艾塞那肽-4)和一种或多种结合血清白蛋白（例如人血 清白蛋白）的dAb，例如本文所述的Albudab?中的任一种。在一个实施方案中，所述单个融 合体具有图1 (u) : SEQ ID N0 48所示的氨基酸序列。
[0015] 在另一个实施方案中，本发明另外提供了组合物，以及当它们单独施用时或与任 意合适的药用赋形剂或添加剂一起配制时，它们的应用（例如用于本文中关于组合所述的 任意用途）；所述组合物包含本文所述的或公开的单独的融合体或缀合的分子中的任一种， 或由其组成。
[0016] 本发明也提供了核酸，其编码本文所述的任意单独的融合体。
[0017] 在上述方面的一个实施方案中，所述肠降血糖素/促胰岛素分子/肠肽分子可以 是不同的肠降血糖素/促胰岛素分子/肠肽分子，或它们可以是相同的。结合血清白蛋白的 dAb (即 AlbudAb ?)也可以是在例如 TO 2006/059106 或 TO 05/118642 或 TO 2008096158 或PCT/EP2009/053640或USSN 61/163, 990中描述或提及的那些中的任一种。
[0018] 在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种组合物，所述组合物包含2种或更 多种单独的融合体或缀合物(或由其组成)，且其中每种单独的融合体或缀合物包含下述分 子，或由其组成：（a)-种或多种分子，所述分子选自：促胰岛素分子和/或肠降血糖素分子 和/或肠肽(例如PYY肽、3-36 PYY、艾塞那肽-4、GLP例如GLP-1例如GLP-1 (7-37) A8G 突变体)，它们作为与（b)的融合体或缀合物存在，（b)结构域抗体（dAb)，其特异性地结合 血清白蛋白（例如DOM 7h-14 (Vk)结构域抗体（dAb) (DOM 7h-14的氨基酸序列显示为图 1 (h): SEQ ID N0 8)，或例如 DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb) (DOM 7h-14-10 的氨 基酸序列显示为图1 (〇): SEQ ID NO 15,或DOM 7h-ll-15 (DOM 7h-ll-15的氨基酸序列 显示为图1 (P): SEQ ID NO 16)，或例如具有R108C突变的DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗 体（dAb) (DOM 7h-14-10 R108C的氨基酸序列显示为图1 (r)SEQ ID NO 18)，或例如DOM 7h-ll -15(Vk)结构域抗体（dAb)，或例如具有R108C突变的DOM 7h-ll -15(Vk)结构域抗 体（dAb) (DOM 7h-ll-15 R108C的氨基酸序列显示为图1 (t) : SEQ ID NO 47)。在一个 实施方案中，该组合物可以包含一种或多种选自下述的分子：在图la-lg和图lm-lV和还在 图3中的那些，还有以及Dom7h-ll-15 (R108C) - PEG - 3-36 PYY (赖氨酸在位置10)分 子(其具有图3所示的结构，但是所述AlbudAb组分是Dom7h-ll-15 (R108C) AlbudAb)。
[0019] 这样的包含2种或更多种如上所述的融合体或缀合物(或由其组成)的组合物可以 是组合的制备物，所述制备物用于同时地、分开地或相继地用于治疗中，例如用于治疗或预 防代谢病，诸如高血糖症、葡萄糖耐受不良、β细胞缺乏、糖尿病(例如I型或π型糖尿病 或妊娠糖尿病)、非酒精性脂肪变态性肝病（steatotic liver disease)、多囊卵巢综合征、 高脂血症或肥胖症或特征在于进食过量的疾病，和/或用于调节能量消耗。
[0020] 当一起或顺序地施用时，本发明的融合体或缀合物可以表现出协同作用（协同作 用是指，当施用时它们的作用超过当单独施用时各自的简单累加作用)，例如作为组合的制 备物，用于同时地、分开地或相继地用于治疗中，例如用于治疗或预防代谢病，诸如高血糖 症、葡萄糖耐受不良、β细胞缺乏、糖尿病(例如I型或Π 型糖尿病或妊娠糖尿病)、非酒精 性脂肪变态性肝病、多囊卵巢综合征、高脂血症或肥胖症或特征在于进食过量的疾病，和/ 或用于调节能量消耗。
[0021] 协同作用也可以源自超过一个肠降血糖素或促胰岛素分子或肠肽在一个分子上 的存在，或源自AlbudAb和肠降血糖素或促胰岛素分子或肠肽的相互作用。
[0022] 在根据本发明的任一种组合物中，所述肠降血糖素和/或促胰岛素分子和/或 肠肽可以选自例如：PYY肽，例如3-36或13-36 ;艾塞那肽-4, GLP例如GLP-1例如GLP-1 (7-37) A8G突变体，或它们可以是这些肽的突变体、类似物或衍生物，例如它们可以保留肠 降血糖素/促胰岛素活性。GLP、PYY、艾塞那肽可以是在W0 2006/059106中描述的那些中 的任一种。这些肽的突变体、类似物或衍生物可以是保留肠降血糖素和/或促胰岛素活性 的那些。
[0023] 当作为与dAb的融合体(或缀合物）存在时，促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/ 或肠肽分子(例如PYY、艾塞那肽、GLP-1等）可以连接至所述dAb的N-端或C-端，或连接 在dAb序列内的某点处。在一个实施方案中，一种或多种肠降血糖素和/或促胰岛素分子 和/或肠肽分子作为与dAb的N端的融合体(或缀合物）存在，并且一种或多种肠降血糖素 和/或促胰岛素分子和/或肠肽分子也作为与dAb的C端的融合体(或缀合物）存在。
[0024] 氨基酸连接物或化学连接物也可以任选地存在，其连接促胰岛素分子和/或肠降 血糖素和/或肠肽分子(例如艾塞那肽-4和/或GLP-1)与例如dAb。所述连接物可以是例 如螺旋连接物，例如图l(k): SEQ ID N0 11所示的序列的螺旋连接物，或它可以是gly-ser 连接物，例如具有在图1 (1) : SEQ ID NO 12中所示的氨基酸序列。
[0025] 或者，所述连接物可以是例如PEG连接物，例如在图3中所示的PEG连接物。
[0026] 在某些实施方案中，本发明的融合体(或缀合物）可以包含其它分子，例如其它肽 或多肽。
[0027] 在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含下述2种单独的 分子，或由其组成： (a) 遗传融合体，它是：艾塞那肽-4、（G4S) 3连接物、7h-14 AlbudAb (DAT 0115,其具 有在图lb:SEQID NO 2中所示的氨基酸序列）；和 (b) 肽缀合物，它是：经由赖氨酸(导入在PYY的第10位）和4个重复的PEG连接物与 C-端酰胺化的PYY3-36缀合的Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb。直线代表连接物，该连接 物共价地连接至Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb的游离C端半胱氨酸和在PYY序列的第10 位处的赖氨酸。该肽缀合物的氨基酸序列和结构如下(且也显示在图3中）：
【权利要求】
1. 一种组合物，所述组合物包含单个融合体或缀合物，其中所述融合体或缀合物包含 下述分子，或由其组成：（a)至少2种分子，所述分子选自：促胰岛素分子和/或肠降血糖素 和/或肠肽分子，且它们作为与（b)的融合体或缀合物存在，（b)蛋白或肽，其延长所述促胰 岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子的半衰期。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述延长半衰期的蛋白或肽是结合血清白蛋 白、例如人血清白蛋白的蛋白或肽。
3. 根据权利要求2所述的组合物，其中所述延长半衰期的蛋白包含特异性地结合血清 白蛋白、例如人血清白蛋白的结构域抗体（dAb )。
4. 一种组合物，所述组合物包含至少2种单独的融合体或缀合物，且其中每种单独的 融合体或缀合物包含下述分子，或由其组成：（a) -种或多种分子，所述分子选自：促胰岛 素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子；其作为与（b)的融合体或缀合物存在，（b)蛋白 或肽，其延长所述促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子的半衰期。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其中所述延长半衰期的蛋白或肽是结合血清白蛋 白、例如人血清白蛋白的蛋白或肽。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述延长半衰期的蛋白包含特异性地结合血清 白蛋白、例如人血清白蛋白的结构域抗体（dAb )。
7. 根据任一项前述权利要求的组合物，其中所述促胰岛素分子和/或肠降血糖素中的 至少一种选自：GLP-1、PYY、艾塞那肽；或是它们的功能变体、类似物、突变体或衍生物的保 留促胰岛素分子和/或肠降血糖素活性的肽。
8. 根据任一项前述权利要求的组合物，其中至少一种肠降血糖素选自：（a)具有图1 (i) (SEQ ID NO 9)所示的氨基酸序列的GLP-1 (7-37) A8G突变体或其突变体、衍生物或 类似物，（b)具有图1 (j) (SEQ ID NO 10)所示的氨基酸序列的艾塞那肽-4分子或其突 变体、衍生物或类似物；和（c)具有图1 (s) (SEQ ID NO 19)所示的氨基酸序列的PYY肽 或其突变体、衍生物或类似物。
9. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述特异性地结合血清白蛋白的结构 域抗体（dAb)选自：DOM 7h-14 (Vk)结构域抗体（dAb) (DOM 7h-14的氨基酸序列显示为图 1 (h): SEQ ID NO 8)，或 DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb) (DOM 7h-14-10 的氨基酸 序列显示为图1 (〇): SEQ ID NO 15)，和具有R108C突变的DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗 体（dAb) (DOM 7h-14-10 R108C 的氨基酸序列显示为图 1 (r)SEQ ID NO 18);和 7h-ll-15 AlbudAb(DOM 7h-ll-15 的氨基酸序列显示为图 1 (p): SEQ ID NO 16)和 7h-ll-15 R108C AlbudAb (DOM 7h-ll-15 R108C 的氨基酸序列显示为图 1 (T): SEQ ID NO 47);或这样 的dAb，其结合在血清白蛋白上的相同表位，或其与它们中的任一种竞争与血清白蛋白的结 合。
10. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其另外包含氨基酸连接物或化学连接物， 所述连接物连接促胰岛素分子和/或肠降血糖素分子和/或肠肽和结合血清白蛋白的dAb。
【文档编号】A61K38/17GK104147611SQ201410386267
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2010年9月23日 优先权日:2009年9月30日
【发明者】B.哈米尔顿, C.赫林, M.A.保利克 申请人:葛兰素集团有限公司