用于减少cd36表达的方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于减少CD36表达的方法。该方法包括用使得细胞与有效量的芳族阳离子肽接触，其中该芳族阳离子肽具有：至少一个净正电荷；最少4个氨基酸；最多大约20个氨基酸；净正电荷的最小数目(Pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系，其中3Pm是小于或等于r+1的最大数；以及芳族基团的最小数目(a)与净正电荷的总数(Pt)之间的关系，其中2a是小于或等于Pt+1的最大数，除非当a为1时，Pt也可以是1。本发明还提供了芳族阳离子肽在制备用于治疗哺乳动物中的动脉粥样硬化的药物中的应用，所述芳族阳离子肽是D-Arg-2'6'Dmt-Lys-Phe-NH2。
【专利说明】用于减少CD36表达的方法
[0001] 本申请是申请日为2006年9月18日、分案提交日为2012年2月9日、申请号为 201210028972. 2、发明名称为"用于减少⑶36表达的方法"的分案申请的再次分案申请，其 中，申请号为201210028972. 2的分案申请是申请号为200680040019. 2、申请日为2006年9 月18日、发明名称为"用于减少CD36表达的方法"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求对2005年9月16日提交的美国临时申请序列号为60/718, 170的优 先权。美国临时申请序列号为60/718, 170的说明书（专利申请）以引用方式结合于本文。
[0003] 在本申请中描述的发明得到以下单位的资助：美国国家药物滥用研究所（the National Institute of Drug Abuse)，资助号P01DA08924;美国神经疾病与中风研究所 (the National Institute of Neurological Diseases and Stroke)，资助号 R2INS48295; 以及美国心肺血液研究所（the National Heart, Lung and Blood Institute)，资助号 R01HL082511。美国政府具有本发明的某些权利。
【背景技术】
[0004] ⑶36是B类清道夫受体家族的一种跨膜蛋白。该蛋白被广泛表达在许多细胞上， 如微血管内皮细胞、巨噬细胞、血小板、脂肪细胞、上皮细胞（例如，肠上皮细胞和肾小管细 胞等）、胰岛细胞以及心肌细胞。该受体可以与多种细胞外配体相互作用，如血小板凝血酶 敏感蛋白-1、长链脂肪酸、以及氧化型低密度脂蛋白。
[0005] CD36的异常表达与多种疾病和病症有关。例如，与野生型小鼠相比，当进食西方饮 食（Western diet)时，缺少⑶36的小鼠具有较少的动脉粥样硬化病变。另外据报道，⑶36 基因剔除小鼠可避免患有急性脑缺血。
[0006] 因此，用于减少⑶36表达的方法可有助于治疗特征为⑶36异常表达的疾病或病 症。
【发明内容】
[0007] 在一种实施方式中，本发明提供了一种用于减少细胞中的CD36表达的方法。该方 法包括使细胞与有效量的芳族阳离子肽（aromatic-cationic peptide)接触。
[0008] 在另一种实施方式中，本发明提供了一种在有需要的哺乳动物中减少CD36表达 的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的芳族阳离子肽。
[0009] 在又一种实施方式中，本发明提供了一种在有需要的哺乳动物中治疗特征为CD36 表达增加的疾病或病症的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的芳族阳离子肽。
[0010] 在一种进一步的实施方式中，本发明提供了一种在有需要的哺乳动物中治疗输尿 管梗阻的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的芳族阳离子肽。
[0011] 在一种更进一步的实施方式中，本发明提供了一种在有需要的哺乳动物中治疗糖 尿病肾病的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的芳族阳离子肽。
[0012] 在另一种实施方式中，本发明提供了一种用于减少取出的器官或组织中的CD36 表达的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的芳族阳离子肽。
[0013] 本发明的方法中所用的芳族阳离子肽具有：至少一个净正电荷；最少4个氨基酸； 最多大约20个氨基酸；净正电荷的最小数目（P m)与氨基酸残基的总数（r)之间的关系，其 中3Pm是小于或等于r+Ι的最大数；以及芳族基团的最小数目（a)与净正电荷的总数（P t) 之间的关系，其中2a是小于或等于Pt+1的最大数，除非当a为1时之外，Pt也可以是1。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1，SS-31减少了小鼠腹腔巨噬细胞中的oxLDL(氧化修饰低密度脂蛋白）诱导 的⑶36mRNA表达、⑶36蛋白表达、以及泡沫细胞的形成。
[0015] 图2,在患有急性脑缺血的野生型小鼠中，SS-31疗法（或治疗）减小了梗死体积 和脑半球肿胀（hemispheric swelling)。
[0016] 图3，SS_31疗法减少了野生型小鼠局部缺血后的脑中的还原型谷胱甘肽（GSH)的 降低。
[0017] 图4,在患有急性脑缺血的⑶36基因剔除（敲除）小鼠中，SS-31在减少梗死体积 或脑半球肿胀方面没有作用（疗效）。
[0018] 图5, SS-31没有减少来自⑶36基因剔除小鼠缺血后的脑中的GSH的消耗（排除， depletion)〇
[0019] 图6, SS-31减少了野生型小鼠缺血后的脑中的⑶36mRNA的表达。
[0020] 图7, SS-31降低了在单侧输尿管梗阻（UUO)后肾小管细胞中的⑶36表达。对侧 未梗阻肾（图7-A);用盐水处理的动物的梗阻肾（图7-B);以及用SS-31处理的获自大鼠 的梗阻肾（图7-C)。
[0021] 图8, SS-31减少了 UUO后的肾中的脂质过氧化作用。在梗阻肾中的肾小管细胞 (图8-B);对侧未梗阻对照（图8-A);以及来自用SS-31处理的大鼠的梗阻肾（图8-C)。
[0022] 图9, SS-31减少了 UUO后的梗阻肾中的肾小管细胞凋亡。来自盐水处理的动物的 梗阻肾（图9-B);对侧未梗阻对照（图9-A);来自SS-31处理的动物的梗阻肾（图9-C)。
[0023] 图10，SS_31减少了由UUO诱导的梗阻肾中的巨噬细胞浸润。梗阻肾（图10-B); 对侧未梗阻对照（图10-A);用SS-31处理的大鼠的梗阻肾（图10-C)。
[0024] 图11，SS_31减少了 UUO后的梗阻肾中的间质纤维化。梗阻的肾（图11-B);对侧 未梗阻对照（图11-A);用SS-31处理的大鼠的梗阻肾（图11-C)。
[0025] 图12,用SS-31或SS-20阻止⑶36表达上调的离体（分离的）心脏的冷储存（冷 藏）。"背景"对照（图12-A和12-B)表示来自正常非缺血心脏的两个切片，其没有用第一抗 CD36 抗体（primary anti_CD36antibody)加以处理。"正常心脏"（图 12-C 和 12-D)表不 获自非缺血心脏的两个切片。与"正常心脏"相比，来自代表性心脏（其在4°C的St. Thomas 溶液中储存了 18小时）的切片（图12-E和12-F)显示出增强的⑶36染色。在具有InM SS-31 (图 12-G 和 12-H)或 IOOnM SS-20(图 12-1 和 12-J)的 St. Thomas 溶液中储存的心 脏中，CD36染色显著降低。
[0026] 图13，SS_31和SS-20减少了离体豚鼠心脏中的脂质过氧化作用，其中离体豚鼠心 脏在延长的（prolonged)冷缺血以后经受热再灌注。经受在St. Thomas溶液中冷藏18小 时的心脏的HNE染色（图13-A)与非缺血心脏的HNE染色进行对比（图13-B)。在贮存于 SS-31 (图13-C)或SS-20(图13-D)的心脏中，HNE染色减少。
[0027] 图14，SS_31和SS-20消除了离体豚鼠心脏中的内皮细胞凋亡，其中该离体豚鼠心 脏在持续的冷缺血以后经受热再灌注。在St. Thomas溶液中经受18小时冷藏的心脏（图 14-C和14-D);非缺血正常心脏（图14-A和14-B)。在贮存于SS-31 (图14-E和14-F)或 SS-20(图14-G和14-H)的心脏中没有观察到凋亡的细胞。
[0028] 图15，SS_31和SS-20可维持离体豚鼠心脏中的冠状动脉流量，其中离体豚鼠心脏 在延长的冷缺血以后经受热再灌注。单独用心脏停搏液（St. Thomas溶液）或用包含InM SS-31 (图15-A)或IOOnM SS-20 (图15-B)的St. Thomas溶液灌注豚鼠心脏3分钟，然后经 受18小时的冷缺血（4°C )。
[0029] 图16, SS-31防止对糖尿病小鼠近端小管的损伤。通过链脲霉素（STZ)注射5天 来诱导糖尿病。在3周后获得的肾切片显示，在STZ处理的动物中失去刷状缘（图16-B)， 而在未用STZ处理的小鼠中则没有观察到失去刷状缘（图16-A)。在每日接受SS-31 (3mg/ kg)的用STZ处理的动物中没有观察到刷状缘的丧失（图16-C)。
[0030] 图17, SS-31防止了糖尿病小鼠中肾小管上皮细胞的凋亡。通过链脲霉素（STZ) 注射5天来诱导糖尿病。3周后获得的肾切片显示，在STZ处理的动物中近端小管中凋亡的 细胞显著增加（图17-A，图片b)，而在未用STZ处理的小鼠中则未观察到近端小管中凋亡 的细胞显著增加（图17-A，图片a)。在每日接受SS-31 (3mg/kg)的小鼠中未观察到STZ诱 导的凋亡（图17-A，图片c)。SS-31疗法显著降低了由STZ引起的凋亡细胞的百分数（图 17-B)。
【具体实施方式】
[0031] Ii
[0032] 本发明涉及通过某些芳族阳离子肽来减少⑶36表达。这些芳族阳离子肽是水溶 性的和高极性的。尽管有这些性质，但这些肽可以容易地穿透细胞膜。
[0033] 本发明所用的芳族阳离子肽包括最少3个氨基酸，并且优选包括最少4个氨基酸， 氨基酸通过肽键共价相连。
[0034] 在本发明的芳族阳离子肽中存在的氨基酸的最大数目为大约20个，它们通过肽 键共价相连。优选地，氨基酸的最大数目为约12个，更优选约9个，以及最优选约6个。最 佳地，在肽中存在的氨基酸的数目为4个。
[0035] 本发明所用的芳族阳离子肽的氨基酸可以是任何氨基酸。如在本文中所使用的， 术语"氨基酸"用来指任何包含至少一个氨基基团和至少一个羧基基团的有机分子。优选 地，至少一个氨基基团是在羧基基团的α位。
[0036] 氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如，二十种最常见的通常 存在于哺乳动物蛋白质中的左旋（L)氨基酸，S卩，丙氨酸（Ala)、精氨酸（Arg)、天冬酰胺 (Asn)、天冬氨酸（Asp)、半胱氨酸（Cys)、谷氨酰胺（Gln)、谷氨酸（Glu)、甘氨酸（Gly)、组氨 酸（His)、异亮氨酸（Ileu)、亮氨酸（Leu)、赖氨酸（Lys)、蛋氨酸（Met)、苯丙氨酸（Phe)、脯 氨酸（Pro)、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr)、色氨酸（Trp)、酪氨酸（Tyr)、以及缬氨酸（Val)。 [0037] 其它天然存在的氨基酸包括，例如，在与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨 基酸。例如，氨基酸鸟氨酸和瓜氨酸是在尿素产生过程中，在哺乳动物代谢中合成的。天然 存在的氨基酸的另一个实例包括羟脯氨酸（Hyp)。
[0038] 本发明所用的的肽可选地包含一种或多种非天然存在的氨基酸。最佳地，该肽没 有天然存在的氨基酸。该非天然存在的氨基酸可以是左旋（L-)氨基酸、右旋（D-)氨基酸、 或其混合。
[0039] 非天然存在的氨基酸是那些氨基酸，其通常不是在生物体的正常代谢过程中合成 的，并且并不天然存在于蛋白质中。此外，本发明所用的非天然存在的氨基酸优选还不被常 见蛋白酶所识别。
[0040] 非天然存在的氨基酸可以存在于肽的任何位置。例如，非天然存在的氨基酸可以 在N-端、C-端、或在N-端与C-端之间的任何位置。
[0041] 非天然氨基酸可以，例如，包括不存在于天然氨基酸中的烷基、芳基、或烷基芳基 基团。非天然烷基氨基酸的某些实例包括α -氨基丁酸、β -氨基丁酸、Y -氨基丁酸、δ -氨 基戊酸、以及ε-氨基己酸。非天然芳基氨基酸的某些实例包括邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲 酸、以及对氨基苯甲酸。非天然烷基芳基氨基酸的某些实例包括邻氨基苯乙酸、间氨基苯乙 酸、对氨基苯乙酸、以及 Υ-苯基-β-氨基丁酸。
[0042] 非天然存在的氨基酸包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生 物可以，例如，包括将一个或多个化学基团加入天然存在的氨基酸。
[0043] 例如，可以将一个或多个化学基团加到苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香环的2'、3'、 4'、5'、或6'位的一个或多个，或加到色氨酸残基的苯并环的4'、5'、6'、或7'位的一个或 多个。该基团可以是可加入芳环的任何化学基团。这种基团的某些实例包括：支链或直链 C1-C4烧基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、或叔丁基、C1-C 4烧基氧基（即烧氧 基）、氨基、C1-C4烷基氨基和C1-C 4二烷氨基（例如甲氨基、二甲氨基）、硝基、羟基、卤素（即 氟、氯、溴、或碘）。天然存在氨基酸的非天然存在的衍生物的某些具体实例包括正缬氨酸 (Nva)和正亮氨酸（Nle)。
[0044] 本发明方法中所用的肽的氨基酸的修饰的另一个实例是肽的天冬氨酸或谷氨酸 残基的羧基基团的衍生化。衍生化的一个实例是利用氨或利用伯胺或仲胺（例如甲胺、乙 胺、二甲胺或二乙胺）的酰胺化作用。衍生化的另一个实例包括利用例如甲醇或乙醇的酯 化作用。
[0045] 另一种这样的修饰包括赖氨酸、精氨酸，或组氨酸残基的氨基基团的衍生化。例 如，可以酰化上述氨基基团。一些适宜的酰基基团包括，例如包含上述任何C 1-C4烷基基团 的苯甲酰基基团或烷酰基基团，如乙酰基或丙酰基基团。
[0046] 非天然存在的氨基酸优选是抗常见蛋白酶的，并且更优选对常见蛋白酶不敏感。 抗蛋白酶或对蛋白酶不敏感的非天然存在的氨基酸实例包括任何上述天然存在的L-氨基 酸的右旋（D-)形式、以及L-和/或D-非天然存在的氨基酸。D-氨基酸通常并不存在于蛋 白质中，虽然它们存在于某些肽类抗生素中，其中肽类抗生素是通过不同于细胞的正常核 糖体蛋白合成方法的方式而被合成的。如在本文中所使用的，D-氨基酸被认为是非天然存 在的氨基酸。
[0047] 为了使蛋白酶敏感性降到最小程度，本发明方法中所用的肽应具有少于5个、优 选少于4个、更优选少于3个、以及最优选少于两个由常见蛋白酶识别的相邻的L-氨基酸， 而不考虑氨基酸是天然存在的还是非天然存在的。最佳地，该肽仅具有D-氨基酸，而没有 L-氨基酸。
[0048] 如果肽包含蛋白酶敏感的氨基酸序列，则至少一个氨基酸优选为非天然存在的 D-氨基酸，从而赋予蛋白酶抗性（蛋白酶耐受性，protease resistance)。蛋白酶敏感序 列的一个实例包括两个或更多容易被常见蛋白酶（如内肽酶和胰蛋白酶）切割的相邻的碱 性氨基酸。碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸以及组氨酸。
[0049] 重要的是，与肽中的氨基酸残基总数相比，在生理pH下芳族阳离子肽具有最小数 目的净正电荷。在生理PH下净正电荷的最小数目将在下文称作（p m)。肽中氨基酸残基的 总数将在下文称作（r)。
[0050] 下文提及的净正电荷的最小数目均是在生理pH下。如在本文中所使用的术语"生 理pH"是指哺乳动物身体的组织和器官的细胞内的正常pH。例如，人的生理pH通常为约 7. 4,但哺乳动物的正常生理pH可以是从约7. 0至约7. 8的任何pH。
[0051] 如在本文中所使用的，术语"净电荷"是指在肽中存在的氨基酸所携带的正电荷数 目和负电荷数目的差值。在本说明书中，应当明了，净电荷是在生理PH下测量的。在生理 pH下带正电荷的天然存在的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸、以及L-组氨酸。在生理pH 下带负电荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
[0052] 通常，肽具有带正电荷的N-末端氨基基团和带负电荷的C-末端羧基基团。这些 电荷在生理pH下彼此抵消。
[0053] 作为计算净电荷的实例，肽：Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg具有一个带负 电荷的氨基酸（即谷氨酸）和四个带正电荷的氨基酸（即两个精氨酸残基、一个赖氨酸、以 及一个组氨酸）。因此，上述肽具有三个净正电荷。
[0054] 在本发明的一种实施方式中，芳族阳离子肽在生理pH下的净正电荷的最小数目 (Pm)与氨基酸残基的总数（r)之间的关系为：其中3p m是小于或等于r+Ι的最大数。在该 实施方式中，净正电荷的最小数目（Pm)与氨基酸残基的总数（r)之间的关系如下：
[0055]
【权利要求】
1. 芳族阳离子肽在制备用于治疗哺乳动物中的动脉粥样硬化的药物中的应用，其中， 所述芳族阳离子肽是D-Arg-2' 6' Dmt-LyS-Phe-NH2。
2. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述哺乳动物是人。
3. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述哺乳动物患有II型糖尿病。
4. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述肽被配制为口服地、局部地、系统地、静脉内 地、皮下地或肌内地给予。
【文档编号】A61K38/07GK104324360SQ201410509385
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2006年9月18日 优先权日:2005年9月16日
【发明者】黑兹尔·H·塞托, 刘少毅, 赵圣煦 申请人:科内尔研究基金会