此研究成果是由来自美国国家卫生研究院(NIH)的下述补助款支持：第5RO1EY017017号。美国政府对于本发明有特定权利。
相关申请案
根据35U.S.C§119(e)，本申请案主张于2013年10月25日提交的，名称为\"治疗或预防视网膜血管疾病\"的美国专利临时申请案第61/895,851号的优先权，上述专利申请案的全部内容以参考方式并入本文。
背景技术：
视网膜血管疾病，包含糖尿病性视网膜病变、渗出性老年性黄斑变性(ARMD)、早产儿视网膜病变(ROP)和血管闭塞，是视力障碍和失明的主要原因。这类疾病是密集研究的焦点，目的在于鉴别新的治疗模式，能有助于预防或减缓病理性眼的新血管形成。举例来说，ARMD影响数百万65岁以上的美国人，且因脉络膜(下视网膜)的新血管形成的直接影响而造成当中有10-15％的人视力丧失。对65岁以下的美国人而言，视力丧失的主要原因是糖尿病；在美国有数百万人患有糖尿病且其中多数罹患糖尿病的眼部并发症，这些并发症通常是由于视网膜的新血管形成所导致。激光光凝能有效防止糖尿病高风险患者的亚群发生严重视力丧失，但视网膜病变的整体10年发病率基本上维持不变。对于因ARMD或发炎性眼部疾病如眼组织胞浆菌病而有脉络膜新血管形成的患者而言，除了少数例外，激光光凝无法有效防止视力丧失。
在工业化国家，老年性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变是视力丧失的主因，而且是异常的视网膜新血管形成所造成的结果。因为视网膜是由神经元、神经胶质和血管成分形成界定明确的多层所组成，所以相对微小的失调，例如在血管增生或水肿见到的失调，都会造成视觉功能的严重丧失。遗传性视网膜变性，例如色素性视网膜炎(RP)，也与血管异常，例如小动脉狭窄和血管萎缩相关。虽然鉴定促进和抑制血管生成的因子已经有所进展，但目前没有专门治疗眼睛血管疾病的疗法。
遗传性视网膜变性影响多达3500分之1的个体，其特征为渐进性夜盲、视野丧失、视神经萎缩、小动脉衰减、改变的血管通透性和经常发展至完全失明的中心视力丧失。目前仍无有效的疗法能减缓或逆转这些视网膜变性疾病的进展。
因此，在本领域对于治疗或预防视网膜血管疾病，包含视网膜病变，仍有需求。
技术实现要素：
作为失明主要原因的是带有病理性血管生成的视网膜病变，其会被膳食中的ω3-多不饱和脂肪酸(ω3PUFAs)透过由环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)产生的抗血管生成代谢物抑制。此外，在视网膜病变中的角色仍未知的细胞色素P450(CYP)环氧化镁(CYP2C8)，代谢PUFAs产生环氧化物，其被可溶性环氧化物水解酶(sEH)灭活形成反式二氢二醇。本发明一部分是基于新发现，即ω3PUFA的CYP2C8/sEH代谢作用调控氧诱导视网膜病变(OIR)中的新血管形成，其与ω3PUFA环氧化物：二醇的比值增加相应。CYP2C8的抑制呈现了视网膜病变治疗的新靶标。
因此，第一方面，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的视网膜血管疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂，从而治疗或预防视网膜血管疾病。
另一方面，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的血管生成的方法，包括向受试者施用治疗有效量的CYP2C8活性或表达的抑制剂，从而治疗或预防血管生成。
又另一方面，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的新血管形成的方法，包括向受试者施用治疗有效量的CYP2C8活性或表达的抑制剂，从而治疗或预防新血管形成。
再又一方面，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的视网膜血管疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的可溶性环氧化物水解酶(sEH)活性或表达的启动子，从而治疗或预防视网膜血管疾病
再另一方面，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的视网膜血管疾病、血管生成和/或新血管形成的方法，其涉及向受试者施用治疗有效量的孟鲁司特(montelukast)和非诺贝特(fenofibrate)，从而实现治疗或预防受试者的视网膜血管疾病受试者的视网膜血管疾病、血管生成和/或新血管形成。
在上述方面的一个具体实例中，视网膜血管疾病选自视网膜病变、渗出型老年性黄斑变性(ARMD)和血管闭塞所组成的群组。再又一具体实例中，视网膜病变选自糖尿病性视网膜病变和早产儿视网膜病变(ROP)。
另一方面，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的血管生成的方法，包括向受试者施用治疗有效量的sEH活性或表达的启动子，从而治疗或预防血管生成。
又另一方面，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的新血管形成的方法，包括向受试者施用治疗有效量的sEH活性或表达的启动子，从而治疗或预防新血管形成。
在上述方面的一个具体实例中，受试者被鉴别为具有视网膜血管疾病或倾向具有视网膜血管疾病。在一个相关的具体实例中，视网膜血管疾病选自视网膜病变、渗出性老年性黄斑变性(ARMD)和血管闭塞所组成的群组。
在上述方面的另一个具体实例中，受试者为有早产儿视网膜病变风险的早产儿。
在上述方面的一个具体实例中，孟鲁司特、非诺贝特和/或CYP2C8的抑制剂在组织中减少CYP2C8蛋白的活性或减少CYP2C8基因的表达。在上述方面的另一个具体实例中，sEH的启动子在组织中增加sEH蛋白的活性或增加sEH基因的表达。再又一具体实例中，孟鲁司特、非诺贝特、CYP2C8活性的抑制剂和/或sEH活性或表达的启动子是施用于眼组织。
在上述方面的一个具体实例中，视网膜病变选自糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变和湿性老年性黄斑变性所组成的群组。
在上述方面的又一个具体实例中，受试者被富含多不饱和脂肪酸的膳食喂养。在一个相关的具体实例中，富含多不饱和脂肪酸的膳食是ω3-PUFA膳食或ω-6PUFA膳食。
在另外的具体实例中，本发明的方法还包括向受试者施用CYP2J2的抑制剂。CYP2J2的抑制剂可选择替米沙坦(Telmisartan)、氟桂利嗪(Flunarizine)、阿莫地喹(Amodiaquine)、尼卡地平(Nicardipine)、米贝拉地尔(Mibefradil)、诺氟沙星(Norfloxacin)、硝苯地平(Nifedipine)、尼莫地平(Nimodipine)、苯溴马隆(Benzbromarone)或氟呱啶醇(Haloperidol)。
本发明的另一个方面提供一种治疗受试者的视网膜血管疾病的药物组合物，包括孟鲁司特或非诺贝特以及其使用说明书。
定义
提供以下术语仅在帮助理解本发明。这些定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所能够理解的范围。
在本公开中，\"包括(comprises)\"、\"包括(comprising)\"、\"含有(containing)\"和\"具有(having)\"等可以具有美国专利法所赋予的含义，并可意为\"包括(includes)\"、\"包含(including)\"等；\"基本上由…组成(consistingessentiallyof)\"或\"基本上由…组成(consistsessentially)\"同样地具有美国专利法所赋予的含义，而且所述术语是开放式的，允许存在超过所述者，只要其叙述的基本或新颖特征未因超过所述者而改变，但排除先前技术的具体实例。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式\"一(a)\"、\"一(an)\"和\"所述(the)\"包括复数引用，除非上下文另有明确说明。
如本文所用的术语\"视网膜血管疾病\"意思是指会影响眼睛血管的眼睛疾病范围。示例性的视网膜血管疾病包括但不限于视网膜病变、渗出性老年性黄斑变性(ARMD)和血管闭塞。
术语\"视网膜病变\"意思是指眼睛的视网膜持续性或急性损伤。视网膜病变的类型包括糖尿病性视网膜病变和早产儿视网膜病变(ROP)。
术语\"细胞色素P450\"意思是指大量及多样的酶群，可以催化有机物质的氧化。编码CYP酶的基因和酶本身被指定为缩写CYP，其后带有一个数字表示基因家族、大写字母表示亚家族，和另一个数字为个别基因。\"细胞色素P4502C8(CYP2C8)\"意思是指涉及体内异源物质代谢的细胞色素P450混合功能氧化酶系统中的一员。
术语\"血管生成\"意思是指从既有血管形成新血管的生理过程。
术语\"新血管形成\"意思是指在眼睛中微小、异常、渗漏的血管的发展。
术语\"可溶性环氧化物水解酶(sEH)\"意思是指在人类中由EPHX2基因编码的双功能酶。sEH是环氧化物水解酶家族的成员。在细胞质和过氧化酶体都发现这种酶，它可结合特定的环氧化物并将其转换为相应的二醇。
术语\"多不饱和脂肪(PUFA)\"意思是指在烃尾构成多不饱和脂肪酸(PUFA)(有多于一个碳碳双键的脂肪酸)的甘油三酯。ω3-PUFA是指omega-3脂肪酸(也称为ω-3脂肪酸或n-3脂肪酸)，其是三个脂肪称为ALA(发现于植物油中)、EPA和DHA(皆通常发现于海产油中)的类别。
本文所用的术语\"受试者\"包括动物，尤其是人类和其他哺乳动物。
本文所用的术语\"治疗\"或\"预防\"包括实现治疗益处和/或预防性益处。治疗益处是指根除或减轻所治疗的潜在病症。此外，治疗益处的实现在于根除或减轻一个或多个与潜在病症相关的症状，以至于能在受试者身上观察到改善，尽管受试者可能仍受潜在病症的折磨。对于预防益处，所述组合物可施用于有发展特定疾病风险的受试者，或施用于有一个或多个疾病的生理症状报告的受试者，即使可能还未做出所述疾病的诊断。所述组合物可施用于受试者以预防生理症状或潜在病症的进展。
缩写和首字母缩略词
PUFA—多不饱和脂肪酸；COX—环氧合酶；LOX—脂氧合酶；CYP—细胞色素P450；sEH—可溶性环氧化物水解酶；OIR—氧诱导视网膜病变；DHA—二十二碳六烯酸；EPA—二十碳五烯酸；AA—花生四烯酸；EC—内皮细胞；VEGF—血管内皮生长因子；EET—环氧二十碳三烯酸；EDP—环氧二十二碳五烯酸；EEQ—环氧二十碳四烯酸；DHET—二羟基二十碳三烯酸；DiHDPA—二羟基二十二碳五烯酸。
附图说明
图1显示在视网膜中CYP2C8同系物、sEH的表达及其等产物在常氧与OIR下的比值。(A)花生四烯酸(AA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的CYP2C8及sEH代谢作用的示意图。(B)出生后(P)17天在常氧与和OIR的视网膜扁平封片的三维重建共聚焦图像，视网膜扁平封片由CYP2C(绿色)、F4/80(紫色)、同工凝集素(红色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺：100μm。(C)常氧下视网膜静脉的逐层共聚焦图像截面。(D)在OIR视网膜扁平封片中CYP2C和F4/80(箭头)的共存在区域。(E)由同工凝集素(红色)、sEH(绿色)和DAPI(蓝色)染色的视网膜横切面，显示sEH在新生血管丛(箭头头部)，以及在神经节细胞(GCL)和内核层(INL)表达。比例尺：10μm。(F)血涂片显示CYP2C阳性的白细胞(箭头)。比例尺：20μm。(G)在血液中以及有或没有灌注的视网膜中CYP2C的mRNA表达量。(H)在OIR期间，视网膜中CYP2C和sEH的mRNA表达(n＝6)。(I)常氧下(N)与OIR(O)的视网膜中CYP2C和sEH蛋白的表达。(J)由LC/MS/MSoxylipid分析AA、DHA和EPA的环氧化物对二醇的比值。(n＝4-6/组)(双向ANOVA与Bonferroni事后检验法，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图2显示喂食ω3PUFA减缓Tie2-CYP2C8-Tg和Tie2-sEH-Tg小鼠的OIR新血管形成。OIR新生血管的区域：(A)Tie2-CYP2C8-Tg小鼠与同窝野生型对照组(WT)(n＝11-13/组)；(B)Tie2-sEH-Tg小鼠与WT(n＝14-19/组)；(C)全身性sEH基因剔除(sEH-/-)(n＝8-15/组)。比例尺：500μm。(D)，在OIR的Tie2-CYP2C8-Tg小鼠和Tie2-sEH-Tg小鼠与WT小鼠的VEGF-A和VEGF-C的RT-PCR(t-检验，n.s.—不显著，*p<0.05，**p<0.01)。
图3显示以ω3PUFA喂养的小鼠中，Tie2-CYP2C8-Tg和Tie2-sEH-Tg改变所对应的环氧化物量。(A)14,15-EET、19,20-EDP和17,18-EEQ在Tie2-CYP2C8-Tg小鼠中的血浆水平(n＝4-6/组)。(B)14,15-EET、19,20-EDP和17,18-EEQ在Tie2-sEH-Tg小鼠中的血浆水平(n＝4-6/组)。Tie2-CYP2C8-Tg小鼠和WT小鼠于视网膜中的(C)14,15-EET:14,15-DHET、19,20-EDP:DiHDPA和17,18-EEQ:17,18-DHET的比值(n＝4-6/组)。(D)Tie2-sEH-Tg小鼠和WT小鼠于视网膜中的19,20-EDP:DiHDPA和17,18-EEQ:17,18-DHET的比值(n＝4-6/组)。(t-检验，n.s.—不显著，*p<0.05，**p<0.01)。
图4显示利用经DHA和AA或环氧化物代谢物处里的Tie2-CYP2C8-Tg和Tie2-sEH-Tg的主动脉环芽生。(A)由AA(30μM)或DHA(30μM)诱发的WT小鼠和Tie2-CYP2C8-Tg小鼠的主动脉环芽生(n＝3-7/组)。(B)来自经17,18-EDP、19,20-EEQ和14,15-EET处里的Tie2-sEH-Tg和sEH-/-小鼠的主动脉环芽生(n＝3-8/组)。比例尺：50μm(t-检验，n.s.—不显著，*p<0.05，**p<0.01)。
图5显示以ω6PUFA喂养的Tie2-CYP2C8-Tg相较于WT，其诱发OIR新血管形成(9.458±0.3425比8.291±0.3979，p＝0.032)；在Tie2-sEH-Tg或sEH-/-中没有看到差异。
图6显示Tie2-CYP2C8-Tg和WT的血浆中14,15-EET和视网膜中14,15EET:14,15-DHET的比值，此与新血管形成增加为一致(A-D)。经14,15-EET处里后，Tie2-sEH-Tg、sEH-/-和WT中的主动脉环芽生是类似的。
图7显示在正常喂养的JAX(WT)小鼠中，低剂量(10mg/kg/天GV)和高剂量(100mg/kg/天GV)的非诺贝特皆使新血管形成减少。
图8显示在正常喂养的PPARα基因剔除小鼠中，低剂量(10mg/kg/天GV)和高剂量的非诺贝特(100mg/kg/天GV)皆使新血管形成减少，表示所观察到效果不依赖PPARα。
图9显示以ω3和ω6LCPUFA喂养的WT小鼠和Cyp2C8过表达的转基因(Tg)小鼠中，低剂量的非诺贝特使两者的新血管形成减少。
图10显示非诺贝酸(FA，非诺贝特的活性代谢物)抑制WT小鼠和Cyp2C8Tg小鼠的主动脉环芽生。此抑制会部分地被19,20-EDP恢复。
图11显示非诺贝酸(FA)抑制WT小鼠和Cyp2C8Tg小鼠的主动脉环芽生。此抑制无法被DHA恢复。
图12显示FA抑制WT小鼠和Cyp2C8Tg小鼠的主动脉环芽生。此抑制无法被PPARα抑制剂GW6471逆转。
图13显示观察到FA抑制人类视网膜的微血管内皮细胞(HRMEC)小管形成，而且此作用会部分被19,20EDP恢复。
图14显示将图13的结果量化并以直方图呈现。
图15显示w3LCPUFA无法恢复FA造成的HRMEC小管形成的抑制。
图16显示将图15的结果量化并以直方图呈现。
图17当PPARα抑制剂GW6471被检验且发现不会影响所观察到的非诺贝特对HRMEC小管形成的作用，显示非诺贝特被鉴定为通过不依赖PPARα的方式抑制HRMEC小管形成。
图18显示将图17的结果量化并以直方图呈现。
图19显示19,20EDP和17,18EEQ(EPA和CYP2C8的下游化合物)被鉴定能部分地恢复FA造成的HRMEC迁移的抑制。
图20显示w3LPUFA被鉴定不能恢复FA造成的HRMEC迁移的抑制。
图21当PPARα抑制剂GW6471被检验且发现不会影响所观察到的非诺贝特对HRMEC迁移的作用，显示所观察到的FA抑制HRMEC迁移是不依赖PPARα。
图22显示在ω3和ω6途径中，非诺贝特/FA被评估的作用位点。
图23显示在正常喂养的JAX(WT)小鼠中，孟鲁司特使新血管形成减少。
图24显示施予孟鲁司特对于CYP2C8过表达小鼠(Cyp2C8转基因小鼠，\"Cyp2C8Tg\")的影响。
图25显示孟鲁司特对于HRMEC小管形成的作用。
图26显示在评估HRMEC小管形成时，孟鲁司特展示了明显的剂量响应曲线，其结果也与那些用非诺贝特所观察到的结果类似。
图27展示HRMEC的迁移被孟鲁司特抑制，也以明显的剂量响应曲线的方式显示。
具体实施方式
先前已经表明，在氧诱导视网膜病变(OIR)中，富含ω3PUFA的膳食能抑制新血管形成。OIR幼崽中ω3PUFA的抗血管生成作用主要来自于COX和LOX代谢物。根据这些研究，在给予早产儿的全胃肠外营养中加入ω3PUFA，在临床试验中有助于防止视网膜病变。新鉴别的且特征不多的CYP途径最近被发现能代谢ω6PUFA花生四烯酸(AA)，产生促血管生成的代谢物环氧二十碳三烯酸(EETs)，但是在视网膜病变中，ω3PUFA衍生的CYP和sEH代谢物仍然未知。
了解视网膜病变中从ω3PUFA而来的CYP代谢物的作用，对于了解在全胃肠外营养中加入ω3PUFA的意义而言是非常重要的。本文描述的是一个新颖的、来自CYP2C8的ω3PUFA环氧化物代谢物，能加强新血管形成。这些结果表明，虽然在视网膜病变中，COX和LOX的ω3PUFA代谢物抑制新血管形成，但是CYP2C8的ω3PUFA代谢物会促进疾病，而且对于视网膜病变的治疗，CYP2C8的抑制可提供一种引人注意的新靶标，因为这种抑制被预期能减少或预防ω3PUFA和ω6PUFA这两种重要的膳食脂肪酸产生促血管生成的代谢物。
细胞色素P450(CYP)是大量且多样的血红素蛋白超家族，可在各界生命體中发现。它们使用大量的外源性和内源性化合物作为酶反应的底物。他们通常形成多组分电子传递链的一部分，称为含P450的系统。细胞色素P4502C8(缩写CYP2C8)，为细胞色素P450混合功能氧化酶系统中的一员，涉及于体内异源物质的代谢。
如本文所述，本发明包括细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂。本发明还包括可溶性环氧化物水解酶(sEH)活性或表达的活化剂、机动剂和/或启动子。
在某些具体实例中，CYP2C8的抑制剂在细胞或组织中降低CYP2C8蛋白质的活性或降低CYP2C8基因的表达。在其他具体实例中，sEH的启动子在细胞或组织中增加sEH蛋白质的活性或增加sEH基因的表达。
本发明不受抑制剂的类型限制。示例性的CYP2C8抑制剂或sEH启动子包括但不限于抗体、肽、抑制性核酸，例如siRNA、适配体，和有机小分子。\"有机小分子\"通常被用来指有机分子，其大小相当于一般在药物中使用的那些有机分子。所述术语通常不包括有机聚合物(例如，蛋白质、核酸等)。有机小分子最常见的尺寸范围高达约5000Da，在一些具体实例中，高达约2000Da，或者在其他具体实例中，高达约1000Da。在某些具体实例中，CYP2C8活性或表达的示例性抑制剂包括非诺贝特，吉非罗齐，甲氧苄啶，噻唑烷二酮，孟鲁司特和槲皮素。举例来说，非诺贝特和孟鲁司特的化学结构分别为和另外的示例性CYP2C8活性或表达抑制剂包括坎地沙坦、扎鲁司特、克霉唑、非洛地平、糠酸莫米松、沙美特罗、雷洛昔芬、利托那韦、左旋甲状腺素、他莫昔芬、氯雷他定、奥昔布宁、甲羟孕酮、辛伐他汀、酮康唑、炔雌醇、螺内酯、洛伐他汀、硝苯地平、厄贝沙坦、氯吡格雷、氨氯地平、格列本脲、罗格列酮、头孢呋辛酯、特非那定、吡格列酮、地塞米松、雷贝拉唑、反苯环丙胺、咪达唑仑、制霉菌素、氯沙坦、紫杉醇、依西美坦、伐地考昔、氟伐他汀、塞来昔布、卡维地洛、曲安西龙、雌二醇、奈法唑酮、甲基泼尼松龙、舍曲林和坎地沙坦(参见Walsky等人，J.Clin.Phramacol.45:68-78)。
CYP2C8或sEH活性或表达可以被本领域技术人员使用例行的试验轻易地测定，例如免疫组织化学染色、酶联免疫吸附(ELISA)试验、西方墨点法分析、荧光测定法、质谱法、高效液相色谱法、高压液相色谱串联质谱法和聚合酶链反应(PCR)测定，如实时(RT)PCR。用于筛选完整细胞中细胞色素P450(P450)的以荧光为主的测定法已经被描述过(Donato等人，DrugMetabDispos.2004Jul；32(7):699-706；其整体以参考方式并入本文)。冷光的细胞色素P450测定法是市售的，例如从PROMEGA购买。
在一些具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以发挥治疗效果以减少视网膜血管疾病症状的量而存在，平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、90％以上，或能充分消除视网膜血管疾病的症状。
在一些具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以发挥治疗效果以减少视网膜病变的症状的量而存在，以糖尿病性视网膜病变例，其量平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、90％以上的，或能充分消除视网膜病变的症状。
在其他具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以降低受试者视网膜变性的量而存在，平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70％、80％、90、超过90％，或能充分消除视网膜变性。
在一些具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以使受试者的被处理眼中血管闭塞减少的量而存在，其量平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70％、80％、90、超过90％，或能充分消除视网膜水肿。
在其他具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以使受试者被处理的眼睛中血管生成减少的量而存在，其量平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70％、80％、90、超过90％，或能充分消除血管生成。
在其他具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以使受试者的被处理眼中视网膜新血管形成减少的量而存在，其量平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70％、80％、90、超过90％，或能充分消除视网膜新血管形成。
在一些具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以推迟受试者的被处理眼的视力丧失的量而存在，其量平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70％、80％、90、超过90％，或能充分消除进一步的视力丧失。
在一些具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以限制受试者的视网膜非增殖性损伤的量而存在，其量平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70％、80％、90、超过90％，或能充分消除视网膜非增殖性损伤。
在一些具体实例中，CYP2C8的抑制剂或sEH的启动子是以足以限制受试者的视网膜增殖性损伤的量而存在，其量平均至少约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70％、80％、90、超过90％，或能充分消除视网膜增殖性损伤。
在发明的化合物可以商购获得，或由本领域技术人员公知的方法制备，或由并入本文的参考文献所公开的方法制备，并且可以多种方式进行纯化，包括在各种条件下进行结晶或沉淀以产生一种或多种多晶型。
治疗方法
本发明包括治疗或预防受试者的视网膜血管疾病的方法、治疗或预防受试者的血管生成的方法，或在受试者中治疗或预防新血管形成的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达抑制剂。本发明也包括治疗或预防受试者的视网膜血管疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的可溶性环氧化物水解酶(sEH)活性或表达的启动子。
本文所用的术语\"受试者\"包括动物，尤其是人类和其他哺乳动物。在某些具体实例中，受试者为有早产儿视网膜病变风险的早产儿。在其他具体实例中，受试者患有糖尿病。在其他具体实例中，受试者被鉴定为倾向具有视网膜血管疾病。
在某些具体实例中，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的视网膜血管疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂，或治疗有效量的可溶性环氧化物水解酶sEH活性或表达的启动子，从而治疗或预防视网膜病变。
在其它具体实例中，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的血管生成的方法，包括向受试者施用治疗有效量的CYP2C8活性或表达的抑制剂，或治疗有效量的可溶性环氧化物水解酶sEH活性或表达的启动子，从而治疗或预防血管生成。
还有其它具体实例中，本发明的特征为一种治疗或预防受试者的新血管形成的方法，包括向受试者施用治疗有效量的CYP2C8活性或表达的抑制剂，或治疗有效量的可溶性环氧化物水解酶sEH活性或表达的启动子，从而治疗或预防新血管形成。
适用细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达抑制剂以预防或治疗的对象，包括但不限于那些有异常的血管或细胞增殖发生的病症和疾病。在某些具体实例中，所述疾病或病症是视网膜的血管疾病。举例来说，视网膜的血管疾病可以是视网膜病变、渗出性老年性黄斑变性(ARMD)，和血管闭塞。视网膜病变是由于眼睛视网膜持续性或急性的损伤。持续的炎症和血管重塑可在一段时间内发生，其中患者并不完全了解所述疾病的严重程度。经常地，视网膜病变是见于糖尿病或高血压的全身性疾病在眼部的表现。在具体的具体实例中，视网膜病变是选自糖尿病性视网膜病变和早产儿视网膜病变(ROP)。
早产儿视网膜病变(ROP)发生于早产儿。通常视网膜在足月时变得完全血管化。在早产儿刚出生时，其视网膜尚未完全血管化。早产儿的视网膜中的血管发生被打乱，而无法以正常的方式继续进行。异常增殖的新血管发展于血管化和无血管视网膜的接合点。这些异常的新血管从视网膜生长进入玻璃体，导致视网膜出血和牵拉性剥离。如果即时和充分地以激光烧蚀无血管的周边视网膜，可能阻止新血管形成，但是一些早产儿仍然持续发生视网膜剥离。用于治疗新生儿ROP相关的视网膜剥离的手术成功率有限，因为在这个时间点关于所述手术有独特的问题，像是新生儿眼睛的小尺寸以及极为牢固的玻璃体附着。
糖尿病性视网膜病变是导致工作年龄的成年人失明的主要原因。在糖尿病患者中，视网膜的毛细血管闭塞发生，产生缺血性视网膜的区域。视网膜缺血是的刺激物，新生血管增生发源于视盘或视网膜后至赤道中既有的视网膜静脉。在增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)中，严重的视力丧失起因于玻璃体出血和牵拉性视网膜剥离。此外，激光治疗(全视网膜光凝术治疗缺血性视网膜)可以阻止所述疾病中新生血管增生的进展，但只有在即时和以足够强的方式提供才能达成。有些糖尿病患者，无论是缺乏眼科护理或尽管有适当的激光治疗，继发于PDR的严重视力丧失仍继续维持。玻璃体切割手术可减少但不能消除这种疾病中严重的视力丧失。
老年性黄斑变性是65岁以上的人严重视力丧失的主要原因。在对比ROP和PDR，其中新血管形成从视网膜血管散发，并延伸到玻璃体腔，与AMD相关的新血管形成从脉络膜血管始发，并延伸到视网膜下腔。脉络膜新血管形成导致AMD患者的严重视力丧失，因为它发生在黄斑这个负责中央视力的视网膜区域。何种刺激导致脉络膜新血管形成目前尚未了解。在脉络膜新生血管的激光烧蚀可稳定经选择的患者视力。然而，根据现行标准，只有10％至15％的新生血管性AMD患者的病变被判定为适合激光光凝。
早产儿视网膜病变、增殖性糖尿病性视网膜病变和新血管形成的老年性黄斑变性仅为能产生继发于新血管形成的视觉丧失的眼睛疾病中的三种。其他包括镰状细胞性视网膜病变、视网膜静脉闭塞，以及某些眼部的发炎性疾病。然而，这些在眼睛新血管形成导致的视觉丧失中占更小的比例。
以氧诱导血管损失的小鼠眼睛模拟视网膜病变，其促成缺氧诱发的视网膜病变，能够评估视网膜的血管损失、损伤后再生长和病理性血管生成。
非增殖性糖尿病性视网膜病变(NPDR)开始时会呈现正常微血管结构的异常，其特征为视网膜毛细血管变性、形成囊状毛细血管微动脉瘤、缺乏周细胞的毛细血管、毛细血管闭塞和消除。作用机制包括糖尿病诱导的血管炎症，导致血管腔被白细胞和血小板阻塞，接着使周细胞和内皮细胞最终死亡。炎症过程中白细胞对血管壁的吸引和粘附导致白细胞暂时粘附于内皮(白细胞停滞)，释放细胞毒性因子，并且伤害或杀死内皮细胞。受损的内皮细胞表面引发血小板粘附、聚集、微血栓形成、血管闭塞和缺血。内皮损伤的另一个后果是血-视网膜屏障(BRB)的改变，导致血管通透性增加。这可以通过荧光血管造影期间荧光素的渗漏，或由光学相干断层扫描(OCT)评估视网膜增厚中得到证明。这种渗漏的后果可能是临床上显著的视网膜中黄斑水肿和脂蛋白的沉积(硬性渗出)，会促进视网膜增厚。随着过程继续，会丧失视网膜神经节细胞，导致视力丧失或失明。内皮细胞、周细胞死亡和毛细血管闭塞使血管改变，所引起的自主调节破坏和视网膜血流减少是DR进展的指标，也会引起视网膜缺血的发展，这会使DR的发展进入更严重的增殖阶段。
增殖性DR涉及新血管形成和血管生成，由视盘或视网膜其它位置的视网膜缺血所引起。这种新血管伴随收缩纤维组织会引起玻璃体出血和视网膜脱离。
在这个糖尿病性视网膜病变进程的任何点，黄斑水肿和糖尿病性黄斑水肿(DME)都可发展，对视功能造成严重影响。此相关病症的进展是由视网膜血管渗漏来预测，并导以光凝治疗，以减少视力丧失的风险。因为相当大比例的糖尿病视网膜病变患者也患有此病症，所以这是适切的临床干预治疗靶标。所有这些伤害或退化性损伤可能导致视力的损伤甚至完全丧失，也提供干预治疗的靶标。目前仍无有效的治疗方法。激光光凝涉及施用激光灼烧眼睛的各个区域，用于治疗许多新血管形成相关的病症。新血管形成，尤其常用散射或全视网膜激光光凝来治疗。然而，激光治疗可能导致对应于所处理区域有永久盲点。激光治疗也可能引起持续性或复发性出血，增加视网膜剥离的风险，或诱发新血管形成或纤维化。用于眼相关疾病的其他治疗方法包括热疗、玻璃体切割术、光动力疗法、放射疗法、外科手术，例如，除去多余的眼组织等。然而，在大多数情况下，所有可行治疗方法的治疗效果有限，需要重复且昂贵的疗程，和/或伴随危险的副作用。
许多类型的视网膜病变是增殖，最常起因于新血管形成或血管的过度生长。血管生成可能导致失明或严重的视力丧失，尤其是当黄斑被影响的时候。在某些罕见的情况下，视网膜病可以是由于遗传性疾病，如视网膜色素变性。在其他与眼睛中糖尿病并发症相关的干预治疗，可以使用玻璃体切割术。地塞米松，一种糖皮质激素甾体，已被指出能减少手术后的炎症，所述炎症在患有糖尿病的受试者中比无糖尿病的受试者还要强烈。因此，本发明的方法与地塞米松结合执行可能会是理想的作法。
组合疗法涉及，例如，施用CYP2C8的抑制剂(例如，孟鲁司特，非诺贝特或其他)与CYP2J2的抑制剂也可以考虑。示例性CYP2J2的抑制剂包括替米沙坦、氟桂利嗪、阿莫地喹、尼卡地平、米贝拉地尔、诺氟沙星、硝苯地平、尼莫地平、苯溴马隆、氟呱啶醇、美托洛尔、去炎松、奋乃静、苄普地尔、氯氮平、舍曲林、噻氯匹定、维拉帕米、氯丙嗪和头孢曲松(参见Ren等人，DrugMetab.Dispos.41:60-71)。
在其他与眼睛中糖尿病并发症相关的干预治疗中，光动力疗法可以被用于矫正血管闭塞或渗漏，并可能导致糖尿病受试者过度发炎。激光光凝疗法可以用于矫正血管闭塞或泄漏，并可能导致糖尿病受试者过度发炎。因此，可能会是理想的是使用治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂与光动力治疗的结合。本发明的治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂可以在治疗前给予受试者。
有DME的个体有较高的风险发展白内障，其为视力丧失的常见原因。糖尿病患者于白内障手术后有较高的风险在眼前节和眼后节有并发症。其中最显著者之一是虹膜的新血管形成，因为它可以发展为新生血管性青光眼。其他眼前房的并发症包括色素分散和沉积在新植入的人工晶状体(IOL)表面、纤维素渗出或眼前房的膜形成(来自炎症)。在本发明的一些具体实例中，想要减少DME受试者经眼睛白内障手术后在眼前节或眼后节的并发症，可通过施用细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂于有需要的受试者来实现。在一些具体实例中提供了方法，预防性地施用细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂于DME受试者，所述受试者相较于健康的受试者有较高的风险发展白内障，从而减少或防止白内障的发展。
其它这类病症和疾病可通过本发明的方法治疗，例如通过向受试者施用治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂，包括有血管发生或新血管形成特征的疾病。举例来说，增殖性疾病包括癌症和牛皮癣、各种以细胞增殖为特征的炎性疾病，如动脉粥样硬化和类风湿性关节炎，其中对细胞增殖的抑制是这些和其他疾病治疗所欲达成的目标。在某些具体实例中，防止血管生成和细胞增殖对于，例如，实体瘤的治疗是有益的，实体瘤是异常增殖的细胞和增加的肿瘤血管所引起，从而可作为被本发明药剂所抑制的靶标。在任一情况下，用以促进或抑制增殖的疗法可能是有益局部而非全身，而且对于特定期间，增殖调节疗法应该适当被应用。
根据本发明，可以被治疗的非限制性的癌症、肿瘤、恶性肿瘤、新生物，以及其他异常增殖性疾病的实例包括白血病例如骨髓和淋巴细胞白血病、淋巴瘤、骨髓增生性疾病、以及实体瘤，例如但不限于肉瘤和癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、和视网膜母细胞瘤。
如上所述，作为糖尿病性视网膜变的一个结果，眼睛玻璃体的血管形成是失明的主要原因，而这种血管形成的抑制是理想的。血管生成在其他状况下是不理想的，包括某些慢性发炎性疾病，特别是炎性关节和皮肤病，此外，还有其他发炎性疾病在增殖反应发生处，而且促成部分或全部的病状。例如，牛皮癣是一种常见的发炎性皮肤病，其特征是显著的表皮增生和新血管形成于真皮乳头中。平滑肌细胞的增殖，可能作为一个生长因子的结果，其为动脉粥样硬化中造成大血管狭窄和闭塞的因素，促成心肌缺血、心绞痛、心肌梗塞和中风，仅举几个例子。周边血管疾病和闭塞性动脉硬化症皆包括炎性成分。
在本发明的一些具体实例中，受试者被供给富含多不饱和脂肪酸(PUFA)的膳食，特别是富含ω3-PUFA的膳食。多不饱和脂肪酸(PUFAs)是在其主链上包含一个以上双键的脂肪酸。根据其化学结构，多不饱和脂肪酸可以被分类为各组：omega-3、omega-6和omega-9。示例性omega-3脂肪酸包括，但不限于十六碳三烯酸(HTA)、α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA、Timnodonicacid)、二十一碳五烯酸(HPA)、二十二碳五烯酸(DPA、Clupanodonicacid)、二十二碳六烯酸(DHA、Cervonicacid)、二十四碳五烯酸和二十四碳六烯酸(Nisinicacid)。示例性omega-6脂肪酸包括，但不限于亚油酸、γ-亚麻酸(GLA)、二十碳二烯酸、二均-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(AA)、二十二碳二烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯酸(Osbondacid)、二十四碳四烯酸和二十四碳五烯酸。示例性omega-9脂肪酸包括，但不限于油酸、二十碳烯酸、米德酸、芥酸和神经酸。
在本发明的一些具体实例中，诊断测试包括一种治疗方法，其是利用治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂或可溶性环氧化物水解酶(sEH)活性或表达的启动子。在一个具体实例中，执行糖尿病性视网膜病的诊断测试，对疾病作出诊断后，向受试者施用细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂或可溶性环氧化物水解酶(sEH)活性或表达的启动子，如本文所述。在本发明的一些具体实例中，诊断测试是通过受试者眼睛的造影成像或分析受试者眼睛的生物样品来进行。
施用方法
在本发明的一些具体实例中，治疗剂，例如治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达抑制剂或是治疗有效量的sEH活性或表达的启动子，通过局部、口服、眼周、眼内、注射、鼻、气溶胶、插入、植入装置或点滴施用。在本发明的其他具体实例中，治疗剂通过载体媒介物如液滴，液体洗涤、雾化液体、凝胶、软膏、气溶胶、喷雾剂、聚合物微颗粒和纳米颗粒、溶液、悬浮液、固体、可生物降解的基质、粉末、晶体、泡沫或脂质体施用。在本发明的一些具体实例中，治疗有效量的上述治疗剂通过局部或全身性传递送至上述受试者的眼睛。在本发明的一些具体实例中，进行眼内或眼周注射给药。在本发明的一些具体实例中，给药是通过施用凝胶、乳膏、粉末、泡沫、晶体、脂质体、喷雾剂、聚合物微球和纳米球，或所述化合物的液体悬浮液形式的眼内滴注来完成。在一些具体实例中，利用聚合物微球和奈米球通过眼周或眼内的注射或植入以传递治疗剂。
在本发明的一些具体实例中，治疗有效量的治疗剂通过局部或全身性传递至受试者的眼睛。
在本发明的一些具体实例中，治疗剂通过载体媒介物如液滴，液体洗涤、雾化液体、凝胶、软膏、气溶胶、喷雾剂、聚合物微颗粒和纳米颗粒、溶液、悬浮液、固体、可生物降解的基质、粉末、晶体、泡沫或脂质体施用。在本发明的一些具体实例中，局部给药包括所述化合物通过一装置输注至所述眼睛，所述装置是选自泵-导管系统、插入件、连续性或选择性的释放装置、生物可吸收的植入物、连续或持续释放制剂和接触透镜所组成的群组。在本发明的一些具体实例中，进行眼内、玻璃体内、眼周、皮下、结膜下，眼球后或前房内注射给药。控制释放的制剂也用于本发明的一些具体实例。在本发明的一些实施方案中，本发明的化合物被配制成前药。在本发明的一些具体实例中，治疗剂的配方不含防腐剂。在本发明的一些具体实例中，治疗剂的配方包括至少一种防腐剂。在本发明的一些具体实例中，治疗剂的配方包括增稠剂。在本发明的其他具体实例中，治疗剂的配方使用微米或纳米颗粒。
施用所述化合物于受试者的量足以达到眼内或视网膜中有效浓度，所述有效浓度是通过熟练的临床医师决定。例如，其量足以达到眼内或视网膜中浓度约1×10－8摩尔/升至1×10－1摩尔/升。在本发明的一些实施方案中，化合物是每年至少施用一次。在本发明的其他实施方案中，化合物是每天至少施用一次。在本发明的其他实施方案中，化合物是每周至少施用一次。在本发明的一些实施方案中，化合物是每月至少施用一次。
施用于受试者的CYP2C8和/或其它CYP抑制剂的示例性剂量包括但不限于以下：1-20mg/kg/天、2-15mg/kg/天、5-12mg/kg/天、10mg/kg/天、1-500mg/kg/天、2-250mg/kg/天、5-150mg/kg/天、20-125mg/kg/天、50-120mg/kg/天、100mg/kg/天、至少10μg/kg/天、至少100μg/kg/天、至少250μg/kg/天、至少500μg/kg/天、至少1mg/kg/天、至少2mg/kg/天、至少5mg/kg/天、至少10mg/kg/天、至少20mg/kg/天、至少50mg/kg/天、至少75mg/kg/天、至少100mg/kg/天、至少200mg/kg/天、至少500mg/kg/天、至少为1g/kg/天，以及治疗有效剂量，其小于500mg/kg/天、小于200mg/kg/天、小于100mg/kg/天、小于50mg/kg/天、小于20mg/kg/天、小于10mg/kg/天、小于5mg/kg/天、小于2mg/kg/天、小于1mg/kg/天、小于500μg/kg/天和小于500μg/kg/天。
在本发明的一些具体实例中，第二治疗剂的施用是早于治疗有效量的细胞色素P4502C8(CYP2C8)活性或表达的抑制剂或治疗有效量的sEH活性或表达的启动子的施用、或与其组合施用、或在同一时间施用或在其后施用。在一些具体实例中，第二治疗剂选自抗氧化剂、抗炎剂、抗微生物剂、类固醇、蛋白激酶C抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂、抗血管生成剂、补体抑制剂、CYP2J2抑制剂和抗细胞凋亡剂所组成的群组。在本发明的一些具体实例中，第二治疗剂是抗体或抗体片段。
随后的代表性实施例旨在说明本发明，而并不旨在，也不应被解释为限制本发明的范围。实际上，除本文所示和描述外，本发明和许多其它实施例的各种修改，通过本檔的全部内容，对本领域的技术人员而言将变得显而易见，所述内容包括以下的实施例以及本文所引用的科学参考文献和专利文献。还应该了解的是，这些参考文献的内容通过引用并入本文，以帮助说明本技术领域的状态。
实施例
本文描述一个新的ω3PUFA通过CYP2C8的代谢物，能加强新血管形成。这些结果表明，虽然富含ω3PUFA的膳食整体来说在视网膜病变中抑制新血管形成，CYP2C8的抑制可以作为一个有吸引力的新靶标以治疗视网膜病变，因为阻断CYP2C8可以抑制ω3PUFA和ω6PUFA这两个重要的膳食脂肪酸产生促血管生成的代谢物。
本文描述的结果表明，部分地，通过CYP2C8的ω3PUFA代谢物19,20-EDP有促血管生成的作用，以及可溶性环氧化物水解酶(sEH)有抗血管生成的作用，主要通过此环氧化镁途径增加19,20-EDP的分解来达成，如同在本文首度的证明所示。本文描述还证明，CYP2C8可使ω6PUFA(14,15-EET)和ω3PUFA(19,20-EDP)产生促血管生成的促视网膜病变代谢物，其中呈现了令人关注的视网膜病变治疗靶标——CYP2C8的抑制。此外，本文所描述的结果显示，在视网膜中，CYP2C8阳性细胞和代谢物来自循环，导致促血管生成的19,20-EDP(和14,15-EET)增加。CYP2C8的白细胞来源从未被显示。
在视网膜病变中，病理的新血管形成是失明的主要原因，因此找到有效的治疗方法是很重要的。ω3多不饱和脂肪酸(ω3PUFA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)通过环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)的活化代谢物2,3，在动物和临床研究中能防止视网膜病变的发展1,2。细胞色素P450s(CYPs)也能代谢ω3PUFA和ω6PUFA形成环氧化物，其由可溶性环氧化物水解酶(sEH)进一步水解形成活性较小的反式二氢二醇(二醇)，因此抑制PUFA环氧化物的生物效应。(图1A)4,5。因此，产生活化代谢物的CYP2C酶以及将所述代谢物分解的sEH酶，阐明这两者的作用以及解析它们对视网膜病变的影响是很重要的。
CYP2C8是人类中主要的环氧化酶，其被缺氧这个视网膜病变发展的重要因素所诱发6。sEH牵涉于心血管疾病8，并且在ECs中表达7，因此可直接调节血管生成。
通过CYP2C8从二十碳四烯酸(AA)合成的ω6PUFA衍生的环氧二十碳三烯酸(EETs)促进血管形成10，但是通过CYP2C8产生的ω3PUFA衍生的环氧代谢物：DHA衍生的环氧二十二碳五烯酸(EDPs)和EPA衍生的环氧二十碳四烯酸(EEQs)，它们在视网膜病变中对血管生成的作用仍然未知。然而，这两者展现出有效的血管舒张和保护心脏的作用11，而且EDPs被指出能抑制EC迁移和肿瘤的血管形成12。
在本文所述的实验中，为进行探讨CYP2C8和其ω3PUFA代谢物在OIR中的作用，使用内皮细胞(EC)和单核细胞/巨噬细胞特异性的CYP2C8和sEH过表达小鼠(Tie2-CYP2C8-Tg、Tie2-sEH-Tg)、sEH的种系基因剔除(sEH-/-)小鼠，以及它们的野生型(WT)同窝对照组，同时给予富含ω3PUFA的膳食。ω6PUFA在OIR中的CYP2C8和sEH代谢物也进行类似的检验。
实施例1：CYP2C，sEH及其代谢物在OIR与常氧的表达
小鼠的CYP2C8同系物(CYP2C)阳性细胞被发现存在于常氧下视网膜的血管管腔内(图1B和C)以及P17OIR视网膜的血管外，此相符于单核细胞/巨噬细胞从渗漏的血管迁移(图1B)。在OIR中，F4/80阳性的巨噬细胞也确定能表达CYP2C(图1D)。在OIR中，病理的新生血管和神经组织经鉴定能表达sEH(图1E)。CYP2C阳性的白细胞也在常氧下WT小鼠的血细胞中被侦测到(图1F)。CYP2C的mRNA表达量经鉴定为在全血中为最高，而且在没有灌注的视网膜中比有灌注的视网膜中明显更高，表示视网膜中的CYP2C来自于血细胞(图1G)。
视网膜中的CYP2C经证实在OIR期间会被诱发(mRNA和蛋白质皆是)，但sEH会被抑制(p<0.05；图1H和I)。表达CYP2C的巨噬细胞聚集伴随着血管渗漏增加，可能有助于OIR视网膜中增加CYP2C。视网膜中AA比DHA的环氧化物:二醇的比值，在P14(喂食正常)时，OIR比常氧下增加超过两倍(14,15-EET:14,15-DHET(p＝0.0073)和19,20-EDP:19,20DiHDPA(p＝0.017))(图1J)，此相符于CYP2C表达增加和sEH表达减少。
实施例2：喂食ω3PUFA对于Tie2-CYP2C8-Tg、Tie2-sEH-Tg和sEH-/-小鼠视网膜病变和VEGF表达的影响
食用ω3PUFA膳食，Tie2-CYP2C8-Tg(CYP2C8过表达)小鼠的OIR-新血管形成比WT小鼠多(全部视网膜区域的7.60±0.29％比6.40±0.33％，p＝0.014)(图2A)。同时，Tie2-sEH-Tg小鼠的视网膜新血管形成比WT小鼠少(4.67±0.34％比6.59±0.38％，p＝0.0027；图2B)。sEH的种系损失(sEH-/-)和WT相比，对于新血管形成没有进一步的影响(7.39±0.34％比7.35±0.32％，p＝0.95；图2C)，可能反映在OIR中已经很低的sEH表达量(图1F)。
喂食ω3PUFA后，比起WT小鼠，Tie2-CYP2C8-TgOIR小鼠的VEGF-A表达量多2.6倍(p＝0.011)，而Tie2-sEH-Tg小鼠的VEGF-A表达量少57％(p＝0.030)。VEGF-C表达量则没有侦测到显著差异(图2D和E)。
实施例3：以ω3PUFA喂养的OIR小鼠中，环氧化物的血奖水平量和视网膜的环氧化物:二醇的比值在Tie2-CYP2C8-Tg小鼠中增加，然而在Tie2-sEH-Tg小鼠中则减少
在OIR中，以ω3PUFA喂养的Tie2-CYP2C8-Tg小鼠经评估为其血浆中比WT小鼠多60％的19,20-EDP(p＝0.029)和多47％的17,18-EEQ(p＝0.030)。在这些样品中，19,20-EDP的浓度比17,18-EEQ的浓度高出30倍(图3A)。在Tie2-sEH-Tg小鼠中，19,20-EDP和17,18-EEQ的量减少了34％(p＝0.034)和24％(p＝0.016)。14,15-EET的量减少16％，p＝0.029；(图3B)。
在OIR中，以ω3PUFA喂养的Tie2-CYP2C8-Tg小鼠比WT小鼠，其视网膜中19,20-EDP:DiHDPA的比值高了52％(p＝0.045)；17,18-EEQ:17,18-DHET的比值则不变；(图3C)。以ω3PUFA喂养的Tie2-sEH-Tg小鼠视网膜中，19,20-EDP:DiHDPA的比值减少58％(p＝0.028)；17,18-EEQ:17,18-DHET的比值则不变。14,15-EET的比值减少60％(p＝0.043；图3D)。
实施例4：AA或DHA使主动脉环血管芽生增加，而Tie2-sEH-Tg小鼠的主动脉环芽生会被19,20-EDP抑制
CYP2C8衍生物的促血管生成作用和sEH的抗血管生成作用在血管生成时参与处理ω3PUFA代谢物，这些作用可以通过主动脉环芽生试验来证实。在WT中30μMAA(对30μMDHA)使主动脉环芽生增效(p＝0.01)，但在Tie2-CYP2C8-Tg中失效。经DHA处理的Tie2-CYP2C8-Tg比WT有增加的主动脉环芽生(p＝0.43；图4A)。经17,18-EEQ处理的WT、Tie2-sEH-Tg和sEH-/-小鼠之间的主动脉环芽生没有差异，对比于经19,20-EDP处理的Tie2-sEH-Tg比WT少50％的主动脉环芽生(p<0.01；图4B)。这些结果证实Tie2-CYP2C8-Tg促进有ω3PUFA的血管生成，以及表示在Tie2-sEH-Tg中减少的新血管形成可直接归因于过表达的sEH造成19,20-EDP降解加速。
实施例5：在OIR中，ω3PUFA喂养使Tie2-CYP2C8-Tg小鼠的新血管形成增加
以ω6PUFA喂养的Tie2-CYP2C8-Tg相较于WT，其诱发OIR新血管形成(9.458±0.3425比8.291±0.3979，p＝0.032)。相反地，在Tie2-sEH-Tg或sEH-/-中没有看到差异(图5)。Tie2-CYP2C8-Tg相较于WT，其血浆中14,15-EET和视网膜中14,15EET:14,15-DHET的比值增加，此与新血管形成增加为一致(图6A-D)。经14,15-EET处理后，在Tie2-sEH-Tg、sEH-/-和WT中观察到的主动脉环芽生是类似的(图6E)。
实施例6：非诺贝特作为有治疗效果的CYP2C8抑制剂的鉴定
非诺贝特先前已被描述为降低胆固醇的药，它可以通过过氧化酶体增殖物启动受体alpha(PPARα)的活化来降低受试者的脂肪的量。具体而言，PPARα已被描述为能活化脂蛋白脂肪酶和降低载脂蛋白CIII，从而增加脂肪分解和消除血浆中富含甘油三酯的粒子(Staelsetal.Circulation98:2088-93)。为了检验非诺贝特作为视网膜血管疾病治疗物的功效和机制，如下详述通过灌胃(GV)向小鼠施用非诺贝特，从而鉴定非诺贝特在氧诱导视网膜病变(其在Cyp2C8Tg小鼠中加剧)中，通过抑制Cyp2C8活性，可作为新血管形成的抑制剂。
如图7所示，当非诺贝特通过灌胃施用予正常喂养的JAX小鼠(WT)时，观察到新血管形成在统计上显著地降低。值得注意的是，观察到低剂量(10mg/kg/天GV)和高剂量(100mg/kg/天GV)的非诺贝特皆会在这些小鼠中造成新血管形成显著的减少。由于预期PPARα相关的效果只有在非诺贝特的剂量高时才会被诱发，因此低剂量非诺贝特的对于新血管形成的效果是令人意外的，而且意味着非诺贝特在新生血管的抑制中，有不依赖PPARα的作用模式。
为了验证非诺贝特是否至少有些效果是确实不依赖PPARα，在施用非诺贝特的PPARα基因剔除小鼠中评估新血管形成的抑制。如图8所示，在PPARα基因剔除小鼠中得到相似于那些在JAX(WT)小鼠中观察到的结果。具体而言，在正常喂养的PPARα基因剔除小鼠中，低剂量(10mg/kg/天GV)和高剂量的非诺贝特(100mg/kg/天GV)皆会造成新血管形成(NV)显著减少。因此，所观察到非诺贝特抑制NV的效果被证实为不依赖PPARα。
为了验证非诺贝特是否通过CYP2C8的调节来减少NV，检验施用非诺贝特对CYP2C8过表达小鼠(Cyp2C8转基因小鼠，\"Cyp2C8Tg\")的影响。如图9所示，相较于在对应的WT小鼠中观察到的减少幅度，在施用低剂量非诺贝特(10mg/kg/天GV)的小鼠中观察到的NV减少程度的幅度在CYP2C8过表达小鼠中提高。在喂食ω3(n3)或ω6(n6)的小鼠中皆可观察到相似的结果(在CYP2C8过表达小鼠中，NV的抑制增强)，表示ω3和ω6途径皆涉及这些CYP2C8依赖性结果。
进一步在主动脉环芽生试验研究所观察到的非诺贝特作用的机制。如图10所示，观察到非诺贝酸(FA，非诺贝特的活性代谢物)抑制WT小鼠和Cyp2C8Tg小鼠的主动脉环芽生。这个结果归因于FA抑制CYP2C8，与其一致的是，此抑制会部分被19,20-EDP(DHA经CYP2C8代谢后的产物，如下图22所示)恢复。的确，如图11所示，当施用DHA而非19,20-EDP时，无法看见FA对主动脉环芽生的抑制有所恢复。表示被作为CYP2C8抑制剂的FA所阻断的NV/主动脉环生长过程中，有CYP2C8代谢后产物的参与和Cyp2C8酶的抑制。
此外，如图12所示，当PPARα抑制剂GW6471被检验且发现不会影响所观察的FA对主动脉环芽生的效果，证实了FA抑制WT小鼠和Cyp2C8Tg小鼠主动脉环芽生的效果是不依赖PPARα。
已经证实非诺贝特减少新血管形成和减少主动脉环芽生的效果，接着检验相对应一系列的人类视网膜的微血管内皮细胞(HRMEC)小管形成的效果。如图13所示，观察到FA抑制HRMEC小管形成，而且如同上述图10的FA和主动脉环芽生试验所述，此作用会部分被19,20EDP恢复。这些结果在图14中被量化并以直方图呈现，其中19,20EDP(CYP2C8的omega3代谢物)部分恢复被FA抑制的HRMEC小管形成。如图15所示，类似于DHA已被鉴定无法恢复所观察到非诺贝特对主动脉环芽生的效果，另一个CYP2C8的上游化合物w3LCPUFA，被发现无法恢复被FA抑制的HRMEC小管形成。在图16中，这些实验的结果量化并以直方图形式呈现。
如图17和图18所示，当PPARα抑制剂GW6471被检验且发现不会影响所观察到非诺贝特对HRMEC小管形成的作用，非诺贝特被鉴定为通过不依赖PPARα的方式抑制HRMEC小管形成。
对比于CYP2C8酶的上游化合物(DHA、EPA、w3LCPUFA)，CYP2C8酶的下游化合物持续被鉴定为至少具有部分恢复的特性。在图19中，19,20EDP和17,18EEQ(EPA和CYP2C8的下游化合物)被鉴定能部分恢复FA造成的HRMEC迁移的抑制。在图20中，w3LPUFA被鉴定不能恢复FA造成的HRMEC迁移的抑制。在图21中，当PPARα抑制剂GW6471被检验且发现不会影响所观察到非诺贝特对HRMEC迁移的作用，所观察到的FA抑制HRMEC迁移是不依赖PPARα。图22显示在ω3和ω6途径中，非诺贝特/FA被评估的作用位点。
实施例7：孟鲁司特作为一种有治疗效果的CYP2C8抑制剂的鉴定
孟鲁司特是白三烯受体拮抗剂(LTRA)，先前已用于哮喘的持续治疗，并缓解受试者的季节性过敏症状(Lipkowitzetal.TheEncyclopediaofAllergies(2nded.))。孟鲁司特可做成口服的片剂、咀嚼片和颗粒剂，通常一天一次，可或不用与食物一起服用。孟鲁司特主要被认为是一种CysLTl拮抗剂；通过结合至肺和支气管中的半胱氨酰白三烯受体CysLTl，阻断白三烯D4(和第二配体LTC4和LTE4)在其上的作用。不希望受理论的束缚，这被认为是减少由白三烯引起的支气管收缩，从而减少炎症。
在当前的例子中，孟鲁司特被新鉴定为CYP2C8的抑制剂，具有类似上述所观察非诺贝特的效果。具体而言，如图23所示，当孟鲁司特施用于正常喂养的JAX小鼠(WT)时，观察到的新血管形成在统计上显著地降低。
如图24所示，孟鲁司特的作用发生是通过CYP2C8的调节来减少NV，由检验施用孟鲁司特对CYP2C8过表达小鼠(CYP2C8的转基因小鼠，\"Cyp2C8Tg\")的影响得到证实。如同上述的非诺贝特，相较于在对应的WT小鼠中观察到的减少幅度，在施用孟鲁司特(10mg/kg/天GV)的小鼠中观察到的NV减少程度的幅度在CYP2C8过表达小鼠中提高。在喂食ω3(n3)或ω6(n6)的小鼠中皆可观察到相似的结果(在CYP2C8过表达小鼠中，NV的抑制增强)，表示ω3和ω6途径皆涉及孟鲁司特这些CYP2C8依赖性结果。
图25和图26表明孟鲁司特对于HRMEC小管形成的作用呈现明显的剂量响应曲线，其结果也与那些用非诺贝特所观察到的结果类似，而在图27中，观察到HRMEC的迁移被孟鲁司特抑制，也以明显的剂量响应曲线的方式呈现。因此，在所有试验中，孟鲁司特展示出类似非诺贝特的效果，表示孟鲁司特和非诺贝特皆为有治疗效果的CYP2C8抑制剂。
在另外的孟鲁司特的实验中，也进行类似于上述非诺贝特的主动脉环试验。
寻找新的方法来治疗视网膜病变是很重要的。已经确立的是，整体而言，在OIR中，喂食ω3PUFA能通过COX和LOX的抗血管生成的代谢物来减少新血管形成。本文描述CYP2C8和sEH在ω3PUFA介导的视网膜病变中的新角色，因为CYP2C8过表达(由Tie2驱动)协同主要喂食ω3PUFA，通过增加血浆中DHA衍生的19,20-EDP和视网膜中19,20-EDP:DiHDPA的比值，加强新血管形成。EPA衍生的EEQ浓度低30倍。由Tie2驱动的sEH过表达协同喂食ω3PUFA，不仅通过减少血浆中的19,20-EDP和视网膜中19,20-EDP:DiHDPA的比值减少新血管形成，而且通过减少促血管生成的AA衍生的14,15-EET的血浆水平量和视网膜中14,15-EET:14,15-DHET的比值减少新血管形成。在OIR的野生型小鼠中CYP2C被诱发(主要在巨噬细胞和白细胞)而且sEH被降低，增加19,20-EDP的水平。
最近的研究发现，EDPs通过抑制VEGF-C来抑制EC迁移和肿瘤血管生成12，而对VEGF-A没有影响。在视网膜中，以ω3PUFA喂养的Tie2-CYP2C8-Tg中发现VEGF-A增加，但没有发现VEGF-C表达改变，而且在Tie2-sEH-Tg中发现VEGF-A表达减少，这与其等在OIR中被观察到的新血管形成表型一致。这些结果意味着AA、DHA和EPA代谢物以及代谢酶之间复杂的串扰。CYP2C的过表达可能会诱发COX-214以及14,15-EET的稳定化可能会降低5-LOX15表达，皆影响活化的PUFA代谢物水平。此外，取决于CYP2C8和sEH的组织特异性表达，19,20-EDP可能具有不同的血管生成功能。表达CYP2C8的心肌细胞使心脏缺血/再灌注后的恢复增加。然而，表达CYP2C8的ECs使恢复减少7。在OIR视网膜中，白细胞衍生的EETs能诱导白细胞和EC粘附16，并可能引起Cyp2C阳性单核细胞/巨噬细胞的浸润。进一步研究COX、LOX和CYP途径以及代谢物之间的相互作用是必要的。目前的结果表明，CYP2C8的抑制可以预防ω3PUFA和ω6PUFA的代谢物诱发的视网膜病变，其已通过使用和观察CYP2C8抑制剂化合物孟鲁司特和非诺贝特在各种试验中的成效来证实，这些试验能反映治疗视网膜病变(在其他疾病和病症之间)的作用，包括新血管形成、主动脉弓生长、HRMEC小管形成和迁移试验。
方法
本文所描述的实施例通过但不限于下列方法来实行。
氧诱导视网膜病变(OIR)；PUFA膳食干预；主动脉环试验
OIR的小鼠模型已经被描述13。利用免役组织化学染色、实时PCR、西方墨点法、血涂片和LC/MS/MS氧脂素(oxylipid)分析C57BL/6J小鼠。在OIR中，喂养Cyp和sEH突变小鼠的母鼠富含ω3PUFA和ω6PUFA的膳食，接着分析视网膜、血浆和主动脉环芽生。
动物
所有研究符合视觉与眼科学研究协会(ARVO)关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明以及得到波士顿儿童医院的动物保护和使用委员会的批准。内皮细胞和循环细胞特异性CYP2C8(由Tie2启动子驱动)过表达的转基因小鼠(Tie2-CYP2C8Tg)、内皮细胞和循环细胞特异性sEH(由Tie2启动子驱动)过表达的转基因小鼠(Tie2-sEHTg)、全身sEH基因剔除小鼠(SEH-/-)是来自DarrylC.Zeldin博士(NIH/NIEHS)的惠赠，以及野生型对照组C57B1/6J小鼠(库存号000664；JacksonLaboratory)用于本实验中。Tie2-CYP2C8Tg的重量为6.65±0.17g(平均值±平均值标准误差)和野生型同窝对照组的重量为6.50±0.05g。Tie2-sEHT的重量为6.85±0.62g和野生型同窝对照组的重量为6.10±0.61g。sEH-/-的重量是6.50±0.19g和野生型同窝对照组的重量为6.85±0.15g。
氧诱导视网膜病变
氧诱导视网膜病变的小鼠模型已如前所述(Smith等人，InvestOphthalmolVisSci35:101-111)。为了诱导血管损失，将小鼠从出生后第7天(P7)到P12暴露于75％的氧。暴露于高氧诱导视网膜中央血管闭塞，会引发过度的血管生成反应导致新血管形成。在P17当新生血管反应最大时，给予小鼠腹膜内致死剂量的阿佛丁(Sigma)。
免疫组织化学染色
摘除野生型常氧和高氧的P17小鼠眼睛，用4％低聚甲醛室温固定1小时。为了整体包埋免疫染色，解剖视网膜，用1％的TritonX-100(Sigma，货号T-8787)的PBS在室温下透化处理2个小时，并使用兔抗小鼠CYP2C(Abeam，货号ab22596，1:100稀释)、大鼠抗小鼠F4/80(Abeam，货号ab6640，1:100稀释)和同工凝集素B4染色使血管可视化，如上所述。为了视网膜横截面免疫染色，固定后1小时内取出晶状体。眼杯在30％的蔗糖中进行4℃孵育，接着置入于OptimalCuttingTissuemedium(OCT)中。10μm厚的切片置于VistaVisionHistobond载玻片(VWR，货号16004-406)上，接着在0.1％的TritonX-100和5％山羊血清的PBS中进行阻断。利用同工凝集素B4和初级抗体山羊抗小鼠sEH(SantaCruz，货号sc-22344，1:200稀释)，以及随后的二级抗体，对切片进行染色。视网膜是使用LeicaSP2共聚焦显微镜的40倍物镜和2倍变焦观察。由于是整体包埋，因此采取0.16微米的间隔堆栈光学切片并使用Velocity软件在YZ平面重建三维图像。
分离RNA和制备cDNA
在几个时间点，从来自不同窝的6只小鼠的视网膜萃取总RNA，将RNA汇集以减少生物变异性(n＝6)。用研钵和杵将每个时间点取得的视网膜裂解，并通过QiaShredder管柱(Qiagen，货号79656)过滤。接着按照RNeasy试剂组(Qiagen，货号74104)制造商的使用说明提取RNA。为了产生cDNA，用DNaseI(Qiagen，货号79254)处理1μg总RNA以去除任何基因组DNA的污染，然后使用随机六聚体和SuperscriptIII反转录酶(LifeTechnologiesCorp，货号18080-044)进行反转录。分装并储存所有的cDNA样品于-80℃。
实时聚合酶炼反映
用HarvardPrimerBank和NCBIPrimerBlastSoftware设计靶向Cyp2c55的PCR引物(F：5'-AATGATCTGGGGGTGATTTTCAG-3'，R：5'-GCGATCCTCGATGCTCCTC-3')、靶向sEH的PCR引物(F：5'-ATCTGAAGCCAGCCCGTGAC-3'，R：5'-CTGGGCCAGAGCAGGGATCT-3')和不变的控制组基因亲环素A(F：5'-AGGTGGAGAGCACCAAGACAGA-3'，R：5'-TGCCGGAGTCGACAATGAT-3')。使用ABIPrism7700序列检测系统和SYBRGreen预混试剂组(KapaBioSystems，货号KK4602)进行基因表达的定量分析。基因的表达是利用ΔcT法计算Cyp2c55和sEH相对于亲环素A的基因表达来呈现。
西方墨点法分析
常氧和高氧的野生型小鼠在出生后(P)9、12、14和17天牺牲，收集其视网膜，在有蛋白酶抑制剂(1:1000稀释)的细胞裂解缓冲液(CellSignalling，货号9803)中匀化和超声处理。使用PierceTMBCA蛋白质测定试剂组(ThermoScientific，货号23255)将样品标准化。在SDS-PAGE凝胶中加入50μg的视网膜裂解物，可以通过它们分子量差异来分离，并转渍到PVDF膜上。经阻断后，所述PVDF膜与山羊抗小鼠sEH初级抗体(SantaCruz，货号SC-22344)或兔抗小鼠CYP2C(Abcam，货号ab22596)在5％的BSA中4℃孵育过夜。第二次是与辣根过氧化物酶结合的兔抗山羊和驴抗兔IgGs(1：10000稀释)于室温下孵育1小时。使用ECL加底物产生化学发光信号，并使用KODAK底片感光成像。使用ImageJ1.46r(NIH)软件进行密度分析。
膳食干预
膳食的实验中，多不饱和脂肪酸(PUFA)、花生四烯酸(AA)和二十二碳六烯酸(DHA)的补充来自于商品名ROPUFA、ARASCO和DHASCO，分别从DSMNutritionalProducts(dsmnutritionalproducts.com)获得，并与ResearchDietsIncorporated(researchdiets.com/)的啮齿动物饲料混合。膳食长期稳定并且暴露于氧气。分娩时，以规定的啮齿动物膳食喂食母鼠，有10％(W/W)红花油包含2％ω-6多不饱和脂肪酸(AA)且无ω-3多不饱和脂肪酸(DHA和EPA)，或者包含2％ω-3多不饱和脂肪酸且无ω-6多不饱和脂肪酸。
视网膜血管闭塞和新血管形成的定量
摘除OIR眼睛并在4％多聚甲醛中以4℃在进行固定1小时。解剖视网膜并在23℃下染色过夜，是利用AlexaFluor594荧光标记的GriffoniaBandereiraeaSimplicifolia同工凝集素B4(MolecularProbes，货号121413，1：100稀释)在含1mM氯化钙的PBS中染色。接着洗涤2小时，视网膜是整体包埋至Superfrost/Plus显微镜载玻片(Fisher，货号12-550-15)，其感光侧朝上，并置于SlowFadeAntifade试剂(Invitrogen，货号S2828)中。为了量化视网膜新血管形成，利用ZeissAxioObserver.Zl显微镜获得5倍放大倍率的20张整体包埋视网膜图像，并以AxioVision4.6.3.0软件合并成图像。使用AdobePhotoshop定量血管闭塞，以及使用ImageJ1.46r(NIH)软件上的SWIFT_NV法分析新血管形成，如先前所描述(Stahl等人，Angiogenesis12:297-301)。
大血管从体外种植的主动脉环芽生
麻醉Tie2-CYP2C8Tg、Tie2-sEHTg、SEH-/-小鼠和同窝野生型小鼠，并用温PBS进行心脏灌注。解剖游离主动脉，切成1mm厚的环，并嵌入在24孔组织培养板中的30μL低生长因子MatrigelTM(BDBiosciences，货号354230)。然后每孔加入500μL的生长因素活化的CSC完全培养基(CellSystems，货号420-500)，并于任何治疗前，在37℃用5％CO2孵育48小时。培养基中含有5单位/mL青霉素/链霉素(GIBCO，货号15142)以防止污染。
Tie2-CYP2C8Tg小鼠和同窝出生的野生型对照组小鼠的主动脉环种植后48小时，加入DHA(CaymanChemical，货号90310，30μΜ)和AA(CaymanChemical，货号90010，30μΜ)到培养基中。Tie2-sEHTg小鼠、sEH-/-小鼠和与牠们同窝出生的野生型对照组小鼠的主动脉环种植后48小时，加入17(18)-EpETE(EEQ)(CaymanChemical，货号50861，1μΜ)、19(20)-EpDPE(EDP)(CaymanChemical，货号10175，1μΜ)和14,15-EE-8(Z)-E(EET)(CaymanChemical，货号10010486，1μΜ)到培养基中。所有组的培养基每48小时更换一次。使用ZEISSAxioOberver.Zl显微镜拍摄个别外种植168小时后(治疗后120小时)的相位对比照片。利用计算机软件ImageJ1.46r(美国国家卫生研究院)对大血管芽生的区域的进行量化。能定量血管芽生的半自动宏插件可向作者取得。
统计分析
除非另有说明，所有直方图的数据表示皆为平均值±SEM。由于样本呈正态分布，组间比较是由不成对的双尾学生T检验或是方差分析(AVOVA)，接着由Bonferroni校正事后检验来比较平均值。P<0.05被认为是具有统计学上意义。
以参考方式并入
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等价
本领域的技术人员能够了解，或无须过度实验就能确定许多等同于本文中所描述的本发明具体实施例。这样的等价欲由以下权利要求所涵盖。
本文所述变量的定义中列举元素的记载，包括所述变量作为任何单一元素或所列元素的组合(或子组合)的定义。本文所述一个实施方案的记载包括所述实施方案作为任何单一实施方案或与任何其他实施方案或其部分结合。
参考文献
1.HellstromA,SmithLE,DammannO.Retinopathyofprematurity.Lancet.Jun142013.
2.ConnorKM,SanGiovanniJP,LofqvistC,AdermanCM,ChenJ,HiguchiA,HongS,PravdaEA,MajchrzakS,CarperD,HellstromA,KangJX,ChewEY,SalemN,Jr.,SerhanCN,SmithLE.Increaseddietaryintakeofomega-3-polyunsaturatedfattyacidsreducespathologicalretinalangiogenesis.NatMed.Jul2007；13(7):868-873.
3.SapiehaP,StahlA,ChenJ,SeawardMR,WillettKL,KrahNM,DennisonRJ,ConnorKM,AdermanCM,LiclicanE,CarughiA,PerelmanD,KanaokaY,SangiovanniJP,GronertK,SmithLE.5-Lipoxygenasemetabolite4-HDHAisamediatoroftheantiangiogeniceffectofomega-3polyunsaturatedfattyacids.Sciencetranslationalmedicine.Feb92011；3(69):69ral2.
4.ArnoldC,KonkelA,FischerR,SchunckWH.CytochromeP450-dependentmetabolismofomega-6andomega-3long-chainpolyunsaturatedfattyacids.PharmacolRep.May-Jun2010；62(3):536-547.
5.PanigrahyD,GreeneER,PozziA,WangDW,ZeldinDC.EETsignalingincancer.Cancermetastasisreviews.Dec2011；30(3-4):525-540.
6.MichaelisUR,FisslthalerB,Barbosa-SicardE,FalckJR,FlemingI,BusseR.CytochromeP450epoxygenases2C8and2C9areimplicatedinhypoxia-inducedendothelialcellmigrationandangiogenesis.Journalofcellscience.Dec12005；118(Pt23):5489-5498.
7.EdinML,WangZ,BradburyJA,GravesJP,LihFB,DeGraffLM,FoleyJF,TorphyR,RonnekleivOK,TomerKB,LeeCR,ZeldinDC.EndothelialexpressionofhumancytochromeP450epoxygenaseCYP2C8increasessusceptibilitytoischemia-reperfusioninjuryinisolatedmouseheart.FASEBJ.Oct2011；25(10):3436-3447.
8.ImigJD,HammockBD.Solubleepoxidehydrolaseasatherapeutictargetforcardiovasculardiseases.NatRevDrugDiscov.Oct2009；8(10):794-805.
9.ZhangW,KoernerIP,NoppensR,GrafeM,TsaiHJ,MorisseauC,LuriaA,HammockBD,FalckJR,AlkayedNJ.Solubleepoxidehydrolase:anoveltherapeutictargetinstroke.Journalofcerebralbloodflowandmetabolism:officialjournaloftheInternationalSocietyofCerebralBloodFlowandMetabolism.Dec2007；27(12):1931-1940.
10.ImigJD.Epoxidesandsolubleepoxidehydrolaseincardiovascularphysiology.PhysiolRev.Jan2012；92(1):101-130.11.KonkelA,SchunckWH.RoleofcytochromeP450enzymesinthebioactivationofpolyunsaturatedfattyacids.BiochimBiophysActa.Jan2011；1814(l):210-222.
12.ZhangG,PanigrahyD,MahakianLM,YangJ,LiuJY,StephenLeeKS,WetterstenHI,UluA,HuX,TarnS,HwangSH,InghamES,KieranMW,WeissRH,FerraraKW,HammockBD.Epoxymetabolitesofdocosahexaenoicacid(DHA)inhibitangiogenesis,tumorgrowth,andmetastasis.ProcNatlAcadSciUSA.Apr32013.
13.SmithLE,WesolowskiE,McLellanA,KostykSK,D'AmatoR,SullivanR,D'AmorePA.Oxygen-inducedretinopathyinthemouse.InvestOphthalmolVisSci.Jan1994；35(1):101-111.
14.MichaelisUR,FalckJR,SchmidtR,BusseR,FlemingI.CytochromeP4502C9-derivedepoxyeicosatrienoicacidsinducetheexpressionofcyclooxygenase-2inendothelialcells.ArteriosclerThrombVaseBiol.Feb2005；25(2):321-326.
15.RevermannM,MiethA,PopescuL,PaulkeA,WurglicsM,PellowskaM,FischerAS,SteriR,MaierTJ,SchermulyRT,GeisslingerG,Schubert-ZsilaveczM,BrandesRP,SteinhilberD.Apirinixicacidderivative(LP105)inhibitsmurine5-lipoxygenaseactivityandattenuatesvascularremodellinginamurinemodelofaorticaneurysm.BrJPharmacol.Aug2011；163(8):1721-1732.
16.LiuX,ZhuP,FreedmanBD.Multipleeicosanoid-activatednonselectivecationchannelsregulateB-lymphocyteadhesiontointegrinligands.AmJPhysiolCellPhysiol.Mar2006；290(3):C873-882.