天然降压素的处方组成：人参、鹿茸、枸杞子、何首乌、天麻、钩藤、地骨皮、葛根、灵芝草、远志、夏枯草、银杏叶、菊花、茯苓、甘草。天然降压素的制取：将处方中的15味中草药分别筛制干净，60目粉碎机分别粗粉，分别放入超临界CO2流体萃取器。流体萃取的压力最佳是41mpa.流体萃取的最佳温度是55℃.流体动态萃取的最佳时间是32分钟。流体萃取中最优的夹带剂是乙醇。流体萃取中的夹带剂用量是整体提取量的20分之一。动态流体萃取32分钟，进行界面提取，分别提出各味中药的有效成分，如降压素素、人参甙、亚油酸、牛磺酸、枸杞多糖。上述提取的各种中药有效成分，混合之后即为天然降压素。天然降压素疗效的基础研究原发性高血压的实质，是血管内皮细胞的功能障碍。体内氧化应激条件下所产生的自由基损伤，是造成血管内皮细胞功能障碍的重要机制。自由基可以灭活NO[1]，抑制NOS的活性[2]，导致NO的生成大大减少，ET-1的合成与释放大大增加，表现出持久的缩血管效应，使原发性高血压得以起动和维持。根据这一理论认识，为有效的治疗原发性高血压，将研究发现的可治愈原发性高血压的天然中草药，如葛根、远志、灵芝草[3]，应用超临界流体萃取技术，提取各味植物药草的主要有效成分，制成中药新药----天然降压素，经高效液相色普技术纯化，配成一定浓度的试验用药液，进行原发性高血压大鼠的基础实验研究。一、材料与方法1、实验动物：雄性原发性高血压大鼠(SHR)，购于北京利华实验动物中心。体重200-220克，血压(176.6±3.4)。主要仪器：定量PCR仪(美国ABI公司)；流式细胞仪(美国BD公司FACSC-alibur)；透射电子显微镜(日立7500型)；RBP-1型大鼠血压计(中日友好医院医学研究所)；生化分析仪lisa3000plus(法国HYEL)；酶标仪(美国Bio-Tec生物科技公司产品)；主要试剂：逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒，购自美国QIAGEN公司；NO、NOS、MDA、SOD试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；ET-1试剂盒，由北京华美生物工程有限公司提供。2、实验药物：灵芝草，购于北京同仁堂药店，经超临界流体萃取技术萃取，萃取压力30千帕，萃取温度65℃，夹带剂为60％乙醇，萃取时间60分钟。所提膏状提取物，经高效液相色谱技术纯化，冷冻干燥后，粉碎装入胶囊，每粒0.3g，相当于原生药6g。实验时取胶囊内容物加蒸馏水溶化，配成60g/L的剂量。阳性对照药卡托普利片，常州制药厂生产，批号312731，每片25mg，研末加蒸馏水配成含量为2.5g/L。二、实验方法：1.动物分组和治疗：雄性原发性高血压大鼠(SHR)30只，血压(176.6±3.4)mmHg，随机分成对照组、天然降压素治疗组(简称天然降压素组)、阳性药物卡托普利对照组(简称阳性组)。各组SHR在正常饲养的基础上，对照组给以蒸馏水灌胃治疗，天然降压素组给以天然降压素0.6g/kg灌胃治疗，阳性组给以卡托普利0.03g/kg，每天1次灌胃治疗。2.大鼠血压测量：治疗8周后，测量SHR大鼠的血压，重复测定3次。3.生化指标检测：各组大鼠治疗后，空腹6h，麻醉后左颈总动脉插管取血5ml，离心后取上清液，按照试剂盒说明，测定NO、NOS、ET-1、SOD、MDA的含量，及血脂的变化。用考马斯亮蓝比色法进行蛋白定性，测定SOD、NOS的活性。5.分子生物学指标的测定采用NorthernBlotting方法、免疫组化、Western印迹和RT-PCR法检测SOD、NOS、HDL的基因表达，用流式细胞术检测内皮细胞的凋亡。4、统计方法：各组实验所得数据用(X±S)表示，采用SPSS17.0统计软件进行成组设计的t检验和方差分析，比较各组之间的差异。三.实验结果1.血压的变化：各组大鼠治疗8周后，天然降压素组大鼠的血压趋于正常水平，和对照组比较，P＜0.01，和阳性组比较，P＜0.01。动性观察可见，天然降压素有增强大鼠体能的作用。具体数据见表1。表1各组大鼠治疗8周后的血压变化(x±S，mmHg)注：天然降压素组、阳性组分别与对照组比较，#：P＜0.05，##：P＜0.01；天然降压素组与阳性组比较，*：P＜0.05，**：P＜0.01。下同2.各组大鼠治疗后血清NO、NOS、ET-1的变化：天然降压素组大鼠的NO的含量显著升高，ET-1的水平显著下降，和对照组比较，P＜0.01。详细数据见表2。表2各组大鼠治疗前NO、NOS、NOS、ET的变化(x±s，n＝10)3.各组大鼠治疗后抗氧化指标的变化：天然降压素组大鼠MDA的含量明显下降，SOD的活性明显上升，和对照组比较，P＜0.01，详细数据见表3。表3各组大鼠治疗后MDA及SOD的变化(x±s，n＝10)4.各组大鼠治疗后基因表达的检测结果：天然降压素组大鼠主动脉SOD、NOS的基因表达明显上调，肝脏HDL的基因表达也明显上调，和对照组比较，P＜0.01。内皮细胞的凋亡率也明显降低，和对照组比较，P＜0.01。表4各组大鼠治后主动脉SOD、NOS、肝脏HDL基因表达的变化及EC的凋亡率(x±s)5.各组大鼠治疗后血脂的变化：各组大鼠治疗8周后，天然降压素组大鼠的血清TC、TG、LDL均明显降低，而HDL的水平显著上升，和对照组比较，P＜0.01。详细数据见表5。表5各组大鼠冶疗后血清脂类代谢的变化(x±s，n＝10)讨论氧化应激条件下所产生的自由基，是内皮细胞功能障碍的重要机制，是原发性高血压的实质。高血压状态时，NO的生成量显著降低，而NO是体内重要的信使分子和效应分子，为血管的舒张、神经信号的传递，起着重要的调控作用[4]。NOS是催化NO合成的主要物质[5]。自由基可以灭活NO，并加速一氧化氮的降解。从而导致内皮细胞功能障碍的发生，导致ET-1的合成和释放增加，表现出持久的缩血管效应。因此，高血压的药物治疗研究，应以清除自由、增加NO的生成，改善和恢复内皮细胞的功能为靶点。体内过高的LDL，可进入内皮细胞，刺激内皮细胞产生活性氧，它可作为信号传导通路的第二信使，诱导内皮细胞的损伤[6]，又可抑制内皮细胞中NOS的活性，并加速NO的降解，导致内皮细胞的凋亡[7]。本研究结果表明，天然降压素组大鼠的SOD的基因表达明显上调，活性明显增强，MDA的含量明显降低，同时内皮细胞的凋亡率也明显降低，和对照组比较，差异都十分显著。由此证明，天然降压素可有效地促进SOD的基因表达，增强SOD的含量与活性，清除自由基，减少MDA的生成，又可抑制内皮细胞的凋亡，从抗氧化、抗凋亡的角度，改善和恢复内皮细功能，从而使高血压得到有效的治疗。NO和ET-1是内皮细胞分泌的一对相互拮抗的活性物质。正常情况下，两者的拮抗效应处于动态平衡之中，从而维持着血管的正常舒张和收缩功能，以及血压的稳定。高血压状态时，NOS的活性被抑制，NO的生成大大减少，导致ET-1的过度合成和释放。这一活性物质的水平升高，表现为持久的缩血管效应，进一步促使高血压的形成和发展。本研究结果表明，天然降压素组大鼠NOS的基因表达明显上调，NO的生成显著上升，ET的水平显著下降。由此证明，天然降压素可有效地促进NOS的基因表达，增加NOS的含量与活性，促进NO的生成，降低ET-1的水平，在改善内皮细胞的功能上，使血压稳定在正常状态。LDL在血管内皮下的沉积，是氧化应激反应的基础，是高血压形成的重要始动环节之一[8]，氧化应急的原因，是脂类的代谢异常所致。而HDL在脂类代谢中起着非常重要的作用。HDL的主要功能，是将血浆中激离的胆固醇转化成胆固醇酯，阻止激离的胆固醇在血管壁的沉积，阻止内皮细胞功能障碍的发生。有研究证明，HDL在脂类的代谢机制中，表现为一个HDL分子可以转运5--6个LDL分子或TG分子至肝脏进行分解代谢。然而，由于HDL的分子体积特别小，可穿行于动脉内膜，将沉积在动脉内膜里面的胆固醇带出血管壁，从而修复了血管内皮，恢复了血管的弹性，使内皮细胞发挥正常的舒缩血管、调控血压的功能。因此，调节或升高血浆HDL的水平，也是治疗原发性高血压的一个重要方向。本研究结果显示，天然降压素组大鼠HDL的基因表达明显上调，其含量明显升高，LDL的蓄积明显减少，和对照组比较，具有明显之差异，由此可见，天然降压素可准确地调控HDL的基因表达，提高HDL的水平，加速胆固醇的代谢，降低LDL堆积，减少氧化应激反应的发生，阻止内皮细胞功能障碍形成与发展，恢复内皮细胞舒张血管、调控血压的功能，使血压趋于平衡状态。参考文献1TaiMH，WangLL，WukL，et.al.Increasdsuperoxidanioninrostralventrolateralmedullacontributestohypertensioninspontaneouslyhypertensiveratsviainteractionswirhnitricoxide[J].FadicBiolMed，2005，38：450-462.2黎键.氧化应激在周围动脉硬化疾病发生过程中的作用[J]。中华老年医学杂志，2007，26：328.3LeeSY.CardiovasculareffectsofmyceliumextractofGanodermalucidum：Inhibitionofsympathelicoutflowasamechanismofitshypotensiveaction[J].ChemPharmBull，1990，38：1395.4StoyanovoII，LazarovNE.LocaliztionofintricoxidesynthaseinrattrigeminalprimaryafferentneuronsusingNATPH-diaphorasehistochmistry[J]MolHistol，2005，36(3)：187.5BrittenMBZeiherAM，SchahingerV.Chinicalimportanceofcoronaryendothelialvasodilatordysfunctionandtherapeuticoptions[J].InternMed，1999，245：315-327.6PantoniL，Arteriosclerosis，thrombosis，andvascular[J].Biology，1998，18：503-513.7BorutaiteV，MorkunieneR，BrownGC.Nitricoxidedonors，nitrothils，andmitochondrialrespirationinhibitorainducecaspaseactivationbydifferentmechanisms[J].FebsLett，2000，467(2-3)：155-159.8LabreucheJ，TouboulPJ，AmarencoP.Plasmatriglyceridelevelsandriskofstrokeandcarotidatherosclerosis：asystematicreviewoftheepidemiologicalstudies[J].Atherosclerosis，2009，203：331-345/天然降压素疗效的临床研究原发性高血压病，和动脉硬化密切相关，是世界医学领域中的十大难题之一。世界卫生组织统计数字显示，该病的发病率正逐年递增，人类成年之后的人群中，已有三分之一的人群，患有原发性高血压。高血压的发病率不仅很高，而且，该病的致死致残率也分厂惊人，是中风和心脏病死亡人数的一半。因此，高血压已成为危害人类健康的严重问题。西医药治疗高血压往往需要联合用药才能达到降压效果。而药物的不良反应，反而导致该症的病机逐日加重。因此，应用中医中药防治高血压，则显得十分必要。为此，本研究总结多年的临床经验，自拟出二龙一虎降压方，并经超临界流体萃取技术，制成降压素颗粒剂，经临床辨证治疗原发性高血压患者数百例，均取得突出独到的疗效，具体研究方法和结果如下。1、临床资料1.1一般资料200例原发性高血压病人来自2009年6月——2012年5月本院门诊，采用Dool’s临床病例随机表，将病人随机分成两组，治疗组100例，共中男性70例，女性30例，年龄27——71岁，平均年龄(51.3±10.5)，病程1-25年，平均病程(11.6±4.5)年。平均血压168.3±12.5/93.6±8.9mmHg(1mmHg＝0.133kpa)。对照组100例患者，男性60例，女性40例，年龄28-68岁，平均(58.2±10.6)岁。病程1-28年，平均病程(10.6±6.5)，平均血压(158.8±13.6)(93.6±8.8)mmHg，，上两组患者的基线资料比较，差异性无统计学意义(p＞0.05)，具有可比性。1.2诊断标准西医学诊断标准采用《中国高血压防治指南》[1]标准，即成人收缩压(SBP)≥140Hg，舒张压(DBP)≥90mmHg。中医学诊断标准，依据《中药新药临床指导原则》[2]中的肝阳上亢、阴虚阳亢型之诊断标准。1.3纳入标准①符合原发性高血压的西医学诊断标准。②符合中医学肝阳上亢、阴虚阳亢的辨证标准。③高血压患者之年龄在27-71岁。④取得各患者的知情同意，同时具备以上4项条件者方可纳入试验。1.4排登记标准①SBP＞225mmHg和DBP＞125mmHg的原发性高血压患者。②继发性高血压患者③妊娠或哺乳期女性。④合并有脑出血、左心衰、肾功能衰竭及其他心、脑、肝和造血系统等严重原发性病病者。⑤精神病患者、过敏体质及不能停用其他降压药物者。⑥未按规定服药，无法判定疗效或资料不全等影响疗效和安全性判断者。2.研究方法2.1治疗方法治疗组：服用天然降压素，天然降压素分为肝阳上亢和阴虚阳亢二种。①肝阳上亢型之处方：天麻6g、龙骨15g、石决明15g、玄参6g、白芍6g、菊花6g、龙胆草3g、黄芩6g、生地6g、柴胡6g、当归6g、丹参6g、茯苓6g、甘草3g。②阴虚阳亢型之处方：天麻6g、龙骨15g、玄参6g、白芍6g、菊花6g、醋龟板10g、枸杞子6g、制何首乌10g、黄精10g、牛膝6g、红花3g、熟地6g、甘草3g。以上药物均以水浸醇沉技术提取制成丸剂，每次服3g，每日服2次。各型患者各报各型用药。对照组：服用山西津华晕星制药有限公司生产的卡托普利片，每片25mg，每日每人服3次。两组患者各连续治疗6周，观察疗效。治疗期间均以低盐、低脂饮食，停用其他降压、降脂和影响血压的药物。治疗期间如出现其他严重病变者，须退出试验治疗。2.2观察指标和方法①血压的测定：使用票人汞柱的血压计，坐位测量血压3次，取平均值记录结果，每周至少测量3次。②临床症状改善情况：包括脑晕、头痛、急燥易怒、腰酸腿软、五心烦热、心悸、失眠、多梦、面红目赤、口干舌燥、耳鸣、健忘、便秘、溲赤。③治疗前后分别检查血液和大小便常规，以及肝肾功能、血脂和心电图。2.3疗效标准2.3.1降压疗效判定标准依据《中药新药临床研究指导原则试行》[2]中的血压疗效判定标准评定结果。显效：DBP下降10mmHg以上，并达到正常血压范围，或者DBP虽未降至正常范围，但血压已下降20mmHg或以上者。有效：治疗后DBP下降虽然未达10mmHg，但是已达到还范围，或DBP较治疗前下降10-19mmHg，但未达到正常血压范围，或SBP较治疗前下降30mmHg以下，须具各其中1项标准。无效：治疗后血压未达到以上疗效标准。2.3.2单项症状疗效判定标准显效：治疗后，原有症状完全消失或者显著减轻。有效：治疗后，原有症状有所好转或者有所减轻。无效：治疗后，原有症状未见改善。2.4统计学方法本研究应用SPSS16.0软件包，进行数据统计分析。计数资料使用X2检验，计量资料采用七检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.1两组症状疗效比较除了耳鸣、健忘症状组间差异无统计学意义外(P＞0.05)，其余症状组间差异均有统计学意义(P＜0.05)，治疗组症状改善优于对照组，结果见表1表1两组原发性高血压患者症状疗效比较(例)注：和对照组比较，*P＜0.053.2两组原发性高血压患者治疗后降压疗效的比较，见表2。表22组原发性高血压患者降压疗效的比较(例)注：两组比较，P＜0.05。3.3两组原发性高血压患者治疗前后血压的变化比较，见表3表3两组原发性高血压患者治疗前后血压变化比较(例)组别时间例数SBPDBP治疗组治前100161.1±13.596.3±9.6治后100117.3±6.8※Δ78.2±2.8※Δ对照组治前100162.2±14.695.1±9.6治后100143.5±4.9※88.6±2.3※注：和本组治前比较，※P＜0.05；和对照组治后比较，ΔP＜0.053.4两组原发性高血压患者治疗前后心率的变化比较治疗组平均心率治疗前(78.3±12.5)次/min，治疗后的心率是(76.1±12.6)次/min；对照组治疗前(78.1±11.8)次/min，(76.4±13.3)次/min。两组治疗前后及组间比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)3.5两组原发性高血压治疗前后血脂的变化比较治疗后，治疗组总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，均有显著改善，P＜0.05，而对照组仅是TG1项有显著改善，P＜0.05。详细数据见表4。表42组原发性高血压病人治疗前后血脂变化比较(例)注：和本组治疗前比较。※P＜0.05；和对照组治后比较，ΔP＜0.053.6不良反应治疗组患者无主观之不适。治疗前后两组患者的血、尿、肝功能、肾功能、心电图检查均未见异常变化(P＞0.05)。4、讨论本研究发现，原发性高血压早期多为肝火上炎、肝阳偏亢，中期之后，逐渐发展为肝肾阴虚，出现阴虚阳亢为主的症候。一般而言，肝阳上亢型的患者，年龄较轻，病程较短，而阴虚阳亢型的病人，年龄较大，病程较长，在发病过程中往往虚实夹杂，而且许多原发性高血压患者，常伴有脂质代谢紊乱[4]。然而，天然降压素主要以天麻、龙骨、菊花等，以平肝潜阳；以夏枯草、茯苓、生地等，而清肝泻火；以枸杞子、鹿茸、西红花等，以滋补肝肾。根据证型组合，分别治疗肝阳上亢和阴虚阳亢两大类型之原发性高血压。方中之天麻，性味甘平，具有平肝熄风之功。而钩藤性味甘凉，也具有清热熄风之功。方中之夏枯草性味成寒，具有清肝泻火、平肝熄风之功效，三者合为君药，和其它诸药并用，共奏平肝潜阳、滋阴降火、调和气血、燮理阴阳之效。现代药理研究表明，钩藤、天麻、菊花、茯苓、远志、夏枯草、何首乌等，均具有明显的降压作用，何首乌、枸杞子、菊花等，还具有抗氧化、降血脂之功用，又有保护内皮细胞的作用[5-6]。本研究结果表明，天然降压素具有显著地降压作用，并能有效地改善和消除原发性高血压的临床症状，同时还具有独到的降血压、升高高密度脂蛋白，和重要的保护和修复血管内皮细之功能。5、参考文献1、中国高血压防治指南修订委员会、中国高血压防治指南(修订版)[M]，北京，人民卫生出版社，2005。2、郑筱黄中药新药临床研究指导原则(试行)[S]。北京：中国医药科技出版社，2002：73-773、唐仕欢，杨洪军、黄璐琦等，中医临床处方饮片用量调研报告(内科)[J]，中国中药杂志，20083，33(19)：2257-2263。当前第1页1 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