一种铁皮石斛总黄酮提取方法与流程

本发明涉及天然药物的超声提取，是一种铁皮石斛总黄酮提取方法。

背景技术：

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura etMigo)是兰科石斛属多年生附生草本植物，以新鲜或者干燥茎入药，属补虚药中的补阴药，主要分布于中国广西、云南、安徽、浙江、福建等地。其性味甘，微寒，归胃、肾经，具有益胃生津，滋阴清热的功效。用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少于呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。此外，现代药理研究表示，铁皮石斛具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降低血糖、调节机体免疫力等作用、对慢性胃炎、糖尿病、久病体弱导致的免疫功能低下、眼科保健及恶性肿瘤的辅助治疗等方面都有广泛应用。

根据发明人对现有技术的了解，至今未公开与铁皮石斛总黄酮的提取工艺且包括颗粒半径、料液比、乙醇浓度、提取时间相关的有关文献报道。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足之处做出了改进，提供了一种合理、高效的铁皮石斛总黄酮提取方法，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明公开了一种铁皮石斛总黄酮提取方法，包括如下步骤：

1)将铁皮石斛药材粉碎成粉末过筛；

2)将药材粉末置于锥形瓶中，加入乙醇，用超声提取法提取一定时间；

3)过滤并用乙醇洗涤滤渣；

4)合并滤液和洗涤液，用乙醇定容后，得到含黄酮的溶液；

5)显色后测定吸光度，代入回归方程，计算黄酮含量。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤2)所述药材粉末颗粒半径20～80目，料液比(g/ml)1:10～30，乙醇浓度60％～100％，提取时间20～60min。

作为进一步地改进，本发明所述的步骤2)所述药材粉末颗粒半径50目，料液比(g/ml)1:20，乙醇浓度90％，提取时间40min。

本发明的有益效果在于：

通过单因素实验和正交实验筛选出最佳的颗粒半径、料液比、乙醇浓度、提取时间，采用三氯化铝比色法测定黄酮含量。该工艺采用的超声提取法快捷、节能，且能达到较高的提取率，适合铁皮石斛的总黄酮提取，为天然药物的开发应用提供了理论参考和实验指导，其最佳提取方案如下：颗粒半径50目，料液比1:20，乙醇浓度90％，提取时间40min。

附图说明

附图1为NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH显色法测定芦丁曲线图；

附图2为AlCl₃显色法测定芦丁曲线图；

附图3为最佳波长确定时绘制的芦丁标准曲线图；

附图4为不同pH缓冲液(左：pH＝5.2，右：pH＝4.3)对芦丁测定的影响曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，结合说明书附图对本发明的技术方案作进一步地说明：

铁皮石斛总黄酮提取工艺

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

759紫外-可见光分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；精密PH计；KQ5200B超声波清洗器；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱。芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)，三氯化铝，醋酸钠，冰醋酸，乙醇均为分析纯，水为蒸馏水。

1.2 显色试剂的配置

精密称取AlCl₃6.70g，乙醇定容至500ml，配成0.1mol/L的溶液。精密称取无水乙酸钠5.44g，乙醇定容至200ml，配成0.2mol/L的溶液。精密量取2.30ml冰醋酸，用蒸馏水稀释至200ml配成0.2mol/L的醋酸溶液[5-7]。将醋酸钠溶液和冰醋酸溶液配成pH值为5.2的缓冲溶液。

1.3 药材

由浙江铁枫堂科技股份有限公司提供，产品批号140712。并由浙江中医药大学中药研究所鉴定。

2 方法与结果

2.1 黄酮的测定方法

铁皮石斛黄酮的测定仪芦丁为对照品，分别采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法和AlCl₃显色法，实验结果见图1及图2，表明采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法时，显色结果并不好，供试品和标准品的最大吸收波长不一致；而采用AlCl₃显色法时，供试品与标准品的最大吸收波长基本一致，所以本次实验选择AlCl₃显色法。

2.2 标准溶液的制备

精密称取芦丁标准品(120℃烘干至恒重)20.0mg，80％乙醇定容至100ml，配成0.2mg/ml的芦丁标准液。

2.3 待测样品溶液的制备

将粉碎后的铁皮石斛粉末在鼓风干燥箱中烘干，精密称取1g置于100ml锥形瓶中，按设定好的条件进行超声提取(提取前称重，提取后用无水乙醇补足重量)，提取液滤过后，转移至50ml容量瓶中，用相应浓度乙醇定容。

2.4 波长选择

精密量取1ml芦丁标准溶液，置于25ml具塞试管中，加入2ml0.1mol/l的AlCl₃溶液，在加入1ml pH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液，静置10min，在200-600nm范围扫描，芦丁在402nm处有最大吸收，空白无干扰。

精密量取1ml待测的铁皮石斛溶液，置于25ml具塞试管中，加入2ml0.1mol/l的AlCl₃溶液，在加入1ml pH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液，静置10min，在200-600nm范围扫描，待测溶液在402nm处有也最大吸收，因此，选择402nm作为测定波长

2.5 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7ml分别置于25ml具塞试管中，加80％乙醇稀释至2ml，摇匀。加入2ml0.1mol/l的AlCl₃溶液，在加入1ml pH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液，静置10min，在402nm处测定吸光度值。

以芦丁的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作图得到标准曲线(见图3及图4)，其回归方程为y＝4.1986x+0.0377，相关系数R＝0.9998，图3表明芦丁在40～140μg范围内，含量与吸光度呈良好的线性关系。图4结果表明缓冲液的pH对实验的结果影响非常大，以pH＝5.2时较为适宜，且缓冲液的加入顺序几乎对实验结果无影响。

2.6 铁皮石斛黄酮提取过程中的单因素影响研究

2.6.1 料液比对铁皮石斛黄酮得率的影响

在恒定颗粒大小为80目、提取时间为40min，乙醇浓度为80％的条件下。分别设料液比为1：10、1：15、1：20、1：25、1：30进行提取，按“2.5项下方法操作”，测定含量，并计算铁皮石斛黄酮得率得率。在上述条件下，每份平行2次，结果取2次测定的平均值。由表2-1可以看出，提取率先随料液比的增加而增加，然后逐渐趋于平缓。这是因为料液比小，则溶剂量少，所以两相界面的浓度差小，不利于黄酮的扩散。当料液比为1：30时黄酮提取率最高，但与1：25相比仅提高了0.001％，说明1：25的料液比较为适宜。

表2-1 料液比对铁皮石斛黄酮提取率的影响

2.6.2 乙醇浓度对铁皮石斛黄酮得率的影响

在恒定颗粒大小为80目，料液比为1:25，提取时间为40min的条件下，分别设乙醇浓度为60％、70％、80％、90％、100％进行提取，按“2.5项下方法操作”，测定含量，并计算铁皮石斛黄酮得率得率。在上述条件下，每份平行2次，结果取2次测定的平均值。由表2-2可知，随着乙醇浓度的提高，铁皮石斛黄酮的提取率先增大后减小。这算因为乙醇对黄酮的溶解度比水大，乙醇对细胞的破坏作用比水强，特别是在超声的作用下更明显。

表2-2 乙醇浓度对铁皮石斛黄酮提取率的影响

2.6.3 提取时间对铁皮石斛黄酮得率的影响

在恒定颗粒大小为80目，料液比为1:25，浸提乙醇浓度为80％的条件下，分别设提取时间为20min、30min、40min、50min、60min进行提取，按“2.5项下方法操作”，测定含量，并计算铁皮石斛黄酮得率得率。在上述条件下，每份平行2次，结果取2次测定的平均值。由表2-3可知随着超声作用时间的增加铁皮石斛黄酮提取率逐渐增加，但超过40min后，趋于稳定。

表2-3 提取时间对铁皮石斛黄酮提取率的影响

2.6.4 颗粒半径对铁皮石斛黄酮得率的影响

在恒定料液比为1:25，提取时间为40min，乙醇浓度为80％的条件下。分别设粉碎程度为20目、40目、60目、80目进行提取，按“2.5项下方法操作”，测定含量，并计算铁皮石斛黄酮得率得率。在上述条件下，每份平行2次，结果取2次测定的平均值。由表2-4可知，随着颗粒半径的减小，铁皮石斛黄酮提取率先增大后减小。这可能是因为粉碎过度，导致黄酮被多糖等包裹不易溶出。

表2-4 颗粒半径对铁皮石斛黄酮提取率的影响

表2-5 提取工艺因素水平

2.7 正交实验设计[8-13]

在上述单因素实验的基础上，进行L9(34)4因素三水平正交实验，选用因素及水平见表2-5，正交实验结果见表2-6，方差分析结果见表2-7

由正交实验极差分析可知，影响因素最重要的是乙醇浓度，其次是颗粒半径，再次是提取时间，最后是料液比。由方差分析在实验设计的范围内，因素B和D的水平1和2对铁皮石斛黄酮提取率影响不大，考虑大生产的需要，料液比增大会增加生产成本，时间增加会延长生产周期，因此最佳条件应为A2B1C3D1，即颗粒半径40目，料液比1:20，乙醇浓度90％，提取时间40min。

表2-6 正交实验结果

表2-7 方差分析

2.8 最佳提取工艺的验证

在最佳工艺条件下进行验证实验，该条件下测得黄酮提取率为0.245％，RSD＝2.1％。结果表明该工艺稳定可行。

2.9 精密度实验

精密量取供试品溶液6份，按“2.5”项下操作，结果见表2-7。吸光度的RSD＝0.30％，说明该法精密度良好。

表2-8 精密度实验结果

表2-9 稳定性实验结果

2.10 稳定性实验

精密量取供试品溶液，按“2.5”项下操作，每隔十分钟测一次吸光度值。结果见表2-8。实验结果表明，在室温条件下，供试品在40min内基本保持稳定。

2.11 重复性实验

精密量取供试品溶液6份，按“2.5”项下操作，在相同条件下测定并计算总黄酮的含量，结果见表2-9。RSD＝1.33％，重复性好。

表2-10 重复性实验结果

2.12 回收率实验

精密量取已知黄酮含量供试品2ml，平行6份，精密加入0.5ml芦丁标准溶液。按“2.5”项下操作，根据测定值计算回收率，结果见表2-10。平均回收率为99.8％。

表2-11 回收率实验结果

3 结论

本发实验通过单因素实验和正交实验对铁皮石斛总黄酮提取工艺进行了优化，确定最佳提取工艺为：颗粒半径50目，料液比1:20，乙醇浓度90％，提取时间40min。该工艺简单可行，为铁皮石斛药材的合理、高效的利用提供了理论参考和实验指导。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。