一种荞麦总黄酮的提取方法与流程

本发明涉及一种荞麦总黄酮的提取方法，属于医药领域。

背景技术：

荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)属于蓼科荞麦属双子叶一年生作物。生产上栽培的主要有两种,即甜荞麦(F.esculentumMoench)和苦荞麦(F.esculentum(L.)Gaerth)。现代医学研究表明，荞麦具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多方面的药理作用，营养、保健及药用价值较高。随着人们生活水平的提高，荞麦食品、药品等制品正日益受到人们的青睐。

荞麦不仅含有丰富的蛋白质、碳水化合物、不饱和脂肪酸及维生素，还含有丰富的生物活性成分—芦丁、山奈酚和槲皮素等黄酮类化合物。许多研究已表明黄酮类化合物具有多种生物活性，除有抗菌、消炎、降压等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有显著效果。由于黄酮类化合物具有如此广泛的生物活性，使得对它的研究、开发及利用引起了越来越多的关注。为更好地利用荞麦资源，亟需提供一种能够有效提取其中黄酮类物质的方法。

传统的荞麦黄酮的提取方法主要为乙醇浸提法、超声波法、纤维素酶法等。这些方法虽然都可以将黄酮类成分从荞麦中提出，但存在各种缺陷，比如，有机溶剂的大量使用使得溶剂残留难以避免，操作复杂、对设备要求较高，导致生产成本增加等等，极大限制了这类提取技术在工业上的应用。

10、双水相体系一般由两种聚合物、聚合物和盐、离子液体和盐、小分子亲水有机溶剂和盐组成。当两种成相物质在水中充分溶解后，在分子间相互排斥力和空间阻碍作用的影响下，经过一段时间平衡，形成互不渗透的两相体系。双水相提取的原理与常规的液/液溶剂萃取原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但其较常规的液/液溶剂萃取方式有明显优势：1、操作条件温和，体系含水量高(一般为75％～90％)，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；2、一般不存在有机溶剂的残留问题；3、易于连续化操作，设备简单，无需进行特殊处理，适于工业化生产。然而，采用双水相技术提取植物中的有效成分并非易事，往往需要根据待提取物质的理化性质进行大量实验研究才能确定较为适宜的提取条件，从而得到较高的提取率；尤其是成相物质的选择尤为重要，通常对目标物质在双水相系统的分配行为具有显著影响。

因此，提供一种能够从荞麦中有效提取总黄酮的双水相提取工艺，成为了一个亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种荞麦总黄酮的提取方法。

本发明提供了一种荞麦总黄酮的提取方法，包括如下步骤：取荞麦籽粒，粉碎，脱脂，采用丙醇-硫酸铵双水相体系进行提取，静置分层，取上清液，即得。

进一步的，所述提取条件为：丙醇与水的体积比为3:10～9:10，硫酸铵浓度为0.27～0.45g/ml，料液比为1:10～1:40，提取时间为15～45min，提取温度为30～60℃。

优选的，所述提取条件为：丙醇与水的体积比为8:10，硫酸铵浓度为0.39～0.42g/ml，料液比为1:20～1:25，提取时间为25～30min，提取温度为50～55℃。

进一步优选的，所述提取条件为：丙醇与水的体积比为8:10，硫酸氨浓度为0.39g/ml，料液比为1:20，提取时间为30min，提取温度为55℃。

进一步的，采用超声波辅助丙醇-硫酸铵双水相体系进行提取，超声功率为250W。

进一步的，所述的荞麦为甜荞。

进一步的，所述的脱脂方法为：取荞麦粉，加入石油醚，超声波提取，过滤，收集滤渣，即得。

进一步的，加入料液比为1：10的石油醚，于30℃～60℃超声波提取30min，超声功率为250W。

本发明提供了一种根据所述提取方法制备得到的荞麦总黄酮。

本发明提供了一种荞麦总黄酮的提取方法，具有以下有益效果：

1、本发明采用双水相提取技术提取荞麦中的黄酮类物质，并确定双水相系统的成相物质为丙醇-硫酸铵，相较于传统的双水相体系中使用聚合物作为成相物质，本发明具有成本低、操作简便、易于后续处理等优点。

2、本发明提供了双水相提取荞麦黄酮的具体条件参数，可得到高于0.3％的提取率，最高提取率可达到0.57％。

3、本发明进一步采用超声波辅助双水相进行提取，利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速植物细胞内黄酮类物质的释放、扩散和溶解，从而提高提取效率，缩短提取时间，节约溶剂，并且避免了高温对黄酮类化合物的破坏。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为芦丁标准曲线图；

图2为醇水比对提取得率的影响图；

图3为硫酸铵浓度对提取得率的影响图；

图4为料液比对提取得率的影响图；

图5为提取时间对提取得率的影响图；

图6为提取温度对提取得率的影响图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

1、实验原料

甜荞麦籽粒(原粮产地：辽宁朝阳；中粮米业(磐石)有限公司生产，金盈牌)

预处理：将甜荞麦粉碎后，过100目筛制成荞麦粉备用。

2、主要药品试剂

芦丁标准品(天津西玛科技)；石油醚(沸程：60-90℃)；丙醇、三氯化铝、乙酸钾、甲醇、无水乙醇、硫酸铵等。

3、主要仪器设备

UV-1200型紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；粉碎机；SB-5200DTDN超声清洗器(超声功率250W)；JA1203电子分析天平：上海越平科技仪器有限公司；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂等。

实施例1本发明荞麦总黄酮的提取方法

称取2.00g荞麦粉于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超声波提取30min，超声功率250W，除去脂溶性成分，过滤，滤渣于室温挥发干燥除去其中残余的石油醚。按照1:20料液比(m/v)，加入醇水比(v/v)为8:10，硫酸铵浓度为0.39g/ml配制的双水相溶液，设置超声提取温度55℃，超声提取30min，超声功率250W。于分液漏斗中静置分层后，取上清液，即得。总黄酮得率为0.57％。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

总黄酮的含量测定方法

根据NY/T1295-2007《荞麦及其制品中总黄酮含量的测定》的方法测定总黄酮的含量。

首先，配制0.1mol/L三氯化铝、0.1mol/L乙酸钾溶液、甲醇水溶液(7+3)，然后，称取芦丁标准品0.0573g于烧杯中，用甲醇溶解，移至1000mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得0.0500mg/mL的芦丁标准溶液。芦丁标准曲线绘制：用移液管分别准确吸取0.25、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0mL芦丁标准溶液置于10mL容量瓶中，分别加入0.1mol/L三氯化铝2mL、0.1mol/L乙酸钾溶液3mL，加入甲醇溶液定容至刻度，摇晃均匀，室温下放置30min。同时作空白。标准曲线中芦丁含量分别为0.00125mg/mL、0.00250mg/mL、0.00500mg/mL、0.0100mg/mL、0.0150mg/mL、0.0200mg/mL。在420nm波长处测定吸光度。以为芦丁标准溶液浓度横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图1。

总黄酮含量测定：精确量取荞麦总黄酮待测液1.0mL于10mL容量瓶，加入0.1mol/L三氯化铝2mL、0.1mol/L乙酸钾溶液3mL，加入甲醇溶液定容至刻度，摇匀，室温下放置30min。然后于420nm波长处测定吸光度，将得到的吸光度，代入芦丁标准曲线的回归方程，计算总黄酮的浓度和总黄酮质量。总黄酮得率＝荞麦中总黄酮质量/荞麦的质量×100％。

实验例1醇水比对提取得率的影响

称取2.00g荞麦粉于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超声波提取30min，超声功率为250W，除去脂溶性成分，过滤，滤渣于室温挥发干燥除去其中残余的石油醚。按照1：25料液比(m/v)，分别加入醇水比(v/v)为3:10、4:10、5:10、6:10、7:10、8:10、9:10，浓度为0.35g/ml的硫酸铵配制的双水相溶液(丙醇-硫酸铵双水相体系根据参考文献制备：1、马宏飞,韩秋菊,李薇.丙醇-硫酸铵双水相体系及应用探讨[J].氨基酸和生物资源.2011,33(4):67-69；2、高云涛,吴立生,王伟.丙醇-硫酸铵-水液-液体系萃取分离铂、钯、铑和金[J].分析化学.2001,29(8):901-903)，设置超声提取温度60℃，超声提取25min，超声功率250W。于分液漏斗中静置分层后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，该溶液为总黄酮待测液，测定总黄酮含量，结果见图2。

实验结果：随着醇水比增加总黄酮的提取得率先增加后减小。随着醇水比增加，丙醇浓度增大，使提取剂对物料的渗透能力增强，提高了总黄酮的溶解度，到醇水比(v/v)为7:10时所得提取率最高；但是醇水比继续增大，会影响双水相的两相分配，总黄酮溶解度降低，提取得率下降。

实验例2硫酸铵浓度对提取得率的影响

称取2.00g荞麦粉于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超声波提取30min，超声功率为250W，除去脂溶性成分，过滤，滤渣于室温挥发干燥除去其中残余的石油醚。按照1:25料液比(m/v)，分别加入醇水比(v/v)为6:10，硫酸铵浓度为0.27、0.30、0.33、0.36、0.39、0.42、0.45g/ml配制的双水相溶液，设置超声提取温度60℃，超声提取25min，超声功率250W。于分液漏斗中静置分层后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，该溶液为总黄酮待测液，测定总黄酮含量，结果见图3。

实验结果：随着硫酸铵浓度的增加，总黄酮的提取得率先增加后减小。由于硫酸铵浓度增加，双水相越趋于稳定，到硫酸铵浓度为0.4g/ml时双水相最稳定，提取得率最高；但是随着硫酸铵浓度继续增加吸走大量水分，使得上相即有机相的水分减少，一些水溶性的黄酮类化合物溶解度减小，提取得率随之降低。

实验例3料液比对提取得率的影响

称取2.00g荞麦粉于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超声波提取30min，超声功率为250W，除去脂溶性成分，过滤，滤渣于室温挥发干燥除去其中残余的石油醚。分别按照1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40料液比(m/v)，加入醇水比(v/v)为6:10，浓度为0.35g/ml的硫酸铵配制的双水相溶液，在超声提取温度60℃，超声提取25min，超声功率250W。于分液漏斗中静置分层后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，该溶液为总黄酮待测液，测定总黄酮含量，结果见图4。

实验结果：随着料液比的增加，总黄酮提取率先增加，到达1:30左右时达到最大，然后开始下降。料液比小，黄酮类化合物溶解于溶剂的速度慢；料液比太大，溶剂用量增多，相对地硫酸铵盐的用量增多，影响双水相的稳定，使得黄酮提取得率减少。

实验例4提取时间对提取得率的影响

称取2.00g荞麦粉于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超声波提取30min，超声功率为250W，除去脂溶性成分，过滤，滤渣于室温挥发干燥除去其中残余的石油醚。按照1：25料液比(m/v)，加入醇水比(v/v)为6：10，浓度为0.35g/ml的硫酸铵配制的双水相溶液，在超声提取温度60℃，超声功率250W的条件下，分别超声提取15、20、25、30、35、40、45min。于分液漏斗中静置分层后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，该溶液为总黄酮待测液，测定总黄酮含量，结果见图5。

实验结果：提取时间增加提取得率增大，提取时间为30min时，提取得率达到最大，之后随着提取的时间增加，会使得黄酮类化合物被氧化分解，所以提取得率开始下降。

实验例5提取温度对提取得率的影响

称取2.00g荞麦粉于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超声波提取30min，超声功率为250W，除去脂溶性成分，过滤，滤渣于室温挥发干燥除去其中残余的石油醚。按照1:25料液比(m/v)，加入醇水比(v/v)为6:10，浓度为0.35g/ml的硫酸铵配制的双水相溶液，在超声提取温度分别为30、35、40、45、50、55、60℃的条件下，超声提取25min，超声功率250W。于分液漏斗中静置分层后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，该溶液为总黄酮待测液，得到总黄酮待测液，测定总黄酮含量，结果见图6。

实验结果：总黄酮提取得率随温度升高而增大，因为黄酮类化合物在丙醇中溶解度随温度增加而增加，温度增加，黄酮类化合物扩散系数增加，使得提取得率也随之增大；但是当温度增加到50℃以后，提取得率便开始下降，主要是因为在较高温度下黄酮类化合物会发生氧化分解等反应而被破坏。

实验例6采用不同提取条件总黄酮提取率的比较

共分为16个试验组，每组称取2.00g荞麦粉于100ml具塞锥形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超声波提取30min，超声功率为250W，除去脂溶性成分，过滤，滤渣于室温挥发干燥除去其中残余的石油醚。其余各步骤条件参数分别如表1所示。

表1采用不同提取条件总黄酮提取率的比较

实验结果：采用本发明提取条件可使荞麦总黄酮的提取得率达到0.3％以上；其中，试验组11及12荞麦总黄酮的提取得率在0.5％以上，较其它试验组得率显著提高，表明在丙醇与水的体积比为8:10，硫酸铵浓度为0.39～0.42g/ml，料液比为1:20～1:25，提取时间为25～30min，提取温度为50～55℃的提取条件下，即可达到较高的提取率；在上述所有试验组中，试验组11荞麦总黄酮的提取得率最高，可达到0.57％，表明本发明最佳提取条件为：醇水比为8:10、硫酸铵浓度为0.39g/ml、料液比为1:20、提取时间为30min、提取温度为55℃。

实验例7本发明提取工艺的验证试验

取同一批荞麦，采用根据实验例6所述最佳提取条件(即试验组11的提取条件)进行总黄酮的提取，重复3次，总黄酮提取得率分别为0.53％、0.57％、0.59％，平均为0.56％，RSD0.03％。

上述结果表明本发明提取工艺重复性、稳定性高，适于工业化生产。